脑溢安对缺氧大鼠脑微血管内皮细胞VEGF蛋白表达的影响

目的:观察脑溢安血清对体外缺氧培养的大鼠脑微血管内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响。方法:大鼠用脑溢安浸膏连续灌胃3d后,心脏内采血分离出血清;用新生7d SD大鼠脑内分离培养的微血管内皮细胞（RCMEC）移入厌氧培养箱造成缺氧模型;MTT法测定细胞活性;免疫细胞化学及Werstern blotting研究脑微血管内皮细胞VEGF蛋白表达。结果:缺氧18h脑溢安组OD值较对照组增高（P<0.05）。缺氧损伤的脑微血管内皮细胞内VEGF蛋白表达增强,脑溢安血清组VEGF蛋白的表达水平高于对照组(P<0.01)。结论:缺氧可诱导脑微血管内皮细胞VEGF蛋白的表达;脑溢安可以上调VEGF蛋白的表达,这可能是脑溢安对缺氧的脑微血管内皮细胞的保护作用机制之一。     

N-乙酰半胱氨酸对AGEs诱导的微血管内皮细胞VCAM-1表达的抑制作用

用流式细胞仪测定晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)刺激及N—乙酰半胱氨酸(NAC)干预前后小鼠心脏微血管内皮细胞血管细胞黏附分子1(VCAM—1)的表达，同时用放免法测定培养上清中TNF—α水平。结果发现AGEs刺激后微血管内皮细胞VCAM—1表达增加，TNF—α水平升高；NAC干预组VCAM—1表达降低，TNF—α水平下降并具有剂量依赖性。提示NAC能抑制AGEs诱导的微血管内皮细胞VCAM—1的表达，TNF—α的介导是可能的机制之一。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的 建立稳定的大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)体外培养模型,并对其生物学特性进行初步研究.方法 取Sprague-Dawley大鼠脑组织,通过匀浆、酶消化和梯度离心获得纯化的脑微血管段后,接种于涂布明胶的培养瓶进行原代培养;培养的细胞采用相差显微镜形态学观察、Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定;采用跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance, TEER)检测单层细胞通透性;Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法测定细胞生长曲线.结果 细胞从贴壁的脑微血管段周围长出,呈短梭形和多角形,区域性单层生长,5～7 d细胞融合,经Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学检测证实培养的细胞是血管内皮细胞,原代培养的脑微血管内皮细胞表现出很强的屏障特性,随着传代次数的增加脑微血管内皮细胞的跨内皮阻抗减弱.结论 提示该方法能成功进行纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养,原代培养的脑微血管内皮细胞是研究脑部微血管和血脑屏障的可靠技术手段.     

通络救脑注射液对氧糖剥夺大鼠脑微血管内皮细胞胎盘生长因子表达的影响

[目的]探讨通络救脑注射液对氧糖剥夺大鼠脑微血管内皮细胞胎盘生长因子(PLGF)及其受体血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1)表达的影响。[方法]通过氧糖剥夺(OGD)方法复制脑微血管内皮细胞拟缺血损伤模型。实验分为正常对照组、氧糖剥夺模型组、通络救脑注射液干预组,分别采用酶联免疫吸附法和免疫印迹法检测脑微血管内皮细胞条件培养液中PLFG的含量,以及内皮细胞VEGFR-1的表达。[结果]通络救脑注射液可以显著提高氧糖剥夺模型大鼠脑微血管内皮细胞PLGF及其受体的表达,与模型组相比,差异具有统计学意义(P0.01)。[结论]通络救脑注射液能够增加拟缺血损伤大鼠脑微血管内皮细胞PLGF及其受体的表达,提示提高PLGF及其受体的表达是该中药复方发挥清热、解毒、通络药效的分子途径之一。     

