整合素αvβ6在胃癌AGS细胞增殖和凋亡中的作用

目的：研究整合素αvβ6在胃癌AGS细胞增殖和凋亡中的作用。方法：用单克隆抗体10D5封闭AGS细胞表面αvβ6功能,并采用10D5的阴性对照剂鼠IgG2a处理细胞作为阴性对照。MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Westernblot检测caspase-3蛋白的表达情况。结果：用10D5封闭αvβ6后,10D5组AGS细胞的存活率较对照组和IgG2a组下降,而凋亡率和caspase-3的表达水平则增加,差异均有统计学意义（P〈0.05）。IgG2a组与对照组相比差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：整合素αvβ6表达促进胃癌AGS细胞增殖并抑制其凋亡。     

表皮生长因子信号通路对前列腺癌细胞DU145表面整合素α5、β1的调控

目的 探讨表皮生长因子（EGF）信号通路对雄激素非依赖型前列腺癌细胞系DU145表面整合素α5、β1的调控.方法 应用流式细胞术、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western蛋白印迹（Western blot）法测定EGF、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路抑制剂PD98059对DU145细胞整合素α5和β1表达的影响;采用细胞粘附能力测定和Transwell小室法检测EGF及PD98059对DU145细胞粘附能力和迁移能力的影响.结果 EGF上调DU145细胞表面整合素β1亚基的蛋白和mRNA的表达,分别为对照组的231%和248%（方差值为9.0和24.6,P均＜0.01）,并可促进DU145细胞对纤维连接蛋白（Fn）的粘附和迁移能力.而PD98059则具有相反的作用,下调DU145细胞表面整合素β1亚基的蛋白和mRNA的表达,分别为对照组的60%和63%（方差值为6.3和15.3,P均＜0.01）,并可抑制DU145细胞对Fn的粘附和迁移能力.EGF和PD98059对整合素α1的表达无明显影响.结论 EGF可能通过MAPK信号通路上调前列腺癌DU145细胞表面整合素β1亚基的表达,从而促进DU145细胞对Fn的粘附能力和迁移能力;此调节作用主要发生在mRNA转录水平.     

吗啡对人胃癌MGC-803细胞caspase-3表达的影响

目的观察吗啡对人胃癌MGC-803细胞凋亡及caspase-3表达的影响。方法胃癌MGC-803细胞分为两组:对照组和吗啡组。对照组不加任何药物,吗啡组将吗啡加入细胞培养液中使吗啡终浓度为0.1μmol/L。孵育24h后应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测胃癌MGC-803细胞中caspase-3基因mRNA和蛋白的表达情况。结果吗啡组胃癌细胞凋亡率为(17.20±2.95)%,明显高于对照组的(11.40±2.86)%(P<0.05)。RT-PCR和Western blot结果显示,吗啡组胃癌MGC-803细胞中caspase-3mRNA和蛋白表达增加。结论 0.1μmol/L吗啡通过增加caspase-3的表达而促进胃癌细胞的凋亡。     

整合素αvβ6调控结肠癌细胞转录因子Ets-1表达的分子机制研究

目的:探讨整合素αvβ6对核转录因子Ets-1表达的影响,明确αvβ6-ERK2直接连接在该过程中发挥的作用。方法:流式细胞仪检测各结肠癌SW480细胞表面αvβ6的表达;采用Westernblotting法分别检测ERK表达、活化水平和Ets-1的表达水平。结果:SW480β6和SW480β6Del.mutant细胞均表达αvβ6;SW480β6细胞Ets-1的表达量较SW480细胞明显增多(P<0.05),同时ERK的磷酸化水平(p-ERK)也明显升高,而总ERK(t-ERK)表达水平二者无明显差异;SW480β6Del.mutant细胞ERK2的磷酸化水平较SW480β6细胞明显降低;SW480β6Del.mutant细胞和PD98059处理的SW480β6细胞Ets-1的表达水平明显低于对照组(P<0.05)。结论:整合素αvβ6通过αvβ6-ERK2直接连接提高ERK2的磷酸化水平,从而促进结肠癌SW480细胞核转录因子Ets-1表达。     

