人IgD的纯化及其抗血清制备

<正> 本文采用了Vltrogel AcA34凝胶过滤、DEAE离子交换及亲和层析法,从骨髓瘤病人血清中分离高纯度的IgD,并以此为抗原免疫山羊得到高效价的抗血清。 材料和方法 一、材料及来源:Vltrogel AcA34(LKB公司),DEAE纤维素(Whatman公司),CNBr-Sepharose4B(Pharmacia公司),抗人IgG、IgA、IgM抗血清(上海生物制品研     

兔抗人Bit1抗血清的制备及其纯化

目的：利用大肠杆菌中表达的人Bitl(hBitl)蛋白，制备兔抗人Bitl抗血清并对其进行纯化。方法：在大肠杆菌中诱导表达人Bitl融合蛋白：以其免疫家兔，制备兔抗人Bitl抗血清，用非特异性去除法纯化抗体，并以Western blot对所纯化的兔抗人Bitl抗血清进行鉴定。结果：大肠杆菌中表达的人Bitl蛋白占菌体总蛋白的40％。用纯化的抗血清可特异地检出大肠杆菌表达的人Bit融合蛋白。结论：人Bitl融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，并成功地制备并纯化了兔抗人Bitl抗血清。     

人金属硫蛋白MT-2a的原核表达、纯化及其抗血清的制备

目的:在大肠杆菌中表达人金属硫蛋白(MT)-2a与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,并制备兔抗MT-2a抗血清。方法:人MT表达菌株BL21/GST-MT-2a经IPTG诱导、超声裂解及GlutathioneSepharose4B亲和层析纯化后,以可溶性融合蛋白GST-MT-2a免疫新西兰大白兔,制备抗血清。用双向凝胶免疫扩散和ELISA检测抗血清的效价,用Westernblot检测抗血清的特异性。结果:经诱导表达及亲和层析纯化,每L菌液可获得可溶性融合蛋白GST-MT-2a38mg。以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备的抗血清,双向免疫扩散效价>1∶256,ELISA效价>1×10-7。Westernblot检测证明抗血清的特异性良好。结论:人MT-2a在大肠杆菌中得到高效表达,以纯化的GST-MT-2a可溶性融合蛋白免疫家兔得到高效价、高特异性的抗血清,为进一步研究MT-2a蛋白的生物学功能提供了重要的制剂。     

人免疫球蛋白轻链的提纯、抗血清制备及临床应用

人Ig轻链是一条由213～214个氨基酸构成的多肽链,分Kappa和Lambda两型,分子量22,500,在多发性骨髓瘤,轻链病患者及肾功能损伤者的血和尿中,轻链明显增多,故纯化的轻链及其单价抗血清是诊断这类疾病所必须的诊断试剂。 取本周氏蛋白尿以固体硫酸铵粗提,藉DEAE-     

人胰弹力蛋白酶Ⅱ的分离纯化和抗血清制备

<正> 弹力蛋白酶(elastsae)产生于胰腺腺泡,在外分泌胰液中以酶原的形式存在,并可被胰蛋白酶所激活。现知该酶在急性胰腺炎病理过程中,对血管壁破坏、弹力组织崩解及组织间隙出血等血管损害起关键作用。利用放射免疫分析法测定血清弹力蛋白酶不仅对急性胰腺炎的诊断有重要意义,还将     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白表达、纯化及抗血清制备

目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E2蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E2血清.方法 采用PCR技术扩增HPV16E2基因,构建入pET21b载体,重组表达载体pET21 b-HPV16E2经鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达并鉴定表达产物.经纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E2蛋白.免疫BALB/c小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pET21b-HPV16 E2构建成功.表达蛋白相对分子质量(Mr)为42 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4+T细胞数量和CD4/CD8比值升高,小鼠IFN-γ无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E2蛋白和小鼠抗HPV16 E2高效价的抗血清.     

人乳头瘤病毒16型E4蛋白表达、纯化及抗血清制备

目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E4蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E4血清.方法 将HPV16 E4基因克隆入pQE30,重组质粒pQE30-HPV 16E4经鉴定后转化大肠埃希菌M15(PREP4),诱导表达并鉴定表达产物.因纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E4蛋白.免疫Bal B/C小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ水平、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pQE30-HPV16F4构建成功.表达分子相对分子量(Mr)为10 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4/CD8无升高,小鼠γ干扰素(IFN-γ)无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E4蛋白和小鼠抗HPV16 E4高效价的抗血清.     

