构建survivin shRNA重组载体及靶向下调PC3细胞survivin mRNA的表达

背景：survivin基因特异性表达于肿瘤和胚胎组织,与肿瘤细胞的分化增殖、浸润转移以及多药耐药密切相关。目的：构建靶向survivin基因的shRNA重组质粒表达载体,转染前列腺癌细胞PC3,验证该载体能否下调细胞survivin基因mRNA水平。方法：以survivin基因为靶点设计具有短发夹结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6建立重组表达载体pENTR/U6-SUR;转化E.coliTOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;将重组质粒转染前列腺癌细胞株PC3细胞,RT-PCR检测重组质粒对细胞survivin基因mRNA水平的抑制效果。结果与结论：将设计合成的shRNA序列经退火后克隆至pENTR/U6载体中,菌落PCR可扩增出目的条带,测序结果证实插入片段为所需序列;pENTR/U6-SUR重组质粒转染后PC3细胞survivin基因mRNA表达水平显著下降,且24h比48h作用更明显。成功构建了靶向survivin基因的shRNA质粒表达载体,并证实该载体显著下调了PC3细胞中survivin基因mRNA水平。     

应用RNA干扰技术沉默vegfr-2基因的实验研究

为了探讨恶性肿瘤基因治疗的新靶点,本研究以vegfr-2的mRNA为靶点,设计、构建vegfr-2 shRNA的真核表达载体,用脂质体法将重组质粒转染人非小细胞肺癌A549细胞,用RT-PCR法及Western blot分别检测重组质粒对该基因mRNA和蛋白表达的抑制效果,应用CCK-8法检测细胞增殖、抑制情况,Hoechst染色法检测细胞凋亡形态学变化。结果表明:与空白对照、空质粒对照及scramble对照相比,干扰组shRNA能有效地降解vegfr-2mRNA,尤其转染pGenesil-1-vegfr-2-shRNA-1质粒组内源性vegfr-2 mRNA及蛋白减少更显著;在不同时间点转染干扰质粒组的A值均降低,转染后72小时抑制率最高,干扰组与空质粒组和空白对照组相比,对细胞生长抑制作用的差异有统计学意义(p0.01);Hoechst荧光染色显示,转染48小时后在荧光显微镜下干扰组细胞呈典型的细胞凋亡形态。结论:vegfr-2 shRNA真核表达载体可序列特异性下调A549细胞的基因转录和表达,有效抑制细胞增殖和诱导凋亡,提示VEGF/VEGFR-2信号通路可作为恶性肿瘤基因治疗和功能研究的理想靶点。     

抑制cyclin D1基因小发夹RNA(shRNA)表达质粒的构建

目的:通过构建抑制cyclin D1基因小发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,为肿瘤基因治疗提供实验依据。方法:利用基因重组技术构建靶向cyclin D1RNA干扰(RNAi)表达质粒,双酶切鉴定电泳及测序分析构建的质粒是否成功;Western Blot分析转染前后K562细胞cyclin D1蛋白表达的变化。结果:体外合成的64个碱基成功插入到预计位点,并且与设计序列完全一致;Western Blot分析结果显示转染所构建的质粒能明显下调K562细胞cyclin D1基因表达。结论:质粒的成功构建为研究其抑制cyclin D1基因表达,发挥抗肿瘤效应以及与放、化疗联合的协同效应打下基础。     

构建survivin shRNA重组载体及靶向下调PC3细胞survivin mRNA的表达

背景:survivin 基因特异性表达于肿瘤和胚胎组织,与肿瘤细胞的分化增殖、浸润转移以及多药耐药密切相关.目的:构建靶向survivin 基因的shRNA 重组质粒表达载体,转染前列腺癌细胞PC3,验证该载体能否下调细胞survivin 基因mRNA 水平.方法:以survivin 基因为靶点设计具有短发夹结构的shRNA 序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6 建立重组表达载体pENTR/U6-SUR ;转化E.coli TOP10 菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR 和测序鉴定;将重组质粒转染前列腺癌细胞株PC3 细胞,RT-PCR 检测重组质粒对细胞survivin 基因mRNA 水平的抑制效果.结果与结论:将设计合成的shRNA 序列经退火后克隆至pENTR/U6 载体中,菌落PCR 可扩增出目的条带,测序结果证实插入片段为所需序列;pENTR/U6-SUR 重组质粒转染后PC3 细胞survivin 基因mRNA 表达水平显著下降,且24 h 比48 h 作用更明显.成功构建了靶向survivin 基因的shRNA 质粒表达载体,并证实该载体显著下调了PC3 细胞中survivin 基因mRNA 水平.     