钙对HaCaT细胞整合素β1启动子活性和表达及细胞迁移的影响

目的 了解钙离子对人永生化KC株HaCaT细胞整合素β1启动子活性、蛋白表达及细胞迁移的影响.方法 (1)体外培养HaCaT细胞(12孔板),按随机数字表法分为5组,每组18孔.分别用pGL3启动子(阳性对照组)、pGL3空载体(阴性对照组)及pGL3-1756 bp(全长启动子组)、pGL3-1442 bp(远端启动子组)、pGL3-261 bp(近端启动子组)报告质粒转染HaCaT细胞,转染分别在含0.00、0.03、0.09、0.30、0.80、1.20 mmol/L钙离子的无血清RPMI 1640培养液中进行(每组每种浓度3孔).24 h后用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对活性.(2)取本室构建的稳定转染小干扰RNA-整合素β1载体(简称稳定转染)的HaCaT细胞,常规培养后按随机数字表法将细胞分为6部分,用前述6种浓度钙离子处理,每种浓度3个样本.采用蛋白质印迹法检测整合素β1蛋白表达水平.(3)于6孔板中培养正常HaCaT细胞和稳定转染的HaCaT细胞,每种细胞18孔.按常规进行划痕处理后,用含前述6种浓度钙离子的培养液(按随机数字表法划分.每种浓度3孔细胞)培养12 h.观察并检测细胞迁移率.(4)对各实验结果进行单因素方差分析和独立样本t检验.结果 (1)全长启动子组细胞在钙离子浓度由0.00 mmol/L升至0.09、0.30 mmol/L时,荧光素酶相对活性由0.16±0.09升至0.39±0.09、0.35±0.05(t值分别为3.143、3.140,P值均小于0.05);当钙离子浓度升至0.80、1.20 mmol/L时,荧光素酶活性下降.远端启动子组细胞荧光素酶相对活性随钙离子浓度变化的趋势与全长启动子组相似,但在0.09、0.30 mmol/L时,该酶活性分别为0.56±0.32和0.64±0.06,明显高于全长启动子组(t值分别为0.887、6.122,P值均小于0.05).各种浓度钙离子对近端启动子组荧光素酶相对活性无明显影响.(2)当钙离子浓度为0.00 mmol/L时,稳定转染的HaCaT细胞整合素β1蛋白表达量为0.53±0.10.当钙离子浓度为0.03、0.09、0.30、0.80、1.20 mmol/L时,整合素β1表达量分别为0.58±0.09、1.40±0.29、1.41±0.09、0.99±0.10、1.16±0.15,与0.00 mmol/L时比较均明显升高(t值分别为0.687、4.880、11.210、5.578、6.199,P值均小于0.05).(3)与钙离子浓度为0.00 mmol/L比较,当钙离子浓度为0.09、0.30 mmol/L时,正常HaCaT细胞迁移率明显增高;0.80、1.20 mmol/L时,迁移率明显降低.稳定转染的HaCaT细胞经各种浓度钙离子处理后,细胞迁移率无明显改变.结论 整合素β1远端启动子是调节人表皮细胞整合素β1转录的主要区域,钙离子对整合素β1启动子活性、蛋白表达和细胞迁移具有调节作用.     

琥珀酸对人外周血中性粒细胞凋亡的影响

目的 了解琥珀酸对人外周血中性粒细胞(PMN)凋亡的影响,探讨其致病机制.方法 体外孵育PMN,将PMN浓度调至5×106个/ml.在细胞中加入琥珀酸刺激,根据所加琥珀酸浓度分为5、10、20、30 mmol/L琥珀酸组;对照组加入常规培养液.取各组细胞培养上清液,检测其活性氧含量.5、20 mmol/L琥珀酸组细胞于处理前及处理后2、4、6、8、10 h分别取细胞悬液1 ml,行半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性及细胞凋亡率检测.结果 5、10、20、30 mmol/L琥珀酸组活性氧含量(0.437±0.056、0.432±0.024、0.395±0.049、0.386±0.010)均低于对照组(0.505±0.028,P＜0.05).随着孵育时间延长,各组细胞caspase-3活性均逐渐增加,但与对照组比较,5 mmol/L琥珀酸组caspase-3活性降低,20 mmol/L琥珀酸组则升高(P＜0.05).对照组细胞处理前凋亡率为(6.1±1.1)%,处理后2 h为(13.2±2.0)%,10 h达(27.7±3.7)%;5 mmol/L琥珀酸组细胞凋亡率除处理后4 h外其余时相点均低于对照组(P＜0.05);20 mmol/L琥珀酸组细胞处理后4～10 h凋亡率均高于对照组(P＜0.05).结论 低浓度琥珀酸抑制PMN凋亡,而高浓度琥珀酸可促进PMN凋亡.细菌感染时,通过代谢产物琥珀酸抑制PMN免疫功能.     