人参总皂苷调控中风后巢内细胞对神经干细胞的作用

目的:中风是一种严重危害人类健康的疾病,神经干细胞能够促进中枢神经系统功能的修复。神经干细胞的增殖、分化、迁移需要干细胞niche的调控,前期实验发现人参总皂苷可以显著增加中风后神经干细胞的数量。体外模拟神经干细胞niche内星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞对神经干细胞的影响,以研究人参总皂苷是否能作用于星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞而促进中风后神经干细胞的分化,修复脑损伤?将脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经干细胞共培养,观察模拟神经干细胞niche内复杂微环境条件下,人参总皂苷能否使脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞分泌的VEGF增多,从而促进中风损伤的神经干细胞分化。方法:取1-3d的新生SD大鼠,分离培养星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞。取孕16d SD大鼠,分离培养神经干细胞。利用Transwell装置,将神经干细胞、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞共培养。制备神经干细胞缺氧6h的脑中风模型。用含1μg/ml的人参总皂苷培养基作用1d,设置空白对照组。MAP-2标记成熟神经元,GFAP标记星形胶质细胞。用细胞免疫荧光化学染色检测缺氧6h神经干细胞分化后的MAP-2和GFAP阳性细胞比例,ELISA检测人参总皂苷对星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞共培养上清中VEGF含量的影响。结果:与脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞共培养条件下,与空白对照组比较,人参总皂苷可显著增加MAP-2阳性细胞比例(P<0.01);人参总皂苷作用于星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞48h可显著上调VEGF表达(P<0.01)。结论:人参总皂苷作用于脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞可增加中风后神经干细胞向神经元定向分化并促进其成熟,可能与人参总皂苷调控脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞VEGF分泌,改善神经干细胞niche微环境有关。     

兔脑微血管与大动脉内皮细胞膜离子通道的比较

目的 :观察培养脑微血管内皮细胞电生理特点 .方法 :培养脑不同部位微血管内皮细胞 ,采用全细胞膜片钳技术 ,在高钾细胞内液和高钠细胞外液条件下观察细胞静息膜电位和电压依赖性电流特点 .结果 :兔脑干、小脑和大脑皮质的微血管内皮细胞静息膜电位分别为 (15± 12 ) ,(2 0± 8)和(31± 16 )mV ,其中脑干和大脑皮层的微血管内皮细胞静息膜电位间有显著性差异 .在本实验条件下 ,乙酰胆碱 (1～ 10 0μmol·L-1)对脑微血管内皮细胞膜电位没有明显影响 ,但可引起兔主动脉和肺动脉内皮细胞膜电位去极化 ,且被阿托品 (6μmol·L-1)抑制 .超极化步脉冲条件下可以记录到一内向性整流性电流 ,去极化条件下则记录到一具有随时间激活的外向性电流 ,以上两种电流均对钾通道阻断剂TEA敏感 ;部分细胞中还可以记录到一种快速激活和快速失活且对钳制电压敏感的电流 .兔脑微血管内皮细胞电流特点与牛主动脉内皮细胞(以内向整流性电流为主 )和兔肺动脉平滑肌细胞 (以外向整流性电流为主 )的电生理特点明显不同 .结论 :兔脑不同部位微血管内皮细胞静息膜电位不同 ;可以记录到 3种类型的钾通道电流 ,其特点与牛大血管内皮细胞和兔平滑肌细胞电流明显不同     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的:探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础.方法:用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养;用光镜、电镜及免疫组化检测进行鉴定.结果:分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养一周左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,透射电镜可见Weibel-Palade小体.第Ⅷ因子相关抗原免疫组化测定阳性.结论:该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞.     

比较肿瘤坏死因子α和内毒素对人脑微血管内皮细胞凝血和纤溶活性的影响

目的:比较肿瘤坏死因子α(TNF-α)和内毒素脂多糖(LPS)对人脑微血管内皮细胞(HBMVECs)凝血和纤溶活性的影响.方法:从人脑组织分离、纯化和培养HBMVECs,通过细胞免疫荧光染色、流式细胞术和电子显微镜对HBMVECs进行鉴定.检测TNF-α和LPS刺激前后HBMVECs凝血纤溶活性变化:一期凝同法检测凝血活性(PCA);酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞组织因子(TF)、血栓调节蛋白(TM)、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的水平.结果:分离、纯化的HBMVECs表达内皮细胞典型的标志分子vWF、CD31,并具有摄取乙酰化低密度脂蛋白的能力.LPS和TNF-α促进HBMVECs的凝血活性,上调PCA和TF的产生.抑制抗凝血活性,下调TM的表达;并明显促进纤溶活性t-PA和PAI-1的表达.通过比较PCA/TM发现,TNF-α对HBMVECs凝血活性的影响明显强于LPS.结论:TNF-α在感染性中枢神经系统疾病中可能是导致脑微血管内皮细胞功能障碍的主要因素之一.     