STAT3-siRNA诱导前列腺癌细胞凋亡机制的探讨

目的 探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因表达诱导人前列腺癌细胞凋亡的机制。方法 针对人STAT3mRNA序列设计合成编码干扰RNA（siRNA）的DNA模板,构建pSilencer 2.1-U6-STAT3-siRNA重组质粒,转染人前列腺癌细胞株PC3,采用Western blot、Northern blot观察STAT3基因表达抑制后Bcl-2,C-Myc与Cyclin D1表达的变化,并用流式细胞技术及吖啶橙染色方法观察细胞凋亡。结果成功构建pSilencer 2.1-U6-STAT3-siRNA重组质粒,并成功转染PC3细胞;Northern blot及Western blot结果 证实重组质粒在mRNA及蛋白水平均显著抑制STAT3基因表达,抑制率分别为60%及75%,并证实随着STAT3表达的抑制Bcl-2,C-Myc及Cyclin D1的表达明显下调。FCM及吖啶橙染色结果表明上述重组质粒可诱导PC3细胞凋亡。结论 STAT3-siRNA可抑制STAT3在人前列腺癌细胞的表达,诱导肿瘤细胞凋亡。其机制与STAT3抑制Bcl-2,C-Myc及Cyclin D1表达有关。     

凋亡抑制基因Survivin siRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向survivin siRNA真核表达载体,通过RNA干扰技术阻断survivin基因表达。方法针对目的基因survivin序列设计双链DNA(dsDNA),采用DNA重组技术与载体连接,转化感受态细胞经诱导表达筛选阳性克隆子。结果重组质粒经酶切、测序鉴定,证实插入载体目的基因片段大小与插入方向正确,符合其物理图谱。结论靶向survivin siRNA真核表达载体可用于转染肿瘤细胞,阻断survivin基因表达并诱导细胞凋亡的RNAi实验研究,为肿瘤的基因治疗提供一种新的方法。     

靶向AATF基因shRNA表达载体的构建及其稳定表达的白血病U937细胞系的建立

本研究旨在构建靶向AATF基因的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的人白血病U937细胞系。根据GenBank数据库提供的AATF mRNA序列,以228～249、303～324、443～464位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆至经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化的pSilencer 3.1人H1启动子干扰载体中,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确,经电穿孔将3个重组载体（pSA-1、pSA-2、pSA-3）转染人白血病U937细胞系,G418（500 mg/L）有限稀释法持续筛选8周后,扩增获得稳定表达的细胞系;RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染细胞系的AATF mRNA和AATF蛋白表达。结果表明,AATF干扰序列及读码框完全正确。稳定转染细胞AATF mRNA表达下调,AATF蛋白表达量下降（P〈0.05）。结论：成功地构建AATF shRNA真核表达载体及AATF表达稳定抑制的白血病U937细胞系,为以AATF基因为靶点的人白血病进一步研究奠定了实验基础。     

重组干扰质粒对卵巢癌COC1细胞HDAC1表达的影响

目的构建重组HDAC1基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒干扰质粒并研究其对卵巢癌COC1细胞HDAC1表达的影响。方法针对HDAC1基因设计特异性siRNA靶点,构建慢病毒干扰质粒载体,筛选获得的有效shRNA慢病毒干扰序列,将其转染卵巢癌COC1细胞。采用Real-time PCR方法检测靶基因在mRNA水平的沉默效果,Western blot方法检测靶基因在蛋白质水平的沉默效果。结果构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确。shRNA慢病毒干扰质粒转染COC1细胞后HDAC1基因的mRNA表达量和蛋白质水平较阴性对照质粒转染组均显著下调(P0.05)。结论成功构建HDAC1基因的shRNA慢病毒干扰质粒,该慢病毒干扰质粒能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

