实时荧光PCR技术检测登革病毒的研究

目的：建立登革病毒的荧光定量PCR检测技术。方法：针对1-4型登革病毒3′端非编码区的一段高度保守序列设计引物和探针,建立登革病毒实时荧光PCR检测方法及定量的检测方法。并对10例ELISA法检测为登革病毒阳性的病例,取其发热1-2天的临床血清标本进行荧光定量PCR检测。结果：实时荧光PCR检测1-4型登革病毒均为阳性,该探针和引物是登革病毒检测的通用探针和引物。实时荧光PCR检测10份临床血清,6份为阳性,阳性率为60%。结论：实时PCR方法是一个快速、特异性强、敏感性高的检测登革病毒的方法,适用于登革热的临床早期诊断,具有很好的社会效益和经济效益。     

嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用研究

目的 建立嗜肺巴斯德菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法.方法 针对嗜肺巴斯德菌16SrRNA基因设计特异性引物和探针,建立嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异度、敏感度和稳定性.对2008～2011年采集的1 680份样本进行检测.结果 嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法具有高度特异性,对多杀巴斯德菌、产气巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌均无交叉反应,检测灵敏度达22拷贝.标准曲线显示备浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.488,PCR效率为100％.荧光定量PCR检测1 680份样本,检出137份嗜肺巴斯德菌阳性.该方法可直接从样本中特异性地检出嗜肺巴斯德菌.结论 TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、稳定的特性,适用于嗜肺巴斯德菌的快速检测.     

TaqMan荧光定量PCR检测流感嗜血杆菌和肺炎链球菌方法的建立及应用

目的 建立TaqMan荧光定量PCR检测方法 ,用于流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的检测和鉴别诊断.方法 针对流感嗜血杆菌种属特异性基因bexA和肺炎链球菌种属特异性基因lytA,设计合成引物和TaqMan探针,研究不同引物和探针荧光定量PCR检测的特异性和灵敏度,确定标本检测中循环阈值(Ct)的临界值(cut-off值).将荧光定量PCR、乳胶凝集和细菌培养3种检测方法 同时应用于278份细菌性脑膜炎患者脑脊髓液标本的检测.结果 bexA基因引物和探针能特异性检测流感嗜血杆菌a、b、c、d血清型的菌株,检测灵敏度为每个反应10个基因组DNA拷贝;lytA基因引物和探针能特异性检测肺炎链球菌常见致病的血清型肺炎链球菌菌株,检测灵敏度为每个反应90个基因组DNA拷贝.通过荧光定量PCR方法 ,278份脑脊髓液标本中共检测出 4份流感嗜血杆菌阳性和7份肺炎链球菌阳性,其中各有2份培养出相应的病原菌,另有1份流感嗜血杆菌和2份肺炎链球菌乳胶凝集结果 阳性.结论 TaqMan荧光定苗PCR方法 能特异地检测和鉴定流感嗜血杆菌和肺炎链球菌,具有较高的灵敏度和快速检测的特点,能提高临床流感嗜血杆菌和肺炎链球菌感染患者标本的阳性检出率.     

基于TaqMan探针的幽门螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的探讨基于TaqMan探针的幽门螺杆菌23SrDNA基因片段的实时荧光定量PCR检测的有效方法。方法根据幽门螺杆菌23SrDNA序列设计引物和探针,构建质粒标准品,建立实时荧光定量PCR体系并进行方法学评价,并对2012年5月至10月收集的100份临床样本进行检测同时应用免疫组化及银染方法进行比较分析。结果建立了检测23SrDNA的实时荧光定量PCR方法：107-102copies/ul范围内均有＂S＂型扩增曲线,最低检测浓度为102copies/ul,标准曲线相关系数为1。对临床其它消化道病原体不出现特异性的扩增曲线。对100份样本进行检测,实时荧光定量PCR能检出31份阳性,而免疫组化方法能检出25份阳性,银染方法能检出28份阳性。结论实时荧光定量PCR方法可成功检测幽门螺杆菌,且该方法具有灵敏度和特异性高及重复性好等优点。     

寨卡病毒荧光定量PCR检测方法的建立与验证

目的建立基于一步法实时荧光定量PCR技术的寨卡病毒检测方法。方法通过分析寨卡病毒全基因组核酸序列,根据其NS5基因片段,设计特异性引物,构建重组质粒,经体外转录后获得寨卡病毒RNA,即阳性标准品,建立标准曲线,利用RT-PCR方法对检测体系做灵敏性、重复性试验,以寨卡病毒GZ01毒株与Huh7.5.1细胞RNA混合或加入寨卡病毒的血浆标本对本方法测试。结果建立的标准曲线线性关系良好,灵敏度较高,检测下限可达0.1 PFU/mL,标准曲线方程:Y=-3.353X+36.345,相关系数(CV)可达0.999。该方法特异性较好,对登革病毒和丙肝病毒核酸检测无交叉反应,可检出寨卡病毒感染的细胞样品和血浆样品中的寨卡病毒。结论成功建立了1种基于实时荧光定量PCR的寨卡病毒核酸检测的高灵敏性方法。     

