人SCF融合蛋白在大肠杆菌中表达

干细胞因子(SCF)是一种与造血细胞、生殖细胞和色素细胞生长发育相关的细胞因子。本研究利用pEX31B载体,在大肠杆菌中成功地表达出重组人SCF融合蛋白。该融合蛋白以包涵体形式存在,约占菌体蛋白的20％,经制备电泳纯化,纯度达90％以上,为制备人SCF单克隆抗体奠定了基础。     

人ICA69基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达与应用初探

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中表达国人胰岛细胞自身抗原69kd蛋白（hICA69)，获得足量的、可供实验研究的ICA69抗原，用于I型糖尿病的早期诊断和联合筛查。方法：用PCR法扩增出编码hICA69的cDNA片段，直接克降到pSPORT1质粒上，经DNA序列测定后，再插入到GST融合蛋白表达载体pGEX-2T的EcoRI和SmaI位点之间，构成重组质粒p25-hICA69,将此质粒导入大肠杆菌，经IPIG诱导后获得GST-hICA69融合蛋白的表达产物，用间接ELISA法检测100例正常人和30例I型糖尿病人血清中抗ICA69抗体。结果：所获PCR产物经序列分析确证为1449bp，编码483个氨基酸，并正确地重组到pGEX-2T表达型质粒中，其在原核细胞中表达的融合蛋白具有免疫原性，并能应用于I型糖尿病病人血清中抗ICA69抗体的检测。结论：运用基因工程技术获得的表达产物的重组ICA69抗原。这一抗原的获得，将有助于提高I型糖尿病的预报率和确诊率。     

狗钠-钙交换体基因在大肠杆菌中的克隆和表达

[目的]在大肠杆菌中表达NCX cDNA从418到996位核苷酸之间的片段。[方法]用RT-PCR方法从狗脑组织中扩增得到NCX cDNA片段,将其用载体pGEM-T Easy克隆和亚克隆,DNA序列分析正确后再插入融合表达载体pET-28b( )中,构建原核表达菌株并诱导表达。[结果]含重组表达载体的E．coli BL21(DE3)经IPTG诱导,15％SDS-PAGE呈现一约26kD的特异表达带。[结论]表达了含目的片段的融合蛋白,为抗NCX抗体制备及其对于NCX功能影响的研究提供了条件。     

弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 体外扩增弓形虫RH株膜表面抗原SAG1编码基因，构建原核表达质粒，并表达SAG1编码基因序列。方法 收集、纯化RH株速殖子，提取RNA，据已知的SAG1基因序列，在设计合成的1对引物中引入EcoRI和HindⅢ酶切位点。应用RT—PCR技术，扩增SAG1基因片段，插入原核表达质粒pET28a中，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，重组子经EcoRI和HindⅢ双酶切、PCR鉴定，转化宿主菌BL21，并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株RNA中扩增出1011bp的SAG1基因片段，构建重组质粒pET28a／SAG1，酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符；IPTG诱导，SDS—PAGE显示表达产物的大小约34．8kD．结论 成功地从弓形虫RH株RNA中获取SAG1基因，构建了pET28a／SAG1重组质粒并获得了高效表达，为免疫学诊断和蛋白质疫苗的研究创造了条件。     

人TRF1^242—388在大肠杆菌中的克隆及表达

人端粒重复序列结合因子（ＴＲＦ１）是一种端粒重复序列结合蛋白,含４３９个氨基酸,相对分子质量约为６０×１０３,该蛋白的氨基端为酸性区,是与ＤＮＡ结合的功能区,称Ｍｙｂ区。蛋白质的中间约包含２００个氨基酸,比较保守,称ＴＲＦ特异保守区。我们克隆并表达了ＴＲＦ１的第２４２３８８个氨基酸,旨在制备ＴＲＦ１特异性抗体,以进一步应用于ＴＲＦ１作用机制和ＴＲＦ１与血液系统恶性肿瘤的相互关系研究。材料和方法１　质粒与菌株　ｐＣＲⅡＴＯＰＯＴＲＦ１重组质粒为本研究所黄河博士在德国基尔大学血液病理研究所构建…     