应用Gateway技术构建pLenti6-Akt shRNA真核表达载体

目的 应用Gateway技术构建靶向人Akt基因的shRNA真核表达载体,转染肝癌细胞株HepG2,验证该载体能否下调Akt基因的mRNA水平.方法 以Akt基因为靶点设计两条具有短发卡结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6入门表达载体(pENTR/U6-Akt1,pENTR/U6-Akt2);转化E.coli TOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;利用Gateway技术进行LR位点特异性重组,将shRNA导入目的 表达载体pLenti6/Block-it DEST Vector,再行测序鉴定(pLenti6-Akt1,pLenti6-Akt2);将重组质粒转染肝癌细胞株HepG2,提取RNA,RT-PCR检测重组质粒对mRNA水平的抑制效果.结果 经菌落PCR和DNA测序鉴定:pENTR/U6-Akts入门载体和pLenti6-Akts目的 表达载体中插入片段的序列正确,RT-PCR结果表明将shRNA分别转染HepG2细胞后,Akt的mRNA表达受到明显抑制,其中1shRNA比2#shRNA抑制效果明显.结论 利用Gateway技术成功构建了靶向人Akt基因的shRNA表达载体,为以Akt基因为靶点的肝癌基因治疗方案奠定了实验基础.     

短发夹状RNA真核表达载体对HL-60细胞生存素基因表达的影响及诱导凋亡作用

最近研究发现,白血病细胞凋亡受阻与生存素(survivin)的过度表达有关.为此,我们设计了survivin特异性短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,利用脂质体转染急性粒细胞白血病细胞株HL-60细胞,检测转染前后细胞survivin基因mRNA和蛋白表达以及凋亡情况,探讨以survivin为靶点,将RNA干扰(RNA interference,RNAi)用于白血病基因治疗的可行性.     

靶向转酮醇酶样基因1 siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建针对转酮醇酶样基因1(TKTL1)特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体并检测其沉默效应。方法采用人U6 SnRNA启动子,分别把被9 bp序列间隔的19 bp长短的TKTL1靶序列的反向重复序列,置于pEGFP-C1-U6质粒载体中,构建成TKTL1短发夹环RNA,产生重组质粒pEGFP-C1-U6/TKTL1,分别用PstⅠ和SalⅠ酶切鉴定及测序分析,并将重组质粒转染人结肠癌细胞株LoVo,通过RT-PCR检测TKTL1基因表达水平的变化。结果酶切鉴定与DNA测序分析证明,TKTL1基因的siRNA表达载体构建正确,RT-PCR结果表明转染重组质粒的LoVo细胞TKTL1基因的表达水平明显降低。结论成功构建了针对TKTL1基因的siRNA表达载体,转染LoVo细胞后可显著抑制TKTL1基因表达。     

针对表皮生长因子受体基因RNA干扰质粒表达载体的构建

目的:表皮生长因子受体(EGFR)是一种酪氨酸激酶跨膜受体,人类的多种恶性肿瘤的发生与表皮生长因子受体过度表达有关。EGFR已成为阳性表达肿瘤的重要治疗靶标。在哺乳动物细胞中,RNA干扰是通过与目的基因特异互补的21-23个硷基的小双链RNA来抑制该基因的表达。有研究表明表达小发夹RNA的载体能诱导产生更好的RNA干扰效果。本实验通过向pSIREN-Shuttle质粒插入一段可被转录成小发夹RNA的双链寡核苷酸序列(其中含有于EGFR基因序列相同的19nt序列)重构了RNAi质粒表达载体。通过细胞转染评价该载体对人鼻咽癌细胞株(HNE1)EGFR基因的mRNA表达抑制效果。结果显示HNE1细胞的EGFR基因mRNA被明显抑制。提示shRNA质粒表达载体介导对EGFR基因的RNA干扰可能是鼻咽癌干预治疗的一种有效手段。     