人胎盘谷胱甘肽硫转移酶的简易纯化方法及抗血清制备

本文试用DEAE Cellulose_(52)离子交换柱层析代替高效液相层析的特异阴离子柱,模仿高效液相的梯度洗脱条件,成功地从人胎盘组织纯化制备出谷胱甘肽硫转移酶(GST),纯化863.1倍,比活性达16.4U/mg蛋白质,经SDS-PAGE鉴定,呈现单一亚基区带,亚基分子量为24 000。再用此酶作抗原研制出免抗人GST IgG,检测其纯度和特异性均得到满意的结果。     

昆虫抗冻蛋白DAFP的原核表达、纯化和抗血清制备

目的:制备昆虫抗冻蛋白DAFP特异性的鼠抗血清。方法:根据GenBank已发表的Dendroides canadensis抗冻蛋白基因序列(gi:2737939),人工合成加拿大拟步甲虫(Dendroides canadensis)的抗冻蛋白基因(dafp),并克隆到原核表达载体pGEX-4T-1和pMAL-p2x中,在大肠杆菌中进行表达。表达的融合蛋白经Glutathione Sepharose4B纯化后,免疫小鼠制备抗DAFP的抗血清,抗体的效价及特异性分别采用ELISA和Western blot进行检测。结果:SDS-PAGE检测表明,人工合成的dafp基因在大肠杆菌中可表达相对分子质量(Mr)为38000的可溶性融合蛋白。以该融合蛋白免疫小鼠所制备的抗体,其ELISA滴度为1∶5000,Western blot证实BL21/pGEX-4T-1-dafp菌和TB1/pMAL-p2x-dafp菌的表达产物可特异性地与该抗体结合。结论:在大肠杆菌中成功地表达了DAFP的融合蛋白并制备出抗融合蛋白的鼠抗血清,为进一步研究DAFP的特性奠定了基础。     

人CT抑制物的分离及其抗血清的制备

本文采用PEG沉淀及抗人C_1~--INH Sepharose 4B、抗人IgG Sepharose 4B及抗人白蛋白Sepharose 4B柱层析等步骤,自人血清分离补体调节蛋白C_1~--INH,该制剂经免疫电泳试验,位于α_3,SDS-PAGE分析呈现分子呈为105KD的主带和90KD的次带,免疫家兔获抗C_1~--INH单价抗血清,以上结果表明,分离的C1-INH具有高纯度及免疫学活性。     

人抗凝血酶Ⅲ的表达及其抗血清的制备

目的 用大肠杆菌系统表达重组的抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ),制备其抗血清并测定效价.方法 利用基因克隆技术获得AT-Ⅲ基因片段,构建原核表达质粒pET32a(+)-AT-Ⅲ,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达、蛋白纯化并免疫兔,间接ELISA、Western blot法检测抗血清.结果 SDS-PAGE、Western blot法检测原核表达蛋白结果显示,在相对分子质量(Mr)77 000附近出现特异性条带.对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备AT-Ⅲ抗血清,间接ELISA方法检测抗血清的最高效价可达到1∶12 800,Western blot分析表明抗血清可与293T、CHO细胞表达的AT-Ⅲ蛋白及AT-Ⅲ蛋白纯品特异性结合.结论 成功制备了人抗凝血酶Ⅲ抗血清.     

结核杆菌CFP-10蛋白的原核表达、纯化及抗血清制备

目的:获得原核表达及纯化结核杆菌CFP-10蛋白及其抗血清。方法:从H37RV结核杆菌基因组中扩增得到CFP-10的编码基因,通过原核表达系统(BL21-pET28a+)表达及镍亲和层析和Q sepharose阴离子交换层析获得内毒素合格的CFP-10蛋白。将此蛋白免疫家兔,获得抗CFP-10的抗血清,并通过间接ELISA的方法检测其抗体滴度。结果:重组质粒pET28a-CFP-10构建成功,其编码的蛋白在BL21中获得了高效表达,且经纯化获得了内毒素合格的CFP-10蛋白,免疫家兔获得的抗血清效价能达到1∶256 000。结论:成功的表达及纯化了CFP-10蛋白,并制备了高滴度的CFP-10抗血清,为临床血清学检测以及新型结核疫苗研究奠定基础。     

肝谷胱苷肽-S-转移酶的纯化与抗血清制备

<正> 谷胱苷肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase GST)共有三组,即碱性、中性、酸性蛋白。碱性蛋白为双聚体,又可分为α、β、γ、δ、ε五种,其免疫特征一致。该酶富含于肝细胞浆内,司转运胆红素、解毒之功。因它在肝细胞内含量极为丰富,分子量又小,故其血中浓度是反映肝脏早期损害、肝细胞中毒和完整性的一项敏感指标,在反映慢活肝组织学病变严重性方面优于转氨酶。国内迄今未见有关报道。为建立人血清GST的检测方法并为免疫细胞化学法提供关键试剂,本文纯化了人GST,并制备成功相应的抗血清。     

兔抗人ERA抗血清的制备

目的 在大肠杆菌中表达人ERA蛋白（h-ERA)和h-ERAC端结构域蛋白。并制备兔抗h-ERA抗血清。方法 以PCR扩增人era基因（h-era)全长cDNA和h-ERAC端的结构域基因,并分别克隆到（His)6融合表达载体RSET-C和非融合表达载体pDH中,诱导表达（His)6-h-ERA融合蛋白和h-ERAC端结构域蛋白,用h-ERAC端结构域蛋白免疫兔,制备兔抗h-ERA抗血清,并以Western-blot对兔抗h-ERA抗血清进行鉴定。结果 大肠杆菌中表达的h-ERAC端结构域蛋白和（His)6-h-ERA融合蛋白,分别占菌体总蛋白的40%和80%。用兔抗血清可检出大肠杆菌中表达的（His)6-h-ERA融合蛋白。结论 h-ERA和h-ERAC端结构域蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,并成功地制备了兔抗h-ERA抗血清。     

