载基因仿生基质材料调控骨髓基质干细胞成骨定向分化

目的 探讨载基因仿生基质材料能否调控骨髓基质于细胞（BMSCs）向成骨细胞定向分化。方法 将非病毒载体K16GRGDSPC共价接枝于新型骨基质材料聚丙交酯／乙交酯／天冬氨酸／聚乙二醇（PICA-[ASP-PEG]）构建非病毒基因转染体系。该体系与转化生长因子（TGF）-β1基因复合制备成载基因仿生基质材料pcDNA3-TGF-β1／K16GRGDSPc／PLGA-[ASP-PEG]，并将兔BMSCs与其复合培养，以pcDNA3／K16GRGDSPC／PLGA-[ASP-PEG]作为对照。通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测TGF-β1基因的表达；应用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测BMSCs的ALP活性，并通过RT-FCR检测细胞ALP、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（GPN）和Ⅰ型胶原的表达，通过免疫荧光染色检测核心结合因子a1（Cbfal）表达，观察BMSCs向成骨细胞方向分化的情况。结果 XFS图谱证实K16GRGDSPC被成功地接枝到PLGA-[ASP—PEG]表面。载基因仿生基质材料复合BMSCs培养结果表明，TGF-β1基因被成功地导入细胞内并表达，而且其成骨标志物（ALP、OCN、CPN、Ⅰ型胶原和Cfbal）的表达均显著高于对照组（P〈0．05）。结论 这种载基因基质材料既可以作为骨组织工程支架材料，又可介导外源TGF—β1基因转染BMSCs并定向调控BMSCs成骨分化。     

人骨髓间充质干细胞的生物学特性及成骨诱导分化的研究

[目的]探讨成人骨髓间充质干细胞分离、纯化、培养及鉴定的方法,观察其成骨分化过程中Runx2基因的动态表达以及生物学特性。[方法]取自人股骨近端骨髓标本,利用联合密度梯度离心和差异贴壁法分离骨髓间充质干细胞,体外扩增和传代培养,流式细胞仪检测细胞表面标记,诱导向成骨细胞分化,并采用RT-PCR和Western blot方法检测Runx2的动态表达。[结果]原代和传代细胞呈纺锤状外观,生长增殖能力良好,骨髓间充质干细胞的生长曲呈成"S"形,细胞表面标记物CD90阳性表达,CD34和CD45阴性表达。经定向诱导分化后,细胞分别呈现成骨细胞的表型特征,随着诱导时间的增加,Runx2的表达也明显增加,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。[结论]该方法能从人骨髓中高效分离和扩增MSCs,生物学性状稳定,具有成骨分化潜能,为骨组织工程提供理想的种子细胞,同时证实Runx2在成骨分化中起到重要的调控作用。     

钽涂层对骨髓间充质干细胞的黏附增殖及成骨分化的影响

目的探讨钽涂层金属在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附、增殖及成骨分化方面的作用。方法在体外取6只6周龄SD大鼠BMSCs进行原代培养至第3代,使用化学气相沉积系统自行制备钽涂层金属。然后进行流式细胞术鉴定、BMSCs三向诱导、荧光染色、细胞增殖检测及实时荧光定量聚合酶链反应技术(Q-PCR)试验。观察比较BMSCs在钛合金圆片(Ti6Al4V组)和钽金属圆片(Ta组)表面黏附的BMSCs数量、增殖速率、成骨细胞特异性转录因子(OSX)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨粘连蛋白(OSN)和骨桥蛋白(OPN)的表达情况。结果流式细胞术结果显示CD44(94.55%)、CD90(95.01%)、CD34(0.06%)。诱导成骨分化14 d后碱性磷酸酶(ALP)染色阳性;诱导成骨分化21 d后出现茜素红钙化结节;成脂诱导21 d后油红O染色呈阳性;成软骨诱导21 d后阿利新蓝染色评估有软骨形成能力。激光共聚焦显微镜结果显示BMSCs在Ti6Al4V组和Ta组金属圆片表面贴附生长,细胞间互相接触、聚集成片,Ta组金属圆片上黏附的BMSCs数量明显多于Ti6Al4V组,并且具有更好的延展性能。细胞增殖检测结果发现,分别共培养1、3、5、7 d后Ta组BMSCs的增殖速率明显快于Ti6Al4V组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Q-PCR结果发现,与Ti6Al4V组相比,体外培养7 d后Ta组金属圆片更能促进OSN和OPN的表达,差异有统计学意义(P<0.05);体外共培养21 d后,Ta组金属圆片更能促进OSX、RUNX2、OSN和OPN的表达,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论相比于传统的骨科植入物钛合金而言,钽涂层金属能够更好地促进BMSCs的黏附,增殖和成骨分化。     

脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化

目的　研究脂肪间充质干细胞 (MSCs)在特定培养条件下向成骨细胞分化 ,探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性。方法　取 3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫 ,消化法获得脂肪MSCs,用成骨诱导培养基诱导其向成骨细胞分化 ,组织化学染色、免疫细胞化学染色和Westernblotting检测细胞分化的情况。结果　从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪MSCs,能大量稳定增殖传代。在地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的诱导下 ,脂肪MSCs的ALP活性增高 ,VonKossa染色出现钙结节 ,OPN、BMP - 2免疫细胞化学染色阳性 ,Westernblotting检测到诱导后细胞OPN、BMP - 2的表达 ,且随诱导时间延长表达增强。结论　从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的MSCs,并能在体外稳定增殖传代 ,经诱导后可分化为脂肪细胞和成骨细胞 ,有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一     

促进脂肪来源间充质干细胞成骨分化的诱导方法研究进展

脂肪来源间充质干细胞(ASCs)是一种多能成体干细胞,因安全、含量丰富、易于获取等优点而有望成为理想的骨组织工程(BTE)种子细胞。然而,相较于骨髓间充质干细胞,ASCs的成骨分化能力有限,往往需要进一步诱导。该文从优化支架、添加生物活性因子或促成骨药物、非编码RNA调控和物理刺激几个方面,对促进ASCs成骨分化的诱导方法的研究进展进行综述,以期为BTE研究提供参考。     

高镁离子浓度对人骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的影响

背景:许多研究对镁合金浸提液的生物学作用进行了体外研究,但浸提液中pH值升高、钙离子浓度下降等变化会在体内体液缓冲系统作用下被减弱。目的:探讨不同浓度的高镁离子环境对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖与成骨分化的影响。方法:按照ISO-10993标准制作镁及几种常用镁合金浸提液,应用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)测定浸提液中镁离子含量。根据浸提液镁离子含量,配置镁离子最终浓度为2、4、6、8、10 mmol/L的完全培养基及成骨分化诱导培养基,未添加镁离子培养基作为对照组,使用以上培养基对hBMSCs进行培养。细胞在完全培养基组中培养1、3、6、12 d后,利用CCK-8实验评价细胞增殖率。成骨分化诱导培养基组培养细胞7、14 d后测定碱性磷酸酶活性,同时进行碱性磷酸酶染色,在培养第21天进行茜素红染色,并在溶解后进行半定量分析。上述细胞实验每组设置6个复孔。结果:镁及几种常用镁合金浸提液镁离子浓度在3~6 mmol/L之间。高镁离子环境培养1天后,2、4、6、8、10 mmol/L组hBMSCs相对增殖率均显著下降(77.5%±11.7%、78.2%±12.3%、71.5%±12.3%、73.8%±7.3%、81.6%±8.4%,P<0.05)。但培养第12天时,2、4、6 mmol/L组出现了对hBMSCs细胞增殖的促进效果(195.6%±36.5%、292.6%±52.6%、296.3%±52.1%,P<0.01)。培养过程中仅在第6天,8 mmol/L组(81.2%±20.8%,P=0.576)和10 mmol/L组(91.1%±17.5%,P=0.968)细胞增殖率出现下降,但差异无统计学意义。培养第7天时,2、4、10 mmol/L组碱性磷酸酶活性较对照组均显著提高(P<0.05)。培养至第14天时,2、4、6、8、10 mmol/L组碱性磷酸酶活性是对照组3倍以上(P<0.01)。茜素红染色及溶解后半定量分析提示2~10 mmol/L的细胞外高镁离子环境阻挡了细胞外基质矿化(P<0.01)。结论:2~10 mmol/L浓度的镁离子环境未对hBMSCs体现出显著细胞毒性,且适当的高镁离子浓度有利于hBMSCs增殖及成骨分化,但细胞外高镁离子浓度不利于细胞外基质矿化。     

