实时荧光RT-PCR法快速检测三带喙库蚊中的流行性乙型脑炎病毒

目的从四川省成都地区采集三带喙库蚊样品,快速检测蚊虫中的流行性乙型脑炎病毒(JEV),并确定JEV基因型别。方法采用实时荧光RT-PCR方法检测蚊体内的JEV。利用一步法RT-PCR试剂盒扩增阳性样品Pr M区段特异性核苷酸序列,测序后应用Clustal X1.83和Mega 5.0软件构建系统进化树,并进行基因分型和同源性分析。结果 2012年采集三带喙库蚊雌蚊10 656只,分为219份,检测出7份JEV阳性核酸样品,阳性率为3.2%。扩增Pr M区域特异性核苷酸序列674 bp,经鉴定均为基因Ⅰ型。与国内外部分GⅠ型的相关序列比较,核苷酸同源性为91.5%~100%,氨基酸同源性为94.9%~100%,其中与四川省SC09-X08株同源性最高。结论实时荧光RT-PCR法能快速检测三带喙库蚊中的JEV,成都地区存在基因Ⅰ型JEV流行。     

深圳市龙岗区蚊虫自然感染流行性乙型脑炎病毒状况调查

目的 研究深圳市龙岗区蚊虫流行性乙型脑炎病毒自然感染状况,为预测该地区乙脑发病趋势及流行强度,制定有效预防控制措施提供科学依据.方法 采用灯诱法捕捉蚊虫标本并进行分类鉴定,以JEV的NS3基因区段设计特异引物,通过实时荧光RT-PCR (real-time RT-PCR)对蚊虫中流行性乙型脑炎病毒进行检测,阳性标本经测序后再在GenBank中进行核苷酸序列的同源性比对.结果 捕获的蚊虫隶属3属5种,致倦库蚊是优势蚊种;1 533只蚊虫分成25批,从3批致倦库蚊标本中检出JEV核酸阳性,阳性率为12％.阳性标本与GenBank中报道的JEV参考株间相应的核苷酸序列同源性达99％以上,均属于JEV Ⅰ型病毒.结论 龙岗区存在着蚊虫自然感染JEV,致倦库蚊是区内乙脑传播的主要蚊媒,有流行人间和畜间流行性乙型脑炎的潜在危险,提示应进一步完善疫苗接种和免疫监测,积极开展消除蚊虫孳生地,灭蚊、防蚊工作,以控制和切断乙脑传播途径.     

浙江省蚊媒携带流行性乙型脑炎病毒的分布特点

目的 了解浙江部分地区蚊媒及猪携带流行性乙型脑炎(乙脑)病毒情况以及浙江省存在的乙脑病毒基因型别.方法 于2007年5月至10月在浙江省仙居、龙泉和慈溪3个县人房及猪舍采集蚊虫标本和猪血清,共采集10 662只蚊虫和204份猪血清,蚊虫标本中以淡色库蚊和中华按蚊为主.利用病毒分离和荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测蚊虫携带乙脑病毒,应用酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)方法对猪血清进行抗体检测.应用荧光定量RT-PCR方法对细胞分离株进行病毒鉴定;利用RT-PCR方法扩增新分离乙脑病毒PrM基因,并对细胞分离到的病毒进行基因分型.结果 在蚊虫标本中检出7批乙脑病毒核酸阳性样本,并分离出3株病毒,经鉴定3株病毒均为乙脑病毒,基因分析表明3株病毒均属于基因Ⅰ型乙脑病毒.猪血清有121份阳性,总阳性率为59.3%.6月份有50%以上的猪血清中乙脑病毒抗体呈阳性.结论 浙江省部分地区存在着乙脑的传播媒介,在蚊媒和猪中携带有乙脑病毒;采集的蚊虫标本中分离到3株病毒,经鉴定为基因Ⅰ型乙脑病毒,是近年来在浙江省首次分离到的基因Ⅰ型乙脑病毒.     