靶向TNF-α基因shRNA干扰片段的筛选和重组体的构建

本研究利用RNA干扰技术，筛选出可以高效、特异性抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的小发夹状RNA（shRNA）片段，设计并构建重组质粒，进行序列分析，为探索TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径。取原代培养小鼠腹腔巨噬细胞，置于15％ DMEM中，调细胞浓度为2×10^7／L，接种于6孔板，3ml／well；细胞用脂多糖（LPS）激活，ELISA法测不同时间培养上清中TNF—α的浓度；将针对TNF-α基因的5段shRNA干扰片段的表达框经PCR扩增、纯化后，与转染试剂混合转染入巨噬细胞，细胞用LPS激活24小时后用ELISA法测培养上清中TNF-α的浓度，RT—PCR法测细胞TNF-α mRNA的表达；将最有效抑制TNF-α表达的干扰片段插入质粒载体，转化Ecoli DH5α感受态菌株，提取质粒，进行测序分析。结果表明：LPS刺激巨噬细胞24小时后，细胞分泌TNF—α达高峰；转染了干扰序列1的细胞培养上清中TNF—α浓度与对照组相比下降最明显（P〈0．05），达59．46％，TNF—α mRNA的表达被抑制了61．2％；将干扰序列1DNA序列克隆到载体上，经测序鉴定确实为所需序列。结论：成功筛选出靶向TNF-α基因的shRNA干扰片段并构建重组质粒，可进一步利用克隆所得到的shRNA干扰TNF-α mRNA的表达，为TNF—α相关疾病的基因治疗提供新手段。     

CHOP基因shRNA载体构建及沉默效应

背景:研究认为,CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein,CHOP)通路是内质网应激介导细胞凋亡的3条通路之一,目前国内外对内质网应激介导细胞凋亡在胃癌方面的研究较少。目的:构建针对人CHOP基因的短发卡RNA表达载体,观察RNA干扰对人胃癌细胞系BGC823细胞CHOP基因表达的抑制作用。方法:设计CHOP的shRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后重组入真核表达载体pSUPER-EGFP1,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人胃癌细胞系BGC823细胞,采用RT-PCR和Western blotting分别检测CHOP基因mRNA和蛋白表达的变化。结果与结论:把针对CHOP基因的shRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pSUPER-EGFP1载体,经测序分析,插入片段正确;RT-PCR和Western blot检测显示,CHOP基因的表达水平明显降低,其中以CHOP-1为靶序列的shRNA沉默作用最强,CHOP的表达抑制率约67%。     

靶向STAT5的RNAi重组质粒的构建与鉴定

摘要:目的：构建靶向信号转导及转录激活因子5（STAT5）的RNAi重组质粒并进行鉴定。 方法：设计针对STAT5编码区的有短发夹结构的3对DNA序列,克隆到质粒载体Pgenesil-1中构建重组质粒,再对其进行酶切鉴定、DNA 测序分析。脂质体法转染重组质粒至SMMC7721细胞株中,westernblot、RT-PCR检测STAT5基因表达。 结果：酶切鉴定和测序分析提示,靶向STAT5的RNAi重组质粒构建成功,3条靶向STAT5的序列特异性小发夹状RNA（shRNA）可有效抑制SMMC7721细胞STAT5表达,mRNA表达抑制率分别为70.43%、43.02%、45.07%,蛋白质表达抑制率分别为67.45%、37.36%、41.86%(P<0.05)。其中以Pgenesil-1-STAT5A1抑制效应最强。 结论：成功构建靶向STAT5的RNAi重组质粒,为进一步用该重组干扰载体进行体内肿瘤基因治疗的研究奠定了基础。     

Cdc42-shRNA表达载体的构建及在肝癌细胞株的沉默效果

目的构建Cdc42-shRNA真核表达载体。方法合成Cdc42的基因干扰序列并定向插入到RNA干扰(RNAi)真核表达载体pGenesil-1质粒,通过测序进行鉴定。干扰质粒经脂质体Lipofectamine2000介导转染肝癌细胞,Westernblot方法检测沉默效率。结果测序证明干扰序列完全正确,Westernblot结果显示Cdc42-shRNA对肝癌细胞株内源性Cdc42有较好的沉默效果。结论成功构建了Cdc42-shRNA真核表达载体,为进一步研究Cdc42在基因治疗中的作用奠定基础。     