大鼠PDGF-C基因全长及结构域编码蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌宿主系统中表达血小板衍生生长因子C（PDGFC）基因全长编码的蛋白以及两个结构域编码的蛋白。方法：用PCR方法从已构建好的质粒中扩增出大鼠PDGF-C cDNA开放阅读框架片段（ORF—PDGF—C，1035bp），以及位于N端的CUB结构域（CUD-PDGF-C，333bp）和位于C端的生长因子结构域（GFD-PDGF—C，348bp），并重组入表达载体pET-24a中，转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG诱导PDGF—C融合蛋白的表达，经DS-PAGE，表达蛋白采用Western—blot用抗His和抗-PDGF—C的抗体分别验证融合蛋白表达。结果：PCR扩增的PDGFC基因序列与GenBank数据库中的序列一致；37℃，0．1mmol·L^-1IPTG诱导6h，pET-24a-ORFPDGF-C，pET-24a-CUB-PDGF-C，pET-24a-GFD-PDGF-C融合蛋白获得优化表达；Western-blot证实融合蛋白的特异性表达。结论：成功构建了pET-24a-ORF-PDGF-C，pET-24a-CUB-PDGF-C，pET-24a-GFD PDGF-C重组质粒，并在大肠杆菌中获得有效表达，这为进一步纯化该基因表达蛋白以及研究其结构与功能奠定了基础。     

cTnI-linker-TnC融合蛋白基因的构建、表达及鉴定

目的重组及表达人cTnI-linker-TnC融合蛋白。方法应用PCR技术从人心脏cDNA文库分别扩增出cTnI和TnC基因,通过引物设计在两者之间加上19个中性氨基酸残基TS-(G4S)3-AC的linker编码序列,克隆PCR产物,并构建pET28a-cTnI-linker-TnC表达质粒,转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白的表达,NTA树脂亲和层析纯化后检测其纯度和免疫反应性。结果成功构建了cTnI-linker-TnC融合蛋白的基因,并在大肠杆菌中实现可溶性高表达,在摇瓶中的表达量为21 mg/L,经一步NTA树脂亲和层析纯化,获得条带单一的目的蛋白,采用进口全自动免疫检测系统鉴定证实,目的蛋白有较高的免疫反应性。结论采用原核表达方法可以获得具有高纯度和高免疫反应活性的cTnI-linker-TnC融合蛋白。     

乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达

目的用基因工程的方法获得乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)编码区的基因片段,构建重组质粒并在大肠杆菌中表达抗原蛋白。方法用PCR法扩增HBcAg基因片段,构建含有HBcAg基因的克隆质粒及表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)plys中以IPTG诱导重组蛋白的表达,并用Western blot对重组蛋白进行检测。结果重组HBcAg在大肠杆菌中得到表达,Western blot检测显示在预期位置出现特异性条带。结论成功构建HBcAg原核表达系统并获得重组HBcAg,为该重组蛋白的相关功能研究奠定了基础。     

人心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)在大肠杆菌中的表达和纯化

目的获得重组人心肌型脂肪酸结合蛋白,为进一步开发应用奠定基础。方法根据已报道的心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因序列,采用RT-PCR的方法获得心肌型脂肪酸结合蛋白基因。将所得的PCR产物插入原核表达载体pQE30中,得重组质粒(pQE-H-FABP)并转化大肠杆菌(E.coli)M15,通过IPTG诱导表达出带有六个组氨酸的融合蛋白。经镍固定金属亲和层析纯化。结果序列分析表明:H-FABP基因成熟肽编码区含有396bp,编码132个氨基酸;与GenBank(NM004012)中已报道的H-FABP分离物的核苷酸序列有99·9%同源性。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的27%,分子质量约为15kDa并与商品化的H-FABP单抗(Clone6B6)呈特异性反应。经Ni 2-NTAagarose纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。结论在大肠杆菌中获得了人心肌型脂肪酸结合蛋白的高效表达,为研究其生物学功能和制备单克隆抗体奠定了基础。     

基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化

目的构建降钙素原（PCT）基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达,以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列,设计引物用标准的聚合酶链反应（PCR）法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段,应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a（＋）中,进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E．coli（DH5α）,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,用镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化获取蛋白,用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆,经酶切和核酸测序鉴定,得到正确的重组质粒pET-PCT,并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带;用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体,基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化,为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。     