兔骨髓基质干细胞促进珊瑚骨成骨的实验研究

目的探讨运用组织工程技术合成自体骨移植的替代物的可行性。方法从兔骨髓中分离基质干细胞进行体外培养扩增后，载人明胶海绵或珊瑚骨制成复合物。取24只6～9个月龄雌性新西兰白兔，随机分成四组，每组6只。第1组桡骨干中段15mm的骨缺损内植入明胶海绵，第2组植入明胶海绵＋骨髓基质干细胞（BMSCs），第3组植入珊瑚骨，第4期植入珊瑚骨＋BMSCs，对各组动物进行影像学、p,CT和组织学比较。结果仅植入明胶海绵的骨缺损全部形成典型的骨折不愈合表现；植入明胶海绵＋BMSCs后，骨缺损内的新骨形成明显增多，但仅有1只动物完全愈合；植入珊瑚骨后，骨缺损内有部分新骨形成，但术后16周无一例完全愈合；植入珊瑚骨＋BMSCs后，骨缺损内的载体支架被逐渐吸收的同时有大量的新骨形成，其中4只动物完全愈合。结论由体外分离和培养的BMSCs与珊瑚骨合成的组织工程骨具有可吸收性强、成骨能力好等特点，是一种具有发展前景的自体骨移植材料替代物。     

人骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的实验研究

目的 研究人骨髓间充质干细胞(human marrow mesenchymal stem cells，hMSCs)在体外单层培养条件下诱导分化为软骨细胞的可行性。方法 取志愿者骨髓9例，密度梯度离心获得hMSCs，进行诱导培养。光镜下观察诱导细胞形态学的改变，免疫组化、原位杂交、RT—PCR等方法检测胶原和糖蛋白的体外表达情况。结果 经诱导后hMSCs形态由长梭形逐渐向多角形转变，原位杂交、免疫组化等检测到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表达，RT—PCR检测到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、X、Ⅺ型胶原、aggrecan等mRNA表达。结论 hMSCs单层诱导培养条件下，能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、aggrecan等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。     

骨髓间充质干细胞与成骨

种子细胞研究是骨组织工程学的重要内容。理想的骨种子细胞应该具有以下特点：结构比较简单，是不具有特定机能的原始细胞；取材容易，对机体损伤小；体外培养时增殖力强；自我更新，一定的条件下能向特定的方向分化；稳定表达成骨细胞表型；植入体内后能继续产生成骨活动；无致瘤性。     

骨髓间充质干细胞成软骨分化研究进展

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓基质中的一种多能干细胞，在特定的培养条件下，MSCs可分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等多种间充质细胞。由于它们可以作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也被称为骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)。本文就骨髓MSCs的分离培养及成软骨分化的研究进展作一综述。     

具有骨诱导活性的仿生骨基质材料的制备

目的将一种具有与骨形态发生蛋白2相似骨诱导活性的多肽p24共价结合于改性聚（丙交酯-co-乙交酯）基质材料上，以制备出具有骨诱导活性的仿生骨基质材料。方法将活性多肽p24通过交联剂共价结合于改性PLGA材料上作为实验组；以未加交联剂多肽溶液和材料简单混合反应为对照组，通过X射线光电子光谱法和扫描电镜检测交联情况；同时对两组材料进行钙离子吸附实验，初步评价其仿生矿化能力。结果XPS检测结果表明，实验组及对照组材料表面均已结合硫元素，两者含有硫元素含量分别为1.50％及0.09％；钙离子吸附实验结果表明，12h及24h时实验组材料的钙离子吸附量分别为0，126mg及0．231mg；12h及24h时对照组材料的钙离子吸附量分别为0．053、0．102mg。多肽交联之材料较混合之材料的钙离子吸附能力显著增强。结论在改性PLGA三嵌段材料上固定了BMP2活性多肽，为以后发挥其骨诱导活性修复骨缺损奠定了良好基础。     

Ⅰ型胶原在PLGA-[ASP-PEG]表面修饰对兔骨髓基质干细胞生物力学的影响

目的探讨Ⅰ型胶原修饰聚乳酸-羟基乙酸/天冬氨酸-聚乙醇(PLGA-[ASP-PEG])支架材料对骨髓基质干细胞(BMSCs)在其表面粘附、增殖及成骨分化的影响。方法采用化学方法将Ⅰ型胶原接枝到PLGA-[ASP-PEG]表面,同时在材料表面物理涂层胶原溶液。将改性PLGA-[ASP-PEG]复合兔BMSCs培养,检测BMSCs粘附、增殖性能的变化及成骨标志物碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、核心结合因子al等的表达情况。结果X射线光电子能谱法证实Ⅰ型胶原成功接枝到PLGA-[ASP-PEG]表面。经化学接枝-物理涂层技术改性后PLGA-[ASP-PEG]膜表面的Ⅰ型胶原含量大大提高,明显高于经单纯化学接枝或单纯物理涂层技术改性后膜表面的胶原含量,且远高于二者之和。改性PLGA-[ASP-PEG]表面BMSCs的粘附、增殖能力显著提高,其成骨标志物的表达均显著高于对照组,差异有显著性意义(P＜0．05)。结论Ⅰ型胶原能显著改善PLGA-[ASP-PEG]的细胞生物相容性,为组织工程支架材料的优化提供了一种新途径。     