SIEA-Gp101分子抗原的分离纯化及其单特异性抗血清的制备

应用SDS PAGE、电渗、透析等方法 ,分离纯化SIEA Gp10 1分子抗原。采用多途径免疫法制备单特异性抗血清 ,琼脂扩散试验和ELISA测定抗体的效价 ,SDS PAGE和ELIB检测抗体的特异性。结果表明纯化的SIEA Gp10 1为单一抗原分子 ,对SIEA Gp10 1的抗血清进行ELIB分析 ,证明其仅识别SIEA Gp10 1抗原 ,说明SIEA Gp10 1分子具有抗原性。     

鸡Rad51蛋白的体外表达与纯化及其抗血清的制备

目的:Rad51蛋白在双链断裂的DNA修复的同源重组中发挥重要作用。因而其过量表达在细胞内的基因操作中被用于在提高基因同源重组的效率。当前在鸡中还未有针对该蛋白的特异性抗体。为此我们对鸡的Rad51进行了体外表达与纯化,并制备了cRad51抗体,为该蛋白质在鸡细胞中的功能研究及探讨其用于鸡细胞中提高同源重组的研究提供有效工具。方法:对鸡Rad51基因进行全长克隆并构建原核表达载体pET-28a(+),用IPTG诱导该蛋白在Rosseta菌株中表达,纯化后注射BALB/c小鼠获得抗体。结果:成功制备鸡Rad51特异多克隆抗体,ELISA显示该抗体血清效价达51 200,该抗体血清可以用于Western等的蛋白检测技术。结论:针对鸡基因产物制备抗体的技术方法有效可行;首次成功获得鸡Rad51蛋白及多克隆抗体,为与该蛋白相关的研究提供了有效工具。     

人甘露糖结合凝集素（MBL）的纯化与兔抗人MBL抗血清的制备

甘露糖结合凝集素ｍａｎｎｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇｌｅｃｔｉｎＭＢＬ是哺乳动物Ｃ型凝集素超家族的成员,在机体抗感染免疫反应中处于第一线１。ＭＢＬ能特异性地识别多种病原微生物表面的多糖结构,进而激活补体系统和调理吞噬杀灭病原２３。同时,它也参与多种免疫性疾病的发生４。目前,有关其与疾病的关系,以及其在疾病治疗和预防中作用的研究正方兴未艾,因而获取有活性的ＭＢＬ蛋白,并制备其特异性抗体,已成为这些研究必不可少的工具。１材料和方法１．１材料混合人冰冻血浆由西京医院血库提供。Ｄ－甘露糖和…     

重组寻常型天疱疮抗原抗血清的制备与纯化

寻常型天疱疮抗原 (pemphigusvulgarisantigen ,PVA )是桥粒中相对分子质量为 130 0 0 0的糖蛋白 ,其分子由细胞外区(extracellulardomain ,EC )、跨膜区和细胞内区三部分组成 ,主要发挥作用的区域在细胞外区。为了了解PVA细胞外区的致病性位点及其相应抗体的致病作用 ,制备抗血清是必需环节。本文在已重组表达的PVAEC1 2融合蛋白的基础上进行蛋白纯化 ,并免疫家兔 ,使之产生针对融合蛋白的特异性抗血清 ,经双向免疫扩散实验 ,其效价为 1:16～ 1:32。采用辛酸沉淀法和DEAE 5 2 纤维素阴离子交换层析进行抗血清IgG抗体成分的提纯 ,总量为 12 5～ 2 2 0mg ,经间接免疫荧光检测 ,其滴度为 1:40。从而获得高滴度、高特异性的兔抗PVAEC1 2融合蛋白抗血清IgG抗体成分。     

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的微量蛋白制备抗血清

目的　以SDS PAGE纯化的微量蛋白制备抗人层粘连蛋白受体前体蛋白 (LRP)的血清。方法　以SDS PAGE分离纯化原核表达的人LRP与 6×组氨酸的融合蛋白 ,切下并粉碎融合蛋白所在凝胶块。将含 10 μg融合蛋白的凝胶颗粒与弗氏佐剂混匀后 ,免疫BALB/c小鼠。以Westernblot检测所获抗血清的滴度和特异性。结果　以胃癌细胞总蛋白为靶抗原时 ,Westernblot显示 ,所获抗血清仅识别 1条Mr 约 4 2 0 0 0的蛋白带 ,将抗血清做 1∶2 0 0 0稀释后 ,仍能清晰地显示其靶抗原所在位置。结论　以聚丙烯酰胺凝胶颗粒为载体 ,用微量蛋白即可成功地制备抗血清