湖北省荆门市2022年蚊虫流行性乙型脑炎病毒携带调查

目的 了解湖北省荆门市蚊虫流行性乙型脑炎(乙脑)病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)携带状况。方法 2022年7-8月在荆门市3个镇/街道选取7个点采集蚊虫标本，采用形态学方法鉴定蚊虫种类，采用实时荧光定量聚合酶链反应检测JEV核酸，计算蚊种的批阳性率和最低现场感染率，采用逆转录聚合酶链反应对JEV的E基因进行扩增和序列分析。结果 共采集4 920只蚊虫标本，其中致倦库蚊、白蚊伊蚊、骚扰阿蚊、中华按蚊分别占56.10%、41.46%、1.83%、0.61%;仅2批次致倦库蚊的JEV核酸检测阳性，批阳性率、最低现场感染率分别为6.67%(2/30)、0.07%(2/2 760)。2株JEV分离株均为基因Ⅰ型，与中国浙江省和陕西省分离株亲缘关系最近。结论 调查地区2022年蚊虫标本JEV携带率较低，蚊虫中存在基因Ⅰ型JEV循环。需持续开展蚊种JEV监测，警惕乙脑流行风险。     

辽宁省乙型脑炎病毒分离及进化树分析

目的 分离鉴定2007年辽宁省蚊虫携带流行型乙型脑炎(乙脑)病毒及基因型别.方法 用细胞培养方法分离病毒,对致金黄色地鼠肾细胞系(BHK-21)细胞病变(CPE)的病毒进行逆转录-聚合酶链式扩增(RTPCR)检测;扩增的目标片段进行序列测定;用Mega3.1软件、以邻位相连法构建进化树.结果 共分离到22株病毒,RT-PCR检测结果表明,均为乙型脑炎病毒;随机选择其中3株病毒的基因序列进行基因型鉴定分析,均为Ⅰ型乙型脑炎病毒.3株病毒E基因编码结构域(Domain)区段分析结果显示,其核苷酸和氨基酸同源性分别为99.3%和100%;与疫苗株SA14-14-2的Domain区相比,共有12个氨基酸位点变异.结论 辽宁省蚊虫标本中分离的病毒均为基因Ⅰ型乙型脑炎病毒,其中E基因所编码Domain区E-327(S→T)位点发生的变异,提示在辽宁省首次分离到乙型脑炎病毒变异株.     

中国滇西北地区分离流行性乙型脑炎病毒的分子特征研

目的 对中国滇西北地区分离的流行性乙型脑炎(乙脑)病毒进行分子特征研究,了解与云南省内其他地区病毒株的差异.方法 用RT-PCR的方法扩增滇西北地区分离的13株乙脑病毒PrM、E片段和3'非编码区,对扩增产物进行序列测定.用Clustal 1.8X、DNASTAR、GENEDOC等生物学软件进行核苷酸序列和系统进化分析.结果 基于PrM和E基因核苷酸序列的系统进化显示,滇西北分离的13株乙脑病毒中有12株属于基因Ⅰ型,1株为基因Ⅲ型;12株基因Ⅰ型乙脑病毒与云南省其他地区分离的病毒株处于不同分支;和云南省其他地区分离株之间E基因核苷酸序列差异度为0.2%～13.9%;3'非编码区存在两种核苷酸缺失情况,基因Ⅰ型毒株在终止密码子后出现3处缺失,而基因Ⅲ型毒株只有1处缺失.结论 滇西北地区乙脑病毒分离株以基因Ⅰ型为主,E基因核苷酸序列与云南省其他地区分离株差异不明显;基因Ⅰ型毒株在3'非编码区存在3处缺失,而基因Ⅲ型毒株则只有1处缺失.     

山西省临猗县2009年流行性乙型脑炎媒介调查

目的 了解临猗县4个乡镇蚊虫种类、密度及其自然感染流行性乙型脑炎（乙脑）病毒状况。方法 采用诱蚊灯捕蚊,提取蚊虫核酸进行RT-PCR,扩增乙脑病毒NS1区核酸片段,对核酸阳性样本进行序列测定。结果 捕获蚊虫4属6种4424只,三带喙库蚊构成比为52.0%,淡色库蚊为41.2%,中华按蚊及其他蚊种数量较少。6-8月蚊虫密度逐月增加,三带喙库蚊构成比逐月增高。对2109只三带喙库蚊分77批进行乙脑病毒核酸检测,阳性10批。对5个阳性标本进行测序,经与GenBank中序列比对和分析,均为基因Ⅰ型乙脑病毒。结论 临猗县7、8月蚊虫密度高,三带喙库蚊构成比及其乙脑病毒携带率均较高。三带喙库蚊密度及乙脑病毒携带率可作为乙脑防控的重要预警指标。     

荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸.方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度.此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测.结果该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01 TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右.结论本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法.     