骨髓间充质干细胞的贴壁培养及内毒素对其增殖活性的影响

目的贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),并观察不同浓度内毒素对其增殖活性的影响。方法采用全骨髓贴壁培养法培养大鼠BMSCs,倒置显微镜下观察细胞形态,免疫细胞化学方法检测细胞CD44、CD29、CD34的表达,流式细胞术检测细胞周期。加不同浓度的内毒素(0、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)作用24h,用四唑盐比色法(MTT)检测BMSCs的增殖。结果分离培养的细胞三代以后呈均一的成纤维细胞样形态,高表达CD44,但不表达CD34、CD45。80%以上的第三代BMSCs处于G1期。不同浓度的LPS作用24h后各组的平均吸光度值(A)比较有统计学意义(F=3.598,P=0.007);0.01μg/mlLPS组A值与其余各组相比,具有统计学意义(P0.05)。结论全骨髓贴壁培养法可以方便、快捷地获得BMSCs,其在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性;0.01μg/mlLPS可明显促进BMSCs的增殖。     

传代种植密度对人间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的 :研究人间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)传代培养时 ,细胞种植密度对MSCs增殖及成骨诱导分化影响。方法 :将第 2代MSCs以 8× 10 3 /cm2 、 3× 10 3/cm2 、 8× 10 2 /cm2 密度接种 ,分析其生长曲线 ,并扩增培养 18d ,记录细胞扩增数量 ,再分析扩增后细胞的生长曲线和成骨诱导能力。结果 :人骨髓MSCs阴性表达ALP、CD3 4;在 8× 10 3/cm2 种植密度下 ,细胞倍增时间 40h ,18d后细胞数量扩增 (5 1± 13 )倍 ;在 3× 10 3 /cm2 种植密度下 ,细胞扩增 (2 8± 6)倍 ;在 8× 10 2 /cm2 种植密度下 ,细胞总数仅增加 (5± 3 )倍。在低密度下获得的细胞增殖能力强于高密度组 ,两组细胞均具有成骨诱导能力。结论 :种植密度对MSCs增殖有明显影响 ,快速扩增MSCs作为骨组织工程种子细胞 ,宜选择 8× 10 3 /cm2 种植密度。     

人间充质干细胞在骨组织工程中的应用

目的从数量与功能两方面探讨人间充质干细胞(humanmesenchymalstemcells,hMSCs)作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法髂骨穿刺,梯度离心分离获得hMSCs,体外扩增培养;对第3代细胞用地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C等成骨诱导培养,检测细胞碱性磷酸酶、骨钙素的表达和钙结节形成情况;诱导细胞与可吸收性复合支架材料体外构建复合体,植入裸小鼠皮下,对照组仅植入支架材料,术后3周取材检测骨钙素、Ⅰ型胶原表达。结果4ml骨髓含3.2×107～6.0×107个单个核细胞,培养3周收获hMSCs2.5×107～4.3×107;成骨诱导后,表达碱性磷酸酶、骨钙素阳性细胞数>50%,对照组<10%;诱导细胞与材料复合后植入体内仍然高表达骨钙素、Ⅰ型胶原。结论hMSCs能够满足体外构建组织工程化骨,对种子细胞数量和功能的要求。     

Effect of type I collagen on the adhesion, proliferation, and osteoblastic gene expression of bone marrow-derived mesenchymal stem cells

tificially synthesizedpolymericproductssuchaspolylactide (PLA ) ,polyglycolide (PGA ) ,andtheircopolymersarefrequently usedtissueengineeringmatrixsubstitutivematerials .Unfortunately ,theirapplicationisseriouslyrestrictedfortheirpoorhydrophilicproperty ,weakcelladsorptionforces ,anddifficultyininteractionwithcells .1,2 ThisstudyintendstoevaluatethecapacityofcollagenIinpromotingadhesion ,proliferation ,anddifferentiationofMSCs ,tolayanexperimentalbasisforbonytissueengineering .METHODSPrep…     