17 β雌二醇通过丝裂原活化蛋白激酶抑制前列腺癌细胞系PC3增殖

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶在17β雌二醇(E2)抑制前列腺癌PC3细胞生长中的作用。方法检测不同浓度E2作用不同时间后PC3细胞生长抑制率。流式细胞仪分析细胞周期分布,TUNEL染色检测凋亡。Western blot检测ERK1/2,JNK和p38活性。RT-PCR法检测雌激素受体(ER)α、ERβ、P21WAF1和cyclinD1的表达。结果E2抑制PC3细胞增殖,并且可以激活ERK1/2、JNK和p38。处理因素作用48h后,对照组、E2、E2 PD98059、E2 SP600125、E2 SB203580组细胞的凋亡率分别为(0.9±0.1)%;(23.0±1.4)%;(30.0±1.2)%;(10.6±0.8)%和(14.6±0.7)%,(P<0.05)。E2使细胞阻滞在G1期,PD98059、SP600125、SB203580分别预处理1h后细胞分别进一步阻滞在G1期;轻度阻滞在G1期和进入S期。RT-PCR发现PC3细胞表达ERα和ERβ,E2、E2 PD98059、E2 SP600125、E2 SB203580组中cyclinD1、P21WAF1基因表达分别为对照组的(0.42±0.03)、(3.13±0.02)倍;(0.21±0.03)、(3.08±0.05)倍;(0.43±0.01)、(1.31±0.04)倍;(2.81±0.02)、(3.14±0.02)倍(P<0.05)。结论E2激活JNK增加P21WAF1基因表达,并激活p38抑制cyclinD1表达,使细胞阻滞在G1期,JNK和p38通路还介导E2引起PC3细胞凋亡。同时E2又可激活ERK1/2,轻度拮抗上述作用。     

双靶向整合素αvβ3及VEGFR2微泡造影剂的制备及其对肝癌细胞寻靶能力的分析

本研究采用生物素亲和素法将整合素αvβ3及VEGFR2抗体与Usphere微泡结合, 制备双靶向整合素αvβ3及VEGFR2微泡造影剂。制备成功的双靶向整合素αvβ3及VEGFR2微泡分布均匀, 平均粒径(1 205.06±103.70)nm, 电位(-27.0±3.0)mV。将微泡与MHCC-97H肝癌细胞共孵育, 免疫荧光法检测显示双靶向微泡组微泡荧光与细胞核DAPI荧光强度比值显著高于单靶向微泡组和非靶向微泡组(P<0.05)。提示本研究成功制备双靶向整合素αvβ3及VEGFR2微泡造影剂, 可与MHCC-97H细胞特异性结合, 可作为一种监测肿瘤生长的分子影像探针。     

细胞色素C在氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡中的作用

目的:检测细胞色素C在氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡过程中的作用，分析细胞色素C在线粒体和胞浆中的分布及其与caspase-9活化的关系。方法:用1×10-2mol/L的5-FU处理HepG2细胞，分别作用2,4,8,16,24h，用荧光检测试剂盒检测HepG2细胞凋亡过程中细胞色素C分布变化;Western-blot检测caspase-9的活化和细胞色素C在胞浆及线粒体中的分布。结果:氟尿嘧啶处理肝癌细胞4h后，caspase-9活性开始升高，于16h后达到高峰，与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。Western-blot分析发现caspase-9被蛋白酶水解切断后形成10kD片段;细胞色素C在胞浆中的分布从4h后逐渐增加，16h最明显，而其在线粒体中的分布却正相反;细胞色素C的分布改变和caspase-9的活化基本同步。结论:在氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡过程中caspase-9被活化，并伴有细胞色素C自线粒体中释放到胞浆，提示细胞色素C可能在Caspase-9的活化和肝癌细胞凋亡中起重要作用。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂拮抗人皮肤成纤维细胞转化生长因子β1机制研究