体外循环血清孵育及NAC干预对血管内皮细胞凋亡的影响

目的 观察体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)血清对培养血管内皮细胞凋亡的影响及N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)的干预作用.方法 采用CPB血清致伤培养血管内皮细胞模型,以TUNEL方法及流式细胞术观察培养血管内皮细胞凋亡的改变.结果 CPB血清可致培养血管内皮细胞凋亡明显增加,0.1、1 mmol/L NAC减少CPB血清诱致的培养内皮细胞凋亡,10、100 mmol/L NAC加重CPB血清诱致的培养内皮细胞凋亡.结论 CPB血清诱致培养血管内皮细胞凋亡增加,低浓度NAC对CPB血清诱致的内皮细胞凋亡有保护作用,高浓度NAC加重CPB血清诱致的内皮细胞凋亡.     

亚低温对过氧化氢损伤后脑微血管内皮细胞NF-κB表达的影响

目的 研究亚低温对过氧化氢损伤后脑微血管内皮细胞核转录因子(NF-κB)表达的影响.方法 分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞,用过氧化氢损伤的方法建立脑出血后血肿周围炎症反应内皮细胞模型.将细胞分为实验组(ICH)和对照组(C).ICH组分为过氧化氢损伤常温组(ICH+ N)和过氧化氢损伤亚低温组(ICH+ H),C组分为常温对照组(C+N)和亚低温对照组(C+H).采用Western blot技术检测各组NF-κB的表达水平.结果 实验组NF-κB的表达水平均高于各自对照组(P＜0.01),ICH+N组蛋白表达水平高于ICH+H组(P＜0.01).结论 亚低温可有效降低过氧化氢损伤的脑微血管内皮细胞NF-κB的表达,从而减轻血肿周围炎症反应,发挥其脑保护作用.     

人胎盘组织液在小鼠脑微血管内皮细胞增殖中的作用研究

目的:研究人胎盘组织液对小鼠脑微血管内皮细胞增殖的影响。方法:采用细胞计数和MTT法观察不同稀释度人胎盘组织液作用72 h后,小鼠脑微血管内皮细胞增殖情况。同时以免疫组织化学法检测不同稀释度人胎盘组织液对小鼠脑微血管内皮细胞增殖细胞核抗原表达的影响。结果:一定稀释度的人胎盘组织液可促进小鼠脑微血管内皮细胞的增殖,25 ml/L即可发挥作用,200 ml/L作用最明显。小鼠脑微血管内皮细胞PCNA表达阳性率与人胎盘组织液稀释度呈剂量相关性。结论:人胎盘组织液可促进体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞增殖。     

鼠尾胶为贴黏剂的微血管内皮细胞培养

目的:以鼠尾胶为贴黏剂,建立一种成本低且生长状态良好的微血管内皮细胞体外培养体系。方法:无菌条件下制作鼠尾胶,并均匀铺在培养皿中。分离收集脑微血管段,接种于铺有鼠尾胶的培养皿中进行培养。用内皮细胞的两种重要标记物VIII因子相关抗原和γ-谷氨酰转酞酶(-γglutamyl-transpeptidase,γ-GT)鉴定细胞,并以3H-TdR掺入法观察培养细胞对血清刺激的增殖反应性。结果:显微镜观察从脑微血管段生长出的细胞具有内皮细胞生长特性:单层“卵石样”排列特征和接触生长抑制;VIII因子免疫组织化学染色呈阳性;培养上清含有大量的γ-谷氨酰转酞酶[(5.01±0.07)IU/L];证实鼠尾胶做为贴黏剂获得的是内皮细胞。10%胎牛血清刺激后3H-TdR掺入率较对照组增加87.5%(P<0.05)。结论:本研究用鼠尾胶做为贴黏剂,降低微血管内皮细胞培养成本,且细胞生长状态良好,表明该方法是一种比较经济可靠的微血管内皮细胞培养体系。     