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR法检测幽门螺杆菌

目的建立TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测幽门螺杆菌(HP)的方法。方法针对HP cagA基因设计特异性引物和探针,建立TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异性、灵敏度和重复性。用该法对肝癌、肝硬化患者腹水及全血,猪、金黄地鼠、猴、犬、兔、豚鼠、大鼠、小鼠的全血、粪便、肠共1 201份标本进行检测,同时作常规细菌分离和测序分析。结果本方法特异性为100%,最低可检测2.2×101copies/μL的质粒DNA。标准曲线表明其具有良好线性关系,回归方程为:Y=-3.306X+38.633,相关系数(r)为0.999,扩增效率为100.648%。批内相对标准偏差(RSD)为0.19%～1.2%,批间RSD为0.14%～3.4%,RSD均<5%。上述1 201份标本用本法检出HP阳性130份,常规细菌分离法仅检出2份HP阳性。测序结果表明,与GenBank中收录的HP序列同源性为99%～100%。结论建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR法特异性和灵敏度高,重复性良好,适用于HP感染的检测。     

肺炎链球菌TaqMan实时荧光定量PCR的建立及临床应用

目的：建立TaqMan实时荧光定量PCR检测肺炎链球菌的方法,应用于临床儿童社区获得性肺炎（CAP）标本的快速筛查。方法根据 GenBank公布的肺炎链球菌自溶酶基因（lytA）设计引物和探针,建立实时荧光定量 PCR,并对体系进行优化;同时以痰培养法做双盲对照,应用于1504份 CAP患儿标本检测。结果 TaqMan实时荧光定量 PCR菌液的最低检出限可达18.75 cfu/PCR,无交叉反应,特异度好;对1504份儿童CAP标本检测,141份肺炎链球菌实时荧光定量PCR阳性,其中140份肺炎链球菌痰培养阳性,该方法灵敏度为100％,特异度为99.93％。从样品处理到结果报告仅需2.5 h。结论 TaqMan实时荧光定量PCR快速、简便、灵敏度高、特异度强,可用于儿童CAP中肺炎链球菌的初筛和指导抗生素的的合理使用。     

应用TaqMan实时荧光-聚合酶链反应方法快速检测粪便标本空肠弯曲菌的研究

目的建立空肠弯曲菌TaqMan实时荧光-PCR方法,用于粪便标本的直接检测。方法根据空肠弯曲菌特异性基因hipO和mapA分别设计引物和探针,在对2组引物和探针进行灵敏度、特异性和重复性评价的基础上,对45例临床腹泻患者粪便标本提取DNA之后,荧光PCR检测,同时进行分离培养。 结果两组引物和探针能准确检测空肠弯曲菌菌株2株,检测限可达到10~20 cfu/ml,并与其他肠道致病菌无交叉反应。检测45份腹泻病例粪便标本,该方法检测到3份为阳性,同时进行的传统培养方法仅从该3份标本中的两份中分离到空肠弯曲菌。 结论本研究建立的TaqMan荧光PCR检测粪便标本中所携带的空肠弯曲菌灵敏度高,特异性好,能够提高粪便中空肠弯曲菌的阳性检出率和缩短检测时限。     

双重荧光定量PCR检测西尼罗病毒和基孔肯雅病毒

摘要：目的：建立同时检测西尼罗病毒（WNV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）的双重荧光定量PCR法,为临床疑似病例的诊断提供依据。 方法：分别针对WNV CAP基因、CHIKV E1基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立并优化双重荧光定量PCR反应体系,评价方法的特异性和灵敏度。 结果：建立的双重荧光定量PCR可同时检测WNV、CHIKV核酸,标准曲线相关系数（r）分别达0.999、0.998,灵敏度达10 copies/μL,具有良好的特异性。 结论：建立了同时检测WNV、CHIKV的双重荧光定量PCR法,但尚需临床进一步验证。     