目的 了解过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂拈抗TGF-β1促皮肤瘢痕化的效应机制.方法 体外培养正常成人皮肤Fb,根据培养基中所加刺激物不同分为空白对照组(无血清DMEM培养基),TGF-β1组(DMEM培养基加入含终浓度10 ng/mL TGF-β1作用48 h),曲格列酮组(DMEM培养基加入含终浓度10μmol/L曲格列酮作用2 h,再加入10 ng/mL TGF-β1作用48h),15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)组(DMEM培养基加入含终浓度10 μmol/L 15d-PGJ2作用2 h,再加入10 ng/mL TGF-β1作用48 h).应用蛋白质印迹法检测结缔组织生长因子(CTGF)的表达,实时荧光RT-PCR检测CTGF、基质金属蛋白酶1(MMP-1)及血小板源性生长因子(PDGF)的mRNA水平变化.对数据进行单因素方差分析.结果 TGF-β1组的CTGF蛋白和mRNA表达水平均高于空白对照组,曲格列酮组和15d-PGJ2组的CTGF蛋白及mRNA表达水平低于TGF-β1组.空白对照组、TGF-β1组、曲格列酮组、15d-PGJ 2组MMP-1 mRNA表达水平分别为1.281±0.195、0.193±0.051、0.417±0.043、0.485±0.027,其中TGF-β1组低于空白对照组(F=12.811,P＜0.01),曲格列酮组、15d-PGJ2组高于TGF-β1组(F=12.811,P值均小于0.01).空白对照组、TGF-β1组、曲格列酮组、15d-PGJ2组PDGF mRNA表达水平分别为0.349±0.057、1.044±0.237、0.677±0.055、0.511±0.017,其中TGF-β1组高于空白对照组(F=16.848,P＜0.01),曲格列酮组、15d-PGJ2组低于TGF-β1组(F=16.848,P值均小于0.01).结论 激活后的PPARγ对TGF-β1下游反应因子CTGF的抑制作用,可能是其拮抗TGF-β1促皮肤瘢痕化的主要机制,而对细胞因子MMP-1、PDGF的影响可能也是其机制之一.     

转化生长因子-β1对体外培养的人毛囊干细胞生物学特性的影响

目的 观察转化生长因子-β1(TGF-β1)对体外培养的毛囊干细胞(HFSCs)生物学特性的影响.方法 体外分离培养人HFSCs,观察其在10-μg/L TGF-β1条件培养基下的细胞形态变化,噻唑蓝(MTT)比色法于24、48、72 h分别检测加入条件培养基前后细胞增殖能力,细胞接近铺满时划痕,并于0、24、48、72 h后用目镜测微尺测量划痕宽度检测迁移能力,将细胞接种于Transwell小室上层,下层加入含10 μg/L TGF-β1条件培养基,48 h后计数穿透细胞数,免疫荧光化学方法检测加入条件培养基前后角蛋白19、β-整合素、E钙黏蛋白、N钙黏蛋白、波形蛋白的表达.结果在TGF-β1作用下,HFSCs之间的紧密连接消失,细胞由圆形或多角形向梭形细胞转变,MTT结果显示,在TGF-β1作用下HFSCs各时间点A值与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),细胞划痕实验结果显示,TGF-β1能够促进细胞迁移,对照组差异有统计学意义(P<0.01).Transwell穿透实验结果表明,加入TGF-β1后,HFSCs细胞定向迁移穿透基底膜数量与对照组比较显著增多(47.9±8.8比35.8±6.7,P<0.01),免疫荧光结果显示TGF-β1能够降低角蛋白19、β-整合素和E钙黏蛋白表达,而N钙黏蛋白、波形蛋白的表达增加.结论 TGF-β1通过诱导体外培养的HFSCs上皮间质转化而促进其迁移.     

兔椎间盘终板细胞凋亡与水通道蛋白-1的关系

目的 探讨水通道蛋白(AQP)-1与椎间盘终板细胞凋亡的关系及意义.方法 将23个含终板的完整椎间盘分为4组:A组直接把取出的新鲜完整的椎间盘作为对照(椎间盘×5),B组为无干预组[进行培养但不加白细胞介素(IL)-1β,椎间盘×6],C组加入10μg/L IL-1β(椎间盘数×6),D组加入30μg/L IL-1β(椎间盘数×6).B、C、D组培养2周后取组织的相邻切片,免疫组织化学检测AQP-1和Caspase-3的表达.结果 免疫组织化学显示A组中AQP-1和Caspase-3阳性细胞率分别为(88.4±1.1)%和(5.5±0.8)%,B组阳性细胞率分别为(86.7±1.4)%和(6.3±1.6)%,C组中阳性细胞率分别为(42.8±2.2)%和(62.0±1.7)%,D组阳性细胞率分别为(30.5±2.0)%和(71.8±1.23)%,AQP-1与Caspase-3表达呈负相关.结论 AQP-1表达减少与终板细胞的凋亡密切相关.     