大鼠脑外伤后TM、vWF的表达与脑水肿及MVD变化的相关性研究

目的观察大鼠脑外伤后脑组织与外周血中血栓调节蛋白(TM)、血管假性血友病因子(vWF)的表达、脑含水量以及微血管面密度(MVD)的动态变化,探讨TM、vWF与MVD及脑含水量的相关性。方法 90只Wistar大鼠随机分为对照组和外伤组,采用自由落体打击法制做大鼠脑外伤模型。按伤后处理时间各组再分为9个亚组,每组5只,分别于30 min、1 h、3h、6 h、12 h、1 d、3 d、7 d、14 d不同时间点处死大鼠。采用干湿重法检测损伤侧脑组织含水量;免疫组化法测定脑组织中TM、vWF表达,CD34标记损伤灶周围脑皮层区微血管并计算MVD,酶联免疫吸附(ELISA)法检测外周血中TM、vWF的表达。结果大鼠颅脑创伤后外伤组脑组织及外周血中TM、vWF表达水平与对照组比较有明显升高(P0.05),脑组织TM、vWF表达均与MVD呈负相关(r=-0.378,P0.05、r=-0.426,P0.05);血浆TM、vWF表达与MVD呈负相关(r=-0.663,P0.05、r=-0.884,P0.05)。结论 TM、vWF的表达水平变化可以反映脑外伤早期微血管内皮细胞活化状态,并且与脑水肿的发生发展密切相关。     

Study of the correlation TM, vWF expression with MVD changes and brain edema of rats with brain traumatic

目的 观察大鼠脑外伤后脑组织与外周血中血栓调节蛋白(TM)、血管假性血友病因子(vWF)的表达、脑含水量以及微血管面密度(MVD)的动态变化,探讨TM、vWF与MVD及脑含水量的相关性.方法 90只Wistar大鼠随机分为对照组和外伤组,采用自由落体打击法制做大鼠脑外伤模型.按伤后处理时间各组再分为9个亚组,每组5只,分别于30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、7 d、14 d不同时间点处死大鼠.采用干湿重法检测损伤侧脑组织含水量;免疫组化法测定脑组织中TM、vWF表达,CD34标记损伤灶周围脑皮层区微血管并计算MVD,酶联免疫吸附(ELISA)法检测外周血中TM、vWF的表达.结果 大鼠颅脑创伤后外伤组脑组织及外周血中TM、vWF表达水平与对照组比较有明显升高(P＜0.05),脑组织TM、vWF表达均与MVD呈负相关(r=-0.378,P＜0.05、r=-0.426,P＜0.05);血浆TM、vWF表达与MVD呈负相关(r=-0.663,P＜0.05、r=-0.884,P＜0.05).结论 TM、vWF的表达水平变化可以反映脑外伤早期微血管内皮细胞活化状态,并且与脑水肿的发生发展密切相关.     

LPS诱导小鼠肺微血管内皮细胞VEGF表达的探讨

目的：研究小鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法并探讨脂多糖(LPS)诱导小鼠肺微血管内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达．方法：贴块法培养小鼠肺微血管内皮细胞,并进行系列鉴定．采用ELISA方法检测正常组、LPS(1μg／ml)作用2、8、16、24、36、48h组的VEGF变化水平。结果：获得的小鼠肺微血管内皮细胞具有鹅卵石形态,但LPS对小鼠肺微血管内皮细胞形态影响明显。对异植物血凝素结合试验,CD31及Ⅷ因子抗原免疫组化染色为阳性。LPS(1μg／ml)分别作用小鼠肺微血管内皮细胞2h组可见VEGF表达升高,8h组达最高,16、24、36、48h组的表达量低于8h组。结论：LPS作用后,小鼠肺微血管内皮细胞VEGF表达呈抛物线型下降。LPS损伤内皮细胞功能和形态。     

