金黄色葡萄球菌traP突变菌株的构建和功能研究

目的通过构建traP突变菌株研究RNAⅢ激活蛋白靶蛋白（TRAP）蛋白在金黄色葡萄球菌（SAU）中的功能。方法利用同源重组的方法在金黄色葡萄球菌（SAU）8325-4中构建traP的缺失突变菌株,对其表型和几种压力条件下的生长和生存状况进行检测,揭示其在金黄色葡萄球菌生命活动中的作用。结果在金黄色葡萄球菌8325-4中成功构建了traP的缺失突变菌株,突变株生长缓慢,其他表型如疏水性、表面电荷和生物膜发生了明显的变化;在重金属、过氧化氢,以及全血杀伤等压力条件下的生长和生存状况也发生了明显改变。结论TRAP蛋白在金黄色葡萄球菌侵袭机体的过程中发挥着重要的功能。     

金黄色葡萄球菌MgrA蛋白对喹诺酮类药物耐药性影响研究

目的了解金黄色葡萄球菌MgrA蛋白对喹诺酮耐药性的影响,为临床治疗金黄色葡萄球菌感染提供实验室依据。方法以本实验室已经构建的MgrA高表达质粒为研究材料,采用琼脂平板倍比稀释法检测金黄色葡萄球菌耐药株和敏感株、转MgrA组的MIC、凝固酶活性、荧光定量PCR、半定量PCR。结果转MgrA的金黄色葡萄球菌对喹诺酮类药物的耐药性增高,其NorA的表达与MgrA的表达具有线性关系,即MgrA高表达组的NorA表达也增高。结论MgrA蛋白mRNA表达水平与金黄色葡萄球菌氟喹诺酮耐药性相关,其介导耐药的原因可能与NorA基因mRNA表达水平增高有关。     

新疆奶牛乳房炎病例中金黄色葡萄球菌生物学特性研究

对新疆6个牛场采集的304份奶牛乳房炎阳性奶样进行了金黄色葡萄球菌分离鉴定,分离率为29.2%。挑选64株菌进行了生长特性、生化、药物敏感性、致病力以及免疫原性研究。结果显示,这些菌株菌呈现α或α、β溶血,过氧化氢酶和凝固酶阳性;多数菌株对常用抗生素不敏感;75%的菌株生化反应为733720型,染色体DNA为16512bp;不同菌株的免疫原性差异很大,而且存在较广泛的交叉凝集。     

金黄色葡萄球菌Efb蛋白的表达、纯化及功能抗体的制备

目的：利用大肠杆菌重组表达金黄色葡萄球菌外分泌蛋白Efb（extracellular fibrinogen-binding protein,细胞外纤维蛋白原结合蛋白）,检测其生物学活性,并制备其功能性抗体,以探讨Efb蛋白在金葡菌感染中的生物学意义。方法：以金黄色葡萄球菌NCTC-8325菌株基因组为模板,PCR扩增efb基因,构建重组表达载体pET28a-Efb,转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用IPTG诱导表达,通过Ni柱亲和纯化获得Efb;通过补体激活试验及竞争ELISA的方法检测Efb蛋白的生物学活性,免疫动物制备抗体。结果：获得了纯度较高的重组Efb蛋白,重组蛋白能够有效抑制CH50以及AH50,并且制备了Efb的功能性多克隆抗体。结论：Efb蛋白能够抑制补体激活的经典途径及替代途径,其特异性抗体能够阻断对于补体激活经典途径的抑制作用。     

金黄色葡萄球菌黏附因子ClfA作为金黄色葡萄球菌疫苗组分的研究

目的研究黏附因子丛生因子A（clumping factor A,ClfA）在金黄色葡萄球菌（SAU）不同菌株中的分布情况,为开发具有广泛保护效果的SAU疫苗奠定基础。方法采用PCR法扩增目的基因,构建重组质粒,以大肠杆菌BL21（DE3）为表达宿主,对目的蛋白进行表达、纯化。PCR及点杂交法检测ClfA在不同菌株中的分布情况。结果得到纯度较高的目的蛋白,PCR及点杂交结果显示ClfA存在于菌株USA300,而在菌株546、1884、1885中并无分布。结论 ClfA在SAU各菌株中分布不广泛,可能难以作为具有广泛保护效果的SAU疫苗组分。     