血小板生成素突变体的克隆和扩增及其融合蛋白在大肠杆菌中高效表达的研究

目的：通过获得编码血小板生成素（Ｔｐｏ）成熟肽Ｎ端１～１９６个氨基酸的突变体ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＪＭ１０９中的表达，为Ｔｐｏ进一步的结构和功能研究提供材料来源。方法：用多聚酶链反应（ＰＣＲ）及ＤＮＡ重组技术，将ＰＣＲ产物克隆到ｐＵＣ１９载体并测序，然后克隆到表达载体ｐＭＡＬ－ｃ２上。结果：转化重组质粒ｐＭＡＬ－ＭＢＰ／ＴｐｏＭ的大肠杆菌经异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷诱导４～５小时，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示融合蛋白（ＭＢＰ／ＴｐｏＭ）的分子量约为６．３万。薄层扫描分析表明该蛋白占菌体总蛋白量的３７％。结论：经ＰＣＲ方法扩增的Ｔｐｏ基因突变体可在大肠杆菌中高效表达，为Ｔｐｏ突变体的进一步结构和功能研究以及Ｔｐｏ抗体的制备打下了基础。     

血小板生成素突变体的克隆和扩增及其融合蛋白在大肠杆菌中…

目的：通过获得编码血小板生成素成熟肽Ｎ端１￣１９６个氨基酸的突变体ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＪＭ１０９中的表达，为Ｔｐｏ进一步的结构和功能研究提供材料来源。方法：用多聚酶链反应及ＤＮＡ重组技术，将ＰＣＲ产物克隆到ｐＵＣ１９载体并测序，然后克隆到表达载体ｐＭＡｌ－ｃ２上。     

人自身抗原Sm B′的基因克隆和原核表达

目的克隆并表达人自身抗原Sm B′。方法应用RT-PCR技术,从HL-60细胞株中克隆人自身抗原Sm B′全长基因,将PCR产物直接TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-ST载体中,转入大肠杆菌BL-21。阳性克隆鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。结果PCR产物约为0.7kb,与预期657 bp接近,测序结果与GenBank报道的完全一致。pGEX-5T—Sm B′重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白分子量为53KD,具有天然人自身抗原Sm B′的免疫原性。结论成功克隆表达人自身抗原Sm B′,为下一步工作奠定了基础     

肠道病毒71型VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的采用分子克隆技术,构建肠道病毒71型(EV71)VP1全长基因大肠杆菌原核系统表达载体,诱导重组VP1融合蛋白表达。方法自EV71感染患者血清中提取病毒总RNA,进行一步法RT-PCR,扩增编码VP1蛋白的全长基因片段(891 bp),以pET32(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET32(a)-VP1,转化E.coli.Rosseta感受态细胞,获得重组工程菌株。经诱导培养,SDS-PAGE电泳,免疫印迹鉴定表达产物。结果获得了含重组表达质粒pET32(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白。结论重组工程菌可表达VP1融合蛋白,对研究EV71发病机制及疫苗研制具有重要意义。     

人B型钠尿肽原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的构建人B型钠尿肽(Human B-type Natriurtic Peptide,BNP)原核表达载体并诱导其表达、纯化及鉴定。方法根据已报道的人BNP基因序列,采用RT-PCR技术从人心肌组织中获得B型钠尿肽cDNA序列。将所得的PCR产物插入克隆载体pGEM-T-easy中,得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段插入原核表达载体pGEX-6P-1中并转化大肠杆菌E.coliBL21,通过IPTG诱导表达出带有GST-BNP的融合蛋白。经Glutathione Sepharose4B亲和层析纯化融合蛋白。结果序列分析表明,人B型钠尿肽基因活性肽编码区含有96bp,编码32个氨基酸,与GenBank(NM002521)中已报道的BNP核苷酸序列一致。经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的30%,相对分子质量约为29KD,并与商品化的人BNP单抗呈特异性反应。经Glu-tathione Sepharose4B纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。结论获得了人GST-BNP蛋白,为制备BNP检测试剂奠定了基础。     

自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶的基因克隆和原核表达研究

目的研究建立用克隆、表达和鉴定人自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶（HARS，亦称Jo-1抗原）检测多发性肌炎／皮肌炎（PM／DM）自身免疫抗体的方法。方法用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）从HL-60细胞株中克隆人自身抗原Jo-1全长基因，将PCR产物直接进行TA克隆、鉴定及测序，再定向克隆至pGEX-5T载体中，并转入大肠杆菌BL-21；阳性克隆鉴定后在异丙基．β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达，然后对其产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（IBT）检测。结果PCR产物约1500bp，与预期1526bp接近，测序结果与基因库核酸完全一致。pGEX-5T-Jo-1重组阳性克隆酶切鉴定正确，SDS-PAGE和IBT结果显示，融合蛋白分子量75000，具有天然人自身抗原Jo-1的免疫原性。结论成功克隆表达人自身抗原Jo-1，为建立PM／DM自身免疫抗体检测方法奠定了基础。     