脑心通胶囊对体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用

目的 观察脑心通胶囊对体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用.方法 建立体外培养大鼠脑微血管内皮细胞模拟脑缺血再灌注损伤模型,模拟脑缺血3 h,再灌注1,3,6,12,24,36,48,72 h后损伤内皮细胞的活性、死亡率变化以及脑心通胶囊的影响,测定体外培养大鼠脑微血管内皮细胞模拟脑缺血3 h,再灌注24 h时脑心通胶囊含药血清对细胞裂解液SOD活性、MDA及NO含量的影响.结果 体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞在模拟缺血再灌注损伤后,细胞内线粒体活力下降,死亡率升高,脑心通胶囊0.24,0.48 g&#183;kg-1能不同程度改善细胞损伤(P＜0.05,P＜0.01),明显提高裂解液中SOD活性(P＜0.05,P＜0.01),降低裂解液中MDA和NO含量(P＜0.05,P＜0.01),对大鼠脑微血管内皮细胞模拟脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用.结论 脑心通胶囊对体外培养大鼠脑微血管内皮细胞模拟脑缺血损伤有保护作用,其机制可能与抗脂质过氧化作用有关.     

双根清脑颗粒对血管性痴呆血管内皮细胞的保护作用

目的:探讨双根清脑颗粒对血管性痴呆大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用。方法:原代培养的大鼠脑血管内皮细胞,以低氧低糖方式造模。以不同浓度含药双根清脑颗粒血清药干预,以MTT法检测脑血管内皮细胞的存活率,以流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。结果:中剂量的含药血清能显著保护血管内皮细胞,与模型组对比存在统计学意义。结论:在一定浓度范围内的双根清脑颗粒含药血清能够明显保护原代培养的脑血管内皮细胞。     

hexarelin对ox-LDL引起的大鼠脑微血管内皮损伤的保护作用

目的建立体外培养大鼠脑微血管内皮细胞ox-LDL损伤模型,探讨hexarelin对大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用。方法分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞,分成正常对照组（control）、ox-LDL组（ox-LDL）、hexarelin ＋ ox-LDL组（hex＋ox-LDL）3组。其中ox-LDL组在培养液中加入ox-LDL 50mg/L; hex＋ox-LDL组加入ox-LDL 50mg/L和0.1μmol/L hexarelin;正常对照组加入等量PBS。各组细胞无血清培养12h,MTT法检测细胞存活率,TUNEL法检测细胞凋亡情况,Western blot法检测内皮细胞eNOS蛋白表达情况以及蛋白质硝基化情况。结果50mg/L ox-LDL作用12h可明显诱导内皮细胞凋亡,减少eNOS蛋白表达,促进蛋白质的硝基化。而用0.1μmol/L hexarelin和50mg/L ox-LDL共同孵育,可明显减少内皮细胞的凋亡,提高eNOS的表达水平,减少蛋白质的硝基化程度。结论hexarelin能有效抑制由ox-LDL引起的脑微血管内皮细胞损伤,提示hexarelin对脑动脉粥样硬化可能有一定抑制作用。     

大鼠脑微血管内皮细胞体外缺血再灌注模型的建立及他汀的保护作用

目的 建立大鼠脑微血管内皮细胞体外缺血再灌注模型,并观察辛伐他汀、洛伐他汀的保护作用.方法 原代分离培养SD大鼠脑微血管内皮细胞,以无糖Krebs溶液再复氧复糖模拟体外缺血再灌注损伤,并实施辛伐他汀、洛伐他汀预处理干预.观察各组细胞形态,测定各组细胞上清中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性,利用CCK-8检测各组细胞增殖活性.结果 氧糖剥夺(Krebs液) 缺氧12h再复氧复糖4h模型可成功模拟大鼠脑微血管内皮细胞缺血再灌注损伤.辛伐他汀、洛伐他汀预处理后,脑微血管内皮细胞eNOS活性增强、iNOS活性降低,细胞增殖活性提高.结论 辛伐他汀、洛伐他汀具有显著的脑缺血再灌注损伤保护作用.     

小窝蛋白-1对N-甲基-D天冬氨酸诱导的脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白带状闭合蛋白1的破坏作用研究

目的:探索小窝蛋白(Cav)-1对N-甲基-D天冬氨酸(NMDA)诱导的脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白带状闭合蛋白1(ZO-1)和血脑屏障完整性的破坏作用.方法:体外培养人脑微血管内皮细胞HBEC-5i并构建血脑屏障模型.以不同浓度的NMDA孵育HBEC-5i,并观察其对细胞活力的影响.细胞分别用NMDA受体(NMDAR...