空肠弯曲菌 TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量 PCR快速检测

目的　开发一种特异、灵敏的TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 方法,用于空肠弯曲菌的快速定量检 测。方法　针对空肠弯曲菌鞭毛蛋白A 和马尿酸酶基因设计特异性引物和探针,建立一种新型TaqMan-MGB 双重探针 实时荧光定量PCR 检测空肠弯曲菌方法,对该方法的定量检测线性范围、特异度、灵敏度、重复性、稳定性进行评价, 应用该方法对临床标本中的空肠弯曲菌进行检测,同时用细菌培养、普通PCR、基因克隆和测序鉴定。结果　建立的 空肠弯曲菌TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 检测方法专属性强,能准确检出空肠弯曲菌,而与其他细菌无交 叉反应,特异度为100%。该技术灵敏度高,能精确定量检测空肠弯曲菌DNA 线性范围达10 个数量级,最低检测限为 4 个菌落形成单位。重复性和稳定性良好,组内和组间相对标准偏差均小于1%。应用该方法成功从78 例临床标本中定 量检出28 例空肠弯曲菌阳性标本,用普通PCR 和基因克隆测序分析确认,细菌培养方法仅获得6 株存活的空肠弯曲菌。 结论　TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 具有快速简便、可靠稳定、特异灵敏的优点,可用于临床标本中空肠 弯曲菌定量检测,值得推广应用。     

三种不同检测方法对婴幼儿丙型肝炎病毒感染的诊断价值

目的探讨不同检测方法对婴幼儿丙型肝炎病毒感染诊断结果的影响。方法对66例ELISA法检测抗HCV阳性孕妇所生婴幼儿血清,分别用ELISA法检测抗HCV和HCV-cAg,用荧光定量PCR法检测HCV-RNA,并对结果对比分析。结果 66例婴幼儿血清中,61例抗HCV阳性,阳性率92.4%;9例HCV-cAg阳性,阳性率13.6%;11例HCV-RNA阳性,阳性率16.6%。结论抗HCV检测阳性率过高,且有可能漏诊。建议采用HCV-RNA检测和HCV-cAg综合诊断婴幼儿HCV感染。     

浙江省义乌市登革病毒核酸及IgM抗体检测结果分析

目的对浙江省义乌市义亭镇等部分辖区内登革热疑似病例及其周围人群(未发病)进行登革病毒核酸及IgM抗体检测,及时查找病原,明确病因,为登革热疫情的防制工作提供技术支持。方法分别用实时荧光定量PCR法检测登革病毒核酸和ELISA法检测登革病毒IgM抗体。结果登革热疑似病例血清标本98份,检出登革3型病毒核酸阳性标本57份,阳性检出率为58.16%(57/98);发病后1~3 d采血与4~6 d采血进行核酸检测,阳性检出率差异有统计学意义(χ2=6.6147,P0.05);登革病毒核酸检测阴性标本进行登革病毒IgM抗体检测,阳性检出率为56.10%(23/41);病例周围人群监测登革病毒IgM抗体,阳性检出率为22.73%(83/365)。结论此次传染病疫情由登革3型病毒引起,实时荧光定量PCR法更适合登革病毒感染者的早期诊断。周围人群中存在登革病毒隐性感染者。     

拟输血手术患者混合血清样本丙型肝炎病毒核酸检测分析

目的 探讨不同数量混合血清样本丙肝病毒核酸(HCV RNA)检测在拟输血手术患者中的临床应用.方法 用酶联免疫吸附试验(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)检测单份血清样本抗-HCV,聚合酶链反应技术(polymerase chin reaction,PCR)检测单份血清样本、...     

HCV胶体金法与ELISA法在输血前检测丙型肝炎抗体中的效果比较

目的：HCV胶体金法与ELISA法用于输血前检查丙型肝炎抗体检测的应用效果比较。方法：分别采用ELISA法和胶体金法对我院576名受血者的血清样本进行HCV-抗体检测,对两种检测方法的检测效果及检测用时及成本预算进行综合比较。结果：ELISA法阳性检测率高于胶体金法,但比较差异无统计学意义（P〉0．05）;经胶体金法和ELISA检测为阳性的血清样本再使用RT—PCP．荧光定量法检测,胶体金法的检测符合率达到100％,显著高于ELISA法（P〈0．05）;胶体金检测法所需检测时间短且检测所需成本更低。结论：与ELISA法比较,胶体金法用于检测丙型肝炎病毒的假阳性率更低,操作更方便,成本花费低,值得临床推广应用。     

丙型肝炎病毒抗体检测试剂在高危人群中的应用评价

目的 对研制的丙型肝炎病毒（HCV）抗体检测试剂（双抗原夹心法）在高危人群中的应用进行评价，并与间接法进行比较。方法 收集河北省固安县丙型肝炎高发地区A村38份、B村47份，共85份样品，采用研制的抗-HCV检测试剂（双抗原夹心法）及间接法同时测定样品抗-HCV，对检测结果不符的样品用HCV-RIBA补充试剂进行确认。结果 85份样品中，间接法检测阳性76份（89．41％），阴性9份；双抗原夹心法检出阳性73份（85．88％），阴性12份。有3份间接法检测弱阳性，而双抗原夹心法检测为阴性，经HCV-RIBA补充试剂确认2份为阴性，1份仅1条带阳性，再经病毒核酸定量检测为（1．2～4．8）×10^2copies／ml，HCVRNA测定为阴性。结论 研制的双抗原夹心法抗-HCV检测试剂的灵敏度与间接法相同，特异性优于间接法。     