人regucalcin和红色荧光蛋白融合基因的构建及表达

目的:构建人regucalcin(RGN)全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,观察RGN及红色荧光蛋白(DsRed)在人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)中的表达。方法:RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA,将扩增的产物进行T-A克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将RGN基因酶切后构成pDsRed-RGN,再将RGN基因与DsRed一起酶切构建成pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo的真核表达重组质粒。用脂质体将重组质粒转染入HK-2细胞,激光共聚焦显微镜观察重组质粒的表达情况。结果:RT-PCR扩增获得人HK-2细胞,其RGNcDNA全长897bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。经zeocin(zeo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株。激光共聚焦显微镜观察到转染重组质粒的细胞中有红色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo真核表达质粒,并发现其在HK-2细胞中表达。     

人内皮抑素-白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达与鉴定

目的构建编码人内皮抑素-白蛋白的融合基因,并在毕赤酵母(pichia pastoris)中获得高效表达。方法通过重叠延伸PCR的方法 ,构建编码人内皮抑素-白蛋白的融合基因,并克隆至pGEM-T载体中,测序正确后,将其亚克隆至酵母表达载体pPIC9中,然后将鉴定正确的重组表达载体pPIC9/ES-HSA线性化后转化入GS115宿主菌。采用原位双膜法筛选高表达菌株,对高表达菌株进行扩大培养,将表达上清液盐析后分别经阳离子交换层析、阴离子交换层析和亲和层析纯化,获得了重组融合蛋白,采用MTT法测定融合蛋白中内皮抑素的活性。结果成功构建了人内皮抑素-白蛋白融合基因和重组表达质粒pPIC9/ES-HSA,并筛选到表达较为理想的重组菌株pPIC9/ES-HSA/GS115,经甲醇诱导表达后纯化,融合蛋白的纯度达到92%以上,并具有抑制人血管内皮细胞系ECV-304细胞的增殖活性。结论本方法可成功获得具有人内皮抑素生物活性的重组人内皮抑素-人血清白蛋白融合蛋白。     

细胞核抗原Sm B'的基因克隆和原核表达

目的 为建立抗Sm自身抗体检测方法,自行克隆、表达和鉴定细胞核抗原Sm B’。方法 应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术,从HL-60细胞株中克隆Sm B’全长基因,将PCR产物直接进行TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21,阳性克隆鉴定后在异丙基-β—D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达,产物行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（western blot）鉴定。结果PCR产物约为700 bp,与预期657 bp接近,测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致。pGEX-ST-Sm B’重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS—PAGE和western blot结果显示融合蛋白分子量为51 000,具有与抗Sm B’抗体的反应性。结论成功克隆表达核抗原Sm B’,为建立抗Sm自身抗体检测方法奠定了基础。     

耐药人白血病细胞GSH含量、GST活力及其同工酶、MRP表达的研究

目的：了解多药耐药基因（ｍｄｒ１）机制以外导致人白血病细胞耐药的因素。方法：采用生化方法，对Ｋ５６２和ＨＬ６０敏感和耐药细胞株谷胱甘肽（ＧＳＨ）含量、谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴ）活力进行测定；用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交对ＧＳＴα、π、μ和多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）ｍＲＮＡ表达进行检测；用Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交对ＧＳＴα、π、μ蛋白表达进行检测。结果：与敏感株相比，Ｋ５６２／Ｈ２０和Ｋ５６２／ＶＣＲ的ＧＳＨ含量、ＧＳＴ活力明显增高，ＨＬ６０／Ａｄｒ的ＧＳＨ含量和ＧＳＴ活力无明显增高，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ和Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交可见ＧＳＴα、π和ＧＳＴπ、μ在Ｋ５６２／Ｈ２０和Ｋ５６２／ＶＣＲ过度表达，ＨＬ６０／Ａｄｒ无ＧＳＴ同工酶过度表达，ＭＲＰ在三种耐药株均有过度表达。结论：ＧＳＨ、ＧＳＴ和ＭＲＰ参与了Ｋ５６２／Ｈ２０和Ｋ５６２／ＶＣＲ耐药，ＨＬ６０／Ａｄｒ耐药与ＧＳＨ、ＧＳＴ无关，与ＭＲＰ有关。在实际应用中，应对多种耐药指标同时进行检测