脊索细胞培养基促进BMSCs增殖分化的研究

目的为研究椎间盘组织工程种子细胞,观察脊索细胞培养基对BMSCs增殖分化的影响。方法取4周龄日本大耳白兔胸腰段椎间盘分离培养脊索细胞,取双侧股骨分离培养BMSCs,用含15%FBS的DMEM/F12培养基培养脊索细胞,5 d后制备脊索细胞培养基。实验分为两组,实验组BMSCs中加入脊索细胞培养基培养,对照组BMSCs中加入含15%FBS的DMEM/F12培养基培养。使用细胞活力细胞毒性检测检测细胞增殖情况,采用免疫荧光及实时荧光定量PCR检测BMSCs蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达情况。结果成功分离脊索细胞及BMSCs。细胞增殖检测示,培养5、7、9、14 d,实验组细胞数量明显多于对照组(P<0.05)。免疫荧光检测示对照组培养7、14 d细胞内均无或者有较少Ⅱ型胶原及蛋白多糖表达,实验组二者均有较多表达,且培养14 d时表达明显多于7 d。实时荧光定量PCR检测示,培养7、14 d实验组蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA表达均显著高于对照组(P<0.05);实验组14 d蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA表达显著高于7 d(P<0.05)。结论脊索细胞培养基可促进BMSCs增殖,并诱导BMSCs向类软骨细胞分化,为脊索细胞和BMSCs作为种子细胞治疗椎间盘退变提供了依据。     

经骨向诱导的骨髓间充质干细胞在脱钙骨上生长行为的实验研究

目的:建立成骨细胞-脱钙骨支架复合物,观察其诱导成骨能力,从而探寻组织工程化骨的体外构建方法.方法:运用细胞沉淀法将大鼠BMSCs诱导形成的成骨细胞接种于脱钙骨支架,通过扫描电镜(SEM)、免疫荧光观察脱钙骨表面细胞生长情况,通过上清液碱性磷酸酶(ALP)活性及Ⅰ型前胶原羧端肽(PICP)、骨钙素检测观察成骨细胞活性.结果:扫描电镜示成骨细胞在脱钙骨表面生长良好,上清液ALP、PICP及骨钙素表达均明显高于对照组(P＜0.05),并随时间的增长而显著增加(P＜0.05).结论:采用细胞沉淀法成功将成骨细胞接种于脱钙骨支架,成骨细胞在支架材料中增殖旺盛,细胞活性状态良好,具有良好的骨形成能力,脱钙骨支架可作为骨组织工程中载体支架的较优选择.     

软骨细胞外基质源性取向支架与骨髓基质干细胞体外软骨组织工程的初步研究

目的 制备关节软骨细胞外基质源性取向支架,观察其对体外培养的骨髓基质干细胞分布排列的影响,探索其用于修复关节软骨缺损的可行性.方法 收集天然猪关节软骨,在PBS溶液中超微湿法粉碎关节软骨,利用差速离心收集细胞外基质悬液;低温超速离心收集沉淀,制备成2%～3%悬液;采用定向结晶与冷冻干燥技术制备取向支架,应用紫外交联及碳化二亚胺交联.光学显微镜及扫描电镜观察支架的形态结构,冰冻切片后组织化学染色对支架进行定性分析;生物力学方法检测支架的力学特性.分离培养兔骨髓基质干细胞,PKH26标记,接种到支架上体外软骨诱导培养,倒置荧光显微镜及扫描电镜观察培养3 d内种子细胞在支架内的黏附、分布及排列方式.结果 制备的支架材料具有垂直取向排列的孔道结构,软骨细胞外基质特异性染色阳性,纵向压缩弹性模量为(2.02±0.02)MPa,横向压缩弹性模量为(0.264±0.16)MPa,具有各向异性的力学特点.体外培养显示骨髓基质干细胞广泛均匀地分布在支架内部,并且在支架材料表层呈平行排列,深层呈柱状排列,类似于天然软骨组织中细胞的排列方式.结论 以关节软骨细胞外基质材料制备的取向性组织工程支架,在生化组成和结构上仿生天然关节软骨细胞外基质,是一种较为理想的软骨组织工程支架.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、扩增及诱导分化

目的探讨兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)体外培养、定向诱导分化为成骨细胞和成脂肪细胞的途径,为进一步的实验研究打下基础。方法抽取兔股骨骨髓,以全骨髓贴壁培养法进行体外培养,贴壁细胞传代,倒置显微镜下观察细胞形态。取第3代细胞向成骨细胞和成脂肪细胞诱导,14d后成骨细胞诱导组检测碱性磷酸酶,成脂肪细胞诱导组进行油红O染色。结果全骨髓贴壁培养法可获得BM-MSCs,原代和传代培养的BM-MSCs具有活跃的增殖能力。成骨细胞诱导组碱性磷酸酶检测表达阳性,成脂肪细胞诱导组油红O染色见胞浆内出现大量红染脂滴。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BM-MSCs,分离培养的BM-MSCs生长稳定,增殖力强,可向成骨细胞和成脂肪细胞诱导分化。