整合蛋白β_1 shRNA表达质粒的构建及其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响

目的应用RNAi技术,构建整合蛋白β1 shRNA表达质粒,诱导肝癌细胞中整合蛋白β1基因沉默,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响。方法设计整合蛋白β1 shRNA序列,与载体pSilencer 2.0连接,构建整合蛋白β1 shRNA表达质粒。经测序鉴定后,转染肝癌细胞SMMC-7721,Western blot检测整合蛋白β1及p27的蛋白表达,MTT方法测定转染后细胞的增殖能力。结果成功构建了整合蛋白β1 shRNA表达质粒,转染肝癌细胞SMMC-7721后,整合蛋白β1的蛋白表达被明显抑制,p27的蛋白表达也随之减少。MTT实验结果发现转染细胞的增殖能力明显提高。结论应用RNAi技术,可特异性阻断整合蛋白β1的蛋白表达。整合蛋白β1可调节肝癌细胞的增殖,并可能与p27的表达相关。     

整合蛋白β1 shRNA表达质粒的构建及其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响

目的 应用RNAi技术,构建整合蛋白β1 shRNA表达质粒,诱导肝癌细胞中整合蛋白β1基因沉默,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响.方法 设计整合蛋白β1 shRNA序列,与载体pSilencer 2.0连接,构建整合蛋白β1 shRNA表达质粒.经测序鉴定后,转染肝癌细胞SMMC-7721, Western blot检测整合蛋白β1及p27的蛋白表达, MTT方法测定转染后细胞的增殖能力.结果 成功构建了整合蛋白β1 shRNA表达质粒,转染肝癌细胞SMMC-7721后,整合蛋白β1的蛋白表达被明显抑制, p27的蛋白表达也随之减少.MTT实验结果发现转染细胞的增殖能力明显提高.结论 应用RNAi技术,可特异性阻断整合蛋白β1的蛋白表达.整合蛋白β1可调节肝癌细胞的增殖,并可能与p27的表达相关.     

抑制STAT3表达增加H_2O_2诱导人胶质瘤U251细胞损伤

目的探讨RNA干涉技术抑制STAT3基因表达对过氧化氢(H2O2)复制的人胶质瘤U251细胞损伤模型的影响。方法转染pSilencer1.0-U6-SiRNA-STAT3重组质粒到U251细胞;Western blot方法观察转染重组质粒对STAT3蛋白表达的影响;MTT法检测细胞生存率,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX表达。结果转染pSilencer1.0-U6-SiRNA-STAT3重组质粒能有效抑制U251细胞STAT3蛋白表达(抑制率50%);抑制STAT3表达能促进H2O2诱导U251细胞生存率下降,增加细胞凋亡率(P0.05)。STAT3抑制能促进H2O2作用下U251细胞BCL-2表达降低,BAX表达增加(P0.05)。结论pSilencer1.0-U6-SiRNA-STAT3可有效抑制U251细胞STAT3的表达,并促进H2O2诱导U251细胞凋亡。     

血管内皮生长因子C靶向RNA干扰重组载体的构建和效应检测

目的:构建针对人血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体,并观察其在胃癌细胞中的干扰效果。方法:实验于2006-02/2007-02在河南省分子医学重点学科开放实验室完成。①实验材料:小干扰RNA表达载体pSilencer3.1为美国Ambion公司产品;胃癌细胞SGC7901为河南省分子医学重点学科开放实验室保存;血管内皮生长因子C基因的干扰片断和聚合酶链反应引物(152bp)由上海生工生物公司合成。②实验过程:根据pSilencer3.1-H1载体要求设计靶向血管内皮生长因子C基因的两对小干扰RNA,退火后连接入载体相应位点,构建重组表达质粒。经酶切和测序鉴定后分别转染胃癌细胞株SGC-7901,经G418筛选,获得稳定表达的细胞株。③实验评估:采用反转录-聚合酶链反应和Westernblot法检测血管内皮生长因子CmRNA和蛋白水平的表达。结果:①重组质粒的酶切、核苷酸序列分析结果:经酶切和测序鉴定证实成功构建了血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体,建立了稳定转染细胞株。②稳定转染的细胞株中血管内皮生长因子CmRNA和蛋白表达:反转录-聚合酶链反应和Western blot显示转染后血管内皮生长因子C表达与对照组相比有不同程度的降低,以pSilencer3.1-neo-VEGF-C1尤为明显,抑制血管内皮生长因子C表达,不影响细胞的生长。结论:成功构建了血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体及稳定转染的胃癌细胞株。