整合素αvβ6 在大鼠呼吸机相关性肺损伤中的作用

目的 探讨整合素αvβ6 在大鼠呼吸机相关性肺损伤(VILI)中的作用.方法 清洁级雄性SD大鼠24只,随机分为3组(n=8),对照组(C组)不行机械通气;高潮气量组(H组)行高潮气量(40 ml/kg)机械通气4 h,呼吸频率40次/min,氧浓度21%;高潮气量+阻滞剂S247组(HS组)腹腔注射S247(含有αv 亚单位整合素非特异性阻滞剂)100 mg/kg,1次/d,持续2周,在最后一次腹腔注射S247后30 min行高潮气量机械通气,参数设定同H组.C组和H组于上述相应时点腹腔注射等量生理盐水.通气结束后处死大鼠,观察肺组织病理学,计算肺湿,干重比(W/D),记录支气管肺泡灌洗液(BALF)白细胞(WBC)计数,测定总蛋白(TP)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2)的浓度、整合素αvβ6 mRNA及其蛋白的表达水平.结果 C组未见肺损伤的发生;H组肺泡结构严重破坏,肺泡内渗出物、出血和间质水肿明显;HS组中等程度炎性细胞浸润,肺泡内出血和肺泡壁增厚.与C组比较,H组和HS组肺W/D、BALF中WBC计数、TP浓度升高,整合素αvβ6 mRNA及其蛋白表达上调,H组BALF中MIP-2浓度升高(P＜0.01);与H组比较,HS组肺W/D、BALF中WBC计数、TP、TNF-α、MIP-2浓度降低,整合素αvβ6 mRNA及其蛋白表达下调(P＜0.05或0.01).结论 整合素αvβ6参与了大鼠VILI的发生.     

机械负荷调节猪腰椎间盘细胞表达α5β1整合素的体外研究

目的研究α5β1整合素在体外培养的猪腰椎间盘细胞中的表达和机械负荷对其的影响。方法取10只年龄5-6周、体重25-30kg的猪，处死后12h内，无菌条件下切取完整的腰椎，剔除腰椎周围的韧带和软组织，尤其是椎间盘周围的韧带。从腹侧一次性切开椎间盘取出髓核（nucleus pulpous，NP），仔细分离纤维环（anulus fibrous，AF），将两者立即置于Hanks平衡盐溶液中，制成细胞悬液。分别对腰椎间盘的AF和NP细胞施加1MPa、1Hz，3h／d，共3d的周期性液压，通过对细胞的形态学观察、Western免疫印迹和免疫组织化学染色，检测α5β1整合素在正常腰椎间盘AF细胞和NP细胞中的表达及周期性压力对其的影响。结果经周期性液压后，NP细胞的存活率大于90％，AF细胞的存活率大于85％，加压后的AF细胞和NP细胞均可见体积缩小。α5β1整合素在正常腰椎间盘AF细胞和NP细胞中的表达呈强阳性。Western免疫印迹结果显示：加压后α5β1整合素在AF细胞中的表达均明显减少，P值分别为0．000、0．003，与对照组比较差异有统计学意义；α5β1整合素在NP细胞中的表达也明显减少，P值分别为0．001、0．015，与对照组比较差异有统计学意义。结论机械负荷可引起腰椎间盘细胞中α5β1整合素的变化，提示α5β1整合素在腰椎间盘细胞中可能发挥力学传感器的作用。     