多重定量PCR法同步检测HBV、HCV和HIV-1在血液筛查中的优化及应用

目的 初步探讨多重定量聚合酶链反应（PCR）同步检测乙型肝炎病毒（HBV） DNA,丙型肝炎病毒（HCV） RNA及人类免疫缺陷病毒（HIV）-1 RNA在血液筛查中的应用前景.方法 选择2012年8月至12月,于孝感市中心血站志愿献血的合格献血者血样中,经2次酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBV表面抗原（HBsAg）、抗HCV及抗HIV-1,检测结果均呈阴性的4 800份血样为研究对象.采用全自动核酸混合提取仪对该4 800份血样进行核酸提取,然后利用多重定量PCR方法对血样中HBV、HCV及HIV-1进行同步扩增检测.采用中国药品和生物制品检定所提供的HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA标准参考品,检测多重定量PCR的灵敏度,并与单重定量PCR的灵敏度进行比较.在HBV、HCV及HIV-1 3者中任意1种病毒基因组浓度较高的条件下,对多重定量PCR检测另2种低浓度病毒基因组的能力进行评估.结果 增加多重定量PCR中c-MMLV逆转录酶和Hot Taq酶的用量,并适量加入单链结合蛋白（SSB）,可使其扩增效率提升至单重定量PCR扩增水平.本组4 800份血样中,经多重定量PCR检测出3份HBV DNA阳性样品,ELISA漏检率为0.062 5％,未发现HCV RNA和HIV-1 RNA阳性样品;多重定量PCR检测HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA在95％置信区间的灵敏度浓度分别为115 IU/mL、376 IU /mL和232 IU /mL;单重定量PCR检测HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA在95％置信区间的灵敏度浓度分别为51 IU /mL、94 IU /mL和78 IU/mL.结论 本研究初步建立了对献血者血液同时进行HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA检测的多重定量PCR检测方法;该检测体系经过进一步优化后,有望应用于临床大规模血液病毒筛查.     

两种试剂检测抗-HCV在丙型肝炎诊断中的意义

目的提高丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）检出率和检测结果的准确率。方法应用两个厂家抗-HCV ELISA试剂（试剂①、②）检测本院2006年1～12月间2516份输血、手术前住院患者血清标本。再将试剂①、②均阳性的血清标本28份、仅试剂①阳性的15份和仅试剂②阳性的17份血清标本进行HCV RNA RT—PCR荧光定量检测。结果试剂①、②抗-HCV均阳性28份标本的RT—PCR结果均阳性,仅试剂①抗-HCV阳性的15份标本中2份阳性,试剂②抗-HCV阳性的17份标本中3份阳性;仅试剂①或②抗-HCV阳性的32份血清标本中,HCV RNA RT—PCR检测阳性率为15．63％。结论采用双试剂检测能提高抗-HCV的检出率和结果的准确率。     

Analysis of cross-reactivity among flaviviruses using sera of patients with dengue showed the importance of neutralization tests with paired serum samples for the correct interpretations of serological test results for dengue

Dengue is a febrile illness caused by the dengue virus (DENV) that belongs to the genus Flavivirus in the family Flaviviridae. Cross-reactivity between flaviviruses poses a challenge while interpreting serological test results. In the present study, the cross-reactivity of sera of the patients with dengue, who traveled from Japan to DENV-endemic countries, was analyzed by using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and neutralization test (NT). Sixteen serum samples were collected from patients with dengue and were tested for: i) IgM antibodies against Zika virus (ZIKV), West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis virus (JEV), and tick-borne encephalitis virus (TBEV) using IgM ELISA, ii) IgG antibody against TBEV using IgG ELISA, and iii) neutralizing antibody against ZIKV, WNV, TBEV, and JEV. Among the 16 samples tested using ELISA, seven samples were IgM-positive for at least one of the other flaviviruses, and nine samples were IgG-positive for TBEV. Neutralizing antibody titers (NATs) against ZIKV, WNV, and TBEV were one-fourth or lower than those against the causative DENV in all samples. The NATs against JEV were one-fourth or lower than those against the causative DENV in six convalescent-phase serum sample among the seven convalescent-phase serum samples. The NAT against DENV of the residual one convalescent-phase serum was similar to that against JEV and that against JEV of its relevant acute-phase serum sample. These results showed that NTs with paired serum samples are important to correctly interpret the serological test results for DENV.