广州市1起诺如病毒急性胃肠炎暴发的实验室检测

目的确定1起学校急性胃肠炎暴发原因。方法采集病例粪便标本,直饮水标本,采用实时荧光定量(Real-time)PCR和RT-PCR方法检测病毒核酸,阳性标本测序分析。结果 5份粪便标本中3份呈诺如病毒阳性,2份直饮水标本均呈诺如病毒阳性。3份病例粪便标本病毒株核苷酸序列一致,均为GⅡ-4型,提示病毒同源。结论对诺如病毒进行核酸检测,证实该疫情为一起诺如病毒GⅡ-4型引起的急性胃肠炎暴发。     

一步法流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量反转录聚合酶链反应方法的建立及应用

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的荧光定鼍RT-PCR方法.方法 根据GenBank登录的乙脑病毒毒株序列,应用生物软件在乙脑病毒基因的保守区设计与筛选引物和探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性.并通过对蚊虫样本的检测,以评价该方法的实际应用价值.结果 优化结果表明荧光定量RT-PCR的最佳反应体系为0.1 μmol/L探针浓度,0.2μmol/L引物浓度,5 mmol/L Mg2+浓度.结果 表明该方法对乙脑病毒的检测有高度的特异性、通用性,对1～4型登革热病毒、狂犬病毒、汉坦病毒(SEO型与HTN型)均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1 TCID50,重复性分析表明同一样品Gt值的重复检测4次,其标准差均在合理范围内,分别为0.033、0.079、0.149和0.411.对110批蚊虫标本进行荧光定量RT-PCR检测和病毒分离榆测,结果荧光定量RT-PCR检测出7份阳性,而病毒分离则只检测出3份阳性,表明建立的荧光定量RT-PCR方法更敏感,可直接从蚊虫样本中检测乙脑病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右,且操作简便、敏感性高.结论 研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于乙脑病原学的快速检测.     

广西流行性乙型脑炎E基因分子流行病学分析

目的 了解广西流行性乙型脑炎(乙脑)病毒E基因特征和遗传变异状况.方法 采集不同地区蚊虫标本12 102只,进行乙脑病毒分离,阳性分离物进行乙脑E基因编码区核苷酸序列测定、序列同源性比较和遗传进化分析.结果 共分离到乙脑病毒4株,均属于基因Ⅰ型乙脑病毒;核苷酸同源性在98.3％ ～ 99.3％,氨基酸序列同源性99.4％ ～ 99.8％,核苷酸序列变异主要为沉默突变;与越南毒株核苷酸和氨基酸的同源性最大,分别为99.7％和100％;与乙脑减毒活疫苗株SA14-14-2的核苷酸同源性为87.4％ ～ 88.0％,氨基酸同源性为96.8％～97.2％,决定病毒毒力的8个重要位点均存在差异;影响病毒毒力的关键氨基酸位点均未发生变异.结论 广西分离的4株乙脑病毒的影响病毒毒力的关键氨基酸位点均未发生变异,与疫苗株比较,决定病毒毒力的8个重要位点存在差异.     

山东省首次分离出基因1型流行性乙型脑炎病毒

目的从山东省济南市采集的蚊虫标本中分离流行性乙型脑炎（乙脑）病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）,并确定其基因型别及前膜蛋白（Precursor Membrane,PrM）基因片段和包膜蛋白（Envelope,E）基因区段分子特征。方法对2008年采集的蚊虫标本进行病毒分离,对新分离的病毒进行血清学及分子生物学鉴定。逆转录-聚合酶链反应扩增新分离JEV的PrM、E区段核苷酸序列,测序后应用Clustal X（1.83）软件做碱基配对分析,MEGA3.1完成病毒进化分析,GENEDOS（3.2）软件完成氨基酸位点分析。结果共采集15700只蚊虫标本,包括库蚊、骚扰阿蚊、伊蚊、按蚊。随机抽取20批标本,从其中的1批三带喙库蚊标本中分离到1株病毒,经过血清学及分子生物学鉴定属于基因1型JEV。新分离JEV与减毒活疫苗株SA14-14-2株E区段核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为88.0%和97.2%,存在14处氨基酸位点差异。结论从山东省首次分离到基因1型JEV。     