ERK1/2激活参与乳化异氟醚后处理的脑保护作用

目的观察细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的激活在8%乳化异氟醚后处理对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤中的作用。方法健康成年雄性SD大鼠48只,随机均分为六组:假手术组(S组)、缺血-再灌注组(IR组)、乳化异氟醚后处理组(EI组)、ERK抑制剂PD98059组(PD组)、乳化异氟醚后处理+PD98059组(EP组)、溶媒DMSO组(D组)。除S组外,均采用大脑中动脉阻闭2h,再灌注24h建立局灶性脑缺血-再灌注模型。缺血2h恢复再灌注即刻,EI组、EP组腹腔注射8%乳化异氟醚10.5ml/kg,其余各组注射生理盐水10.5ml/kg。PD组、EP组和D组于再灌注前30min侧脑室分别注入PD98059和DMSO。再灌注24h时进行神经功能缺陷评分(NDS评分),并观察组织形态学变化及细胞凋亡、p-ERK1/2阳性表达。结果与IR组相比,EI组NDS评分降低,凋亡细胞减少,磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达上调(P<0.05);与EI组相比,EP组NDS评分增高,凋亡细胞显著增加,p-ERK1/2表达下调(P<0.05)。结论 8%乳化异氟醚后处理通过激活ERK1/2信号通路对抗局灶性脑缺血-再灌注损伤。     

无细胞异种真皮与表皮细胞悬液复合移植的研究

目的　研究用无细胞异种真皮与表皮细胞悬液复合移植的效果及组织学变化。方法　将 4 2只裸鼠分为实验组及对照组 ,实验组于背部全层皮肤缺损创面移植无细胞异种真皮及人表皮细胞悬液 ,对照组单纯移植人表皮细胞悬液。于术后 2、3和 5周计算创面愈合率 ,术后 3、6和 12周计算创面收缩率 ,并取活检行组织学检测。结果　实验组创面愈合率高 ,分别为 79.1%± 4 .5 % ,89.6 %± 4 .4 % ,98.1%± 3.4 % ,收缩程度轻为 16 .3%± 5 .2 % ,2 5 .5 %±7.2 % ,32 .5 %± 7.1% ,外观平整 ,质地良好 ,胶原纤维排列整齐 ,基底细胞桥粒 -半桥粒结构及基底膜等结构重建明显 ,未见明显的急性排斥反应 ;对照组创面愈合率分别为 6 9.2 %± 4 .9% ,78.2 %± 7.6 % ,90 .6 %± 5 .0 % ,收缩率为2 0 .5 %± 6 .0 % ,31.3%± 6 .9% ,4 4 .6 %± 7.2 % ,与实验组相比 ,均有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ,愈合后的表皮质地薄 ,易破溃 ,胶原纤维紊乱 ,表皮 -真皮连接结构重建不明显。结论　无细胞异种真皮与表皮细胞悬液复合移植修复创面 ,可改善创面愈合质量。     

β1整合素表达下调对人结肠癌细胞侵袭和耐药的影响

目的 观察β1整合素表达下调对人结肠癌HT-29细胞侵袭和耐药的影响.方法 反义寡核苷酸技术转染HT-29细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测β1整合素表达下凋.Transwell侵袭窒方法检测HT-29体外侵袭力.流式细胞术(FCM)和噻唑蓝(MTT)比色法检测不同剂量的化疗药物[5-氟尿嘧啶(5-Fu)]对各组凋亡率和生长抑制率的影响.结果 实验组HT-29细胞βl整合素mRNA表达显著降低,体外侵袭实验迁移的HT-29细胞数(59±12)明显减少(P＜0.05),在高浓度5-Fu(100、200 mg/L)时HT-29细胞的生长抑制率(36.97%和47.58%)和细胞凋亡率[(15.7l±1.46)%、(27.82±1.58)%]与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 β1整合素表达下调可降低结肠癌细胞侵袭及化疗药物耐药性.     

钙离子阻断剂对大鼠肠上皮细胞损伤后整合素分布的影响

目的观察钙离子阻断剂对肠上皮细胞(IEC)缺血缺氧损伤后细胞内钙含量、整合素分布及凋亡的影响。方法实验分为对照组(A1组),模拟缺氧组(B1组),模拟缺血组(C1组),模拟缺氧缺血组(D1组)及加入维拉帕米后的相应对照组;用流式细胞仪(FCM)检测IEC凋亡率,用激光聚焦显微镜技术(LSCM)观察胞内钙含量、整合素α3,α5,β1,β2,β5分布改变。结果模拟缺血缺氧损伤后,B1、C1、D1组胞内钙含量升高,IEC凋亡率上升,整合素α3,α5,β1,β5向顶层漂移,尤以D1组更显著;加用钙离子阻断剂后,降低了胞内钙含量,阻止整合素α3,α5,β1,β5顶层漂移趋势,其变化与细胞凋亡减少相一致。结论细胞内钙超载可导致细胞内整合素分布改变,凋亡率增加,钙离子阻断剂能降低细胞内钙含量,抑制整合素亚型的顶层漂移,减少IEC凋亡率。     