乙型脑炎病毒微滴式数字 PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,用于乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)的核酸检测。方法 设计特异性扩增JEV的引物探针并优化条件建立ddPCR检测方法,检测其他病毒核酸,观察有无交叉反应判断其特异性。用实时荧光定量PCR(qPCR)与ddPCR法分别对梯度稀释后JEV体外转录核酸进行检测以评价方法的敏感性;用不同浓度的病毒核酸进行独立重复实验以评价方法的重复性;用乙型脑炎IgM抗体阳性标本评价临床标本,健康人血清用于阴性验证。结果 本法检测与其他病毒核酸无交叉反应;RT-qPCR和RT-ddPCR方法对JEV的最低检出限分别为10⁰和10^-1,对应分别为6.73 copies/μL和0.75 copies/μL;各浓度检测拷贝数变异系数均在2.0%以下,检出率为100.0%;12份乙型脑炎IgM抗体阳性标本中检出7份阳性(58.3%),健康人血清的阴性率为100.0%。结论 本研究建立的RT-ddPCR检测JEV方法有较好的特异性、敏感性、重复性和临床标本适应性,可作为乙型脑炎病...     

湖州市乙型流感病毒HA1基因分析

目的:了解湖州市乙型流感病毒的基因变异情况和WHO推荐流感疫苗株对湖州市人体的保护情况。方法:采集类流感样本进行流感病毒的分离和鉴定,并对分离到的乙型流感病毒进行核酸的提取,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒基因后进行病毒血凝素HA1。基因核苷酸序列测定,用DNAMAN和MegAlign生物软件对测序结果进行分析处理,并与WHO推荐疫苗株基因进行比对。结果:分离到的毒株为Victoria系的乙型流感病毒,未发现核苷酸的丢失和插入,糖基化位点没有太大改变。毒株HA1区域的核苷酸序列长度为1015 bp,推导的氨基酸序列长度为339个,相比Yamagata系毒株在163位上都多1个天冬酰胺(N)。结论:2010年WHO推荐乙型流感疫苗株与湖州市的流行株为同一谱系毒株,预防保护效果较好。     

RT-PCR对青岛市小学生乙型流感病毒Victoria系暴发的检测

目的分析青岛地区乙型流感暴发的流行病学特征,探讨RT-PCR方法对乙型流感病毒暴发的诊断价值,并对疫情控制措施做出评价。方法采集暴发性疫情流感样病例的咽拭子,采用QIAGEN试剂盒提取病毒RNA,RT-PCR方法分别扩增甲型和乙型流感病毒核酸的特异片段,然后,对核酸检测阳性标本采用狗肾传代细胞(MDCK)细胞培养,红细胞凝集抑制试验对培养的病毒进行鉴定和分型。结果采集的18份咽拭子中15份乙型流感病毒核酸检测呈阳性,但甲型流感病毒未检出;15份乙型流感病毒核酸阳性标本经MDCK细胞培养,9份标本发生细胞病变,经鉴定和分型,毒株均属于乙型流感病毒Victoria系。结论 RT-PCR方法对乙型流感病毒暴发的检测具有快速、敏感和高度特异性的特点,WHO推荐的2008-2009年流感疫苗成分中乙型流感病毒株(B/Florida/4/2006)为Yamagata系,而青岛地区暴发的流感为乙型流感病毒Victoria系,提示在今后决定我国疫苗成分时是否应考虑地区流行的特点。     