表皮干细胞向汗腺细胞分化的表型改变及其通路机制研究

目的探讨表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)诱导分化为汗腺细胞(sweat gland cells,SGCs)过程中表型的改变及其通路的调控机制。方法取健康成人包皮,采用中性蛋白酶消化后高浓度Ⅳ型胶原黏附法分离培养获得ESCs,行β_1整合素、角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)及p63免疫荧光染色法鉴定;取健康成人全层皮肤,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离提取汗腺组织,体外增殖培养SGCs,行CK7、CK18、CK19和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)免疫荧光法鉴定。取第2代ESCs分为4组:A组将ESCs及SGCs两种细胞通过Ttranswell共培养系统共培养,B组通过单纯添加汗腺上清液培养ESCs,C组在A组基础上加入浓度为60 ng/mL的EGF,D组在A组基础上加入浓度为10 mmol/L的PD98059。分别通过倒置相差显微镜进行细胞形态学观察、流式细胞术检测ESCs表型阳性率及Western blot检测分化过程中的信号通路机制。结果经细胞形态学观察及免疫荧光染色鉴定提示培养细胞为ESCs和SGCs。倒置相差显微镜观察示,A、C、D组培养后细胞形态变化相似,9 d后细胞开始出现扁平多角形结构改变;B组形态变化较慢培养12 d后与其他3组结构相似。流式细胞术结果示,与B组比较,A组Transwell共培养系统共培养后,ESCs的β_1整合素阳性率显著下调、CEA阳性率显著上调(P0.05);C组加入EGF可降低共培养系统中ESCs的β_1整合素下调和CEA上调,D组加入PD98059可增强共培养系统中ESCs的β_1整合素下调和CEA上调,A、C、D组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。Western blot检测示,4组均有较高水平细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)表达,但B组明显低于其他3组(P0.05);磷酸化-ERK表达A组最高、C组最低,各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论处于SGCs生长环境中时,通过Transwell共培养系统共培养,ESCs可经诱导分化为SGCs,其表型发生相应改变;通过对丝裂原活化蛋白激酶/ERK通路的控制,可以调节ESCs的分化方向和程度。     

一氧化氮对HaCaT细胞迁移功能的影响

目的 了解外源性NO对HaCaT细胞迁移功能的影响及其机制.方法 以硝普钠作为NO的供体,在HaCaT细胞培养液中加入0.1、1.0、10.0、100.0、1000.0 μmol/L硝普钠,分别于划痕0 h(划痕即时)及划痕后6、12、24、48 h观察并计算细胞迁移率.根据该结果筛选出硝普钠最佳作用浓度及作用时间,以此为实验刺激条件,应用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架的改变,采用蛋白质印迹法、PCR等方法检测实验组(加入10.0 μmol/L硝普钠培养24 h)及阴性对照组整合素β_1、RhoA、cdc42、Rac1蛋白及RhoA、cdc42、Rac1 mRNA表达情况.对各实验结果行单因素方差分析和重复测量的方差分析.结果 加入硝普钠处理后各浓度组细胞迁移率随划痕时间的延长而逐渐增加.加入10.0 μmoL/L的硝普钠划痕后6～48 h与划痕0 h比较,差异均有统计学意义(F=31.002,P值均小于0.05).激光共聚焦显微镜显示,阴性对照组细胞纤毛稀少,胞内应力纤维束纤细,而实验组纤毛明显增多,胞内应力性纤维束增粗.实验组整合素β_1蛋白表达水平明显低于阴性对照组(F=8.25,P=0.015);而RhoA的蛋白表达水平为0.92±0.04,高于阴性对照组的0.64±0.04(F=7.25,P<0.05),cdc42、Rac1蛋白表达也高于阴性对照组(F值分别为14.10、6.50,P值均小于0.05).实验组RhoA、cdc42、Rac1的mRNA水平均高于阴性对照组(F值分别为23.67、10.39、9.52,P值均小于0.05).结论 适宜浓度的外源性NO可促进HaCaT的增殖及迁移,提示其在皮肤创面修复中起重要作用.其机制可能与整合素β_1表达下降、细胞骨架的改变有关.