浙江省部分地区2009--2010年蚊媒中乙型脑炎病毒分子流行病学特征研究

目的 了解浙江省部分地区蚊媒携带流行性乙型脑炎(乙脑)病毒(JEV)情况及其分子流行病学特征.方法 2009-2010年7-8月从浙江省慈溪市和仙居县乙脑监测点采集蚊13620只,利用荧光定量PCR方法检测蚊中JEV核酸,用BHK-21细胞分离病毒,扩增JEV分离株E基因,然后选择6株进行测序并进行同源性分析.结果 慈溪和仙居监测点蚊中JEV带病毒率分别为17.0％(27/159)和3.4％( 1/29);从2010年143批蚊中分离到22株JEV,分离率为15.4％.6株测序株E基因全长均为1500个核苷酸(nt),推导编码500个氨基酸(aa),未发现nt插入和丢失,nt和aa同源性分别为99.2％～ 99.8％和100.0％,与浙江省2007-2008年JEV分离株的nt和aa同源性分别为99.1％～99.3％和99.2％～ 99.8％,与乙脑疫苗株SA14-14-2同源性分别为87.6％～88.0％和97.8％.E基因进化树显示,6株测序株位于基因Ⅰ型分支上.结论 浙江省慈溪市和仙居县监测点蚊媒携带JEV,其中慈溪监测点蚊媒中乙脑带病毒率明显高于仙居监测点,JEV分离株均为基因Ⅰ型.     

辛德比斯病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的建立辛德比斯病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。方法人工合成辛德比斯病毒特异性核酸序列作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR引物、探针并构建反应体系,对反应条件进行优化,验证该方法的特异性、灵敏度。结果建立的辛德比斯病毒实时荧光RT-PCR检测方法对辛德比斯病毒核酸检测有高度特异性,与1~4型登革病毒、流行性乙型脑炎病毒和基孔肯雅病毒均无交叉反应,检测灵敏度为103拷贝/反应。结论该方法灵敏度高、特异性强,适用于对辛德比斯病毒的快速检验。     

天津市首次从淡色库蚊检测出基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒

目的调查天津市部分地区蚊虫携带流行性乙型脑炎(乙脑)病毒状况,为乙脑防治提供依据。方法 2010年7-9月,使用灯诱法,每月在天津市5个区(县)采集蚊虫2次,用RTPCR检测乙脑病毒核酸;扩增的目标片段进行序列测定;用Mega 4.0软件以邻位相连法构建进化树。结果共捕获成蚊10285只,2属3种(淡色库蚊、三带喙库蚊、中华按蚊),一组淡色库蚊样品,经分子生物学鉴定呈乙脑病毒感染阳性,命名为TJ01(HQ718463),基因分型为Ⅰ型乙脑病毒。结论天津市蚊虫中存在基因Ⅰ型乙脑病毒感染,与上海市乙脑病毒分离株进化关系较近。     

浙江省蚊虫中乙型脑炎病毒的分离及鉴定

目的 对2007年浙江省采集的蚊虫标本进行病毒分离与鉴定.方法 2007年在浙江省采集蚊虫标本,用金黄地鼠肾细胞(BHK-21)分离病毒,对新分离的病毒进行血清学和分子生物学鉴定.结果 采集到4735只蚊虫,分离到2株致BHK-21细胞病变的病毒,经免疫荧光和RT-PCR试验鉴定为乙型脑炎病毒(JEV),利用病毒PrM区段进行基因分型分析,新分离的2株病毒属于基因Ⅰ型JEV.对这2株病毒的E基因区段进行分析,核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.0%和98.8%.与疫苗株SA14-14-2相比,核苷酸同源性在87.7%,氨基酸同源性在96.4%以上,共有14个共同的氨基酸位点差异.结论 在浙江省采集的蚊虫标本中分离到2株病毒,经鉴定为基因Ⅰ型JEV,是浙江省近年来首次分离.     

安徽省诺如病毒G II.4/Sydney 2012变异株分子特征分析

目的了解安徽省某高校一起急性胃肠炎暴发疫情的病原体基因分型和分子特征。方法采用实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)对6份粪便/肛拭子标本检测诺如病毒核酸,检出的阳性标本经传统RT-PCR扩增衣壳蛋白区(ORF2)部分序列、基因测序和型别鉴定,利用Clustal X 2.0和Mega 6.0软件对测定序列进行核苷酸同源性比对和构建基因进化和亲缘性关系树。结果检出4份标本诺如病毒核酸阳性,阳性率为66.67%(4/6);基因序列比对和进化亲缘性关系显示:诺如病毒基因型为GII.4型;2毒株序列之间核苷酸同源性为100%;与2014~2015年上海株、香港株核酸同源性最高,均为100%;与2012澳大利亚Sydney株(JX459908)同源性为99.6%;与上海和香港两地区毒株亲缘性关系最近,聚为独立一簇,同属GII.4/Sydney 2012分支。结论引发该起急性胃肠炎暴发的病原体为GII.4型诺如病毒,且属于GII.4 Sydney 2012变异株。