金黄色葡萄球菌ltaS突变株的构建与eLtaS蛋白的表达

目的通过构建金黄色葡萄球菌(SAU)ltaS突变株以及体外重组表达其胞外形式的eLtaS蛋白,研究LtaS以及eLtaS蛋白在SAU中的生物学功能。方法利用同源重组的方法构建SAU 8325-4来源的ltaS缺失突变菌株,并对其生长以及外毒素水平进行检测;同时,在大肠杆菌中,体外重组表达并纯化eLtaS蛋白,继而观察其对SAU生长的影响。结果在SAU 8325-4中成功构建了ltaS缺失突变菌株,并发现ltaS突变株生长较野生型菌株缓慢;通过表达纯化成功获得高纯度的eLtaS蛋白,其与突变株共培养后对突变株的生长缓慢现象没有回复作用。结论 LtaS蛋白在SAU侵袭机体的过程中发挥着重要的功能,其胞外形式的eLtaS蛋白可能未参与脂磷壁酸(lipotei-choic acid,LTA)的合成。     

金黄色葡萄球菌ltaS突变株的构建与eLtaS蛋白的表达

目的通过构建金黄色葡萄球菌（SAU）ltaS突变株以及体外重组表达其胞外形式的eLtaS蛋白,研究LtaS以及eLtaS蛋白在SAU中的生物学功能。方法利用同源重组的方法构建SAU 8325-4来源的ltaS缺失突变菌株,并对其生长以及外毒素水平进行检测;同时,在大肠杆菌中,体外重组表达并纯化eLtaS蛋白,继而观察其对SAU生长的影响。结果在SAU 8325-4中成功构建了ltaS缺失突变菌株,并发现ltaS突变株生长较野生型菌株缓慢;通过表达纯化成功获得高纯度的eLtaS蛋白,其与突变株共培养后对突变株的生长缓慢现象没有回复作用。结论 LtaS蛋白在SAU侵袭机体的过程中发挥着重要的功能,其胞外形式的eLtaS蛋白可能未参与脂磷壁酸（lipotei-choic acid,LTA）的合成。     

左氧氟沙星与头孢硫脒合用对金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌粪肠球菌体外抗菌活性研究

目的 评价左氧氟沙星与头孢硫脒联合应用对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和粪肠球菌的体外联合抗菌作用。方法采用棋盘法设计,微量肉汤稀释法测定其MIC值,计算FIC指数。结果左旋氧氟沙星与头孢硫脒联合应用后,左旋氧氟沙星对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、MRSA、MRSE的MIC50均有明显降低。同样,头孢硫脒对金色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、MRSA、MRSE的MIC50亦显著下降,FIC指数范围主要在0—1。结论左氧氟沙星与头孢硫脒药物联合应用,对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和粪肠球菌的体外联合抗菌作用以协同和相加为主。     

肚痛丸体外抗白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的活性测定

肚痛丸为木油、黄柏、陈皮、颠茄和甘草等 5种中药提取有效成分制成的中药蜜丸剂 ,具有止痛、抗菌、止泻等功效 ,临床上用于治疗腹痛、腹泻、牙痛 ,效果显著。我们采用外抗菌试验方法中的琼脂稀释法 ,研究肚痛丸提取液体外抗白色念珠菌和金黄色葡萄球菌活性 ,测定其最低抑菌浓度 (Ｍｉｎｉ ｍｕｍｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ,ＭＩＣ)。现将实验结果报告如下。1　材料和方法1 1　实验药品　肚痛丸 (批号 2 0 0 0 2 12 ,2 0 0 0 2 15 ,2 0 0 0 2 2 0 ,由北京大学药学院提供提取液 ) ;黄连素片 (北京永康制药厂 ,批号 99…     

金黄色葡萄球菌糖肽水解酶LytM及其C端的表达、纯化与功能研究

目的利用大肠杆菌重组表达金黄色葡萄球菌（SAU）糖肽水解酶LytM及其C端185～316 aa蛋白（LytM185～316）,检测其生物学活性,并制备多克隆抗体,为检测LytM活性体的天然形式和产生机制以及研究LytM蛋白在SAU感染中的生物学意义奠定基础。方法以SAU 8325-4基因组为模板,PCR扩增lytM及其C端基因,并将其克隆入pET-28a构建重组表达载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3）,利用IPTG诱导阳性克隆表达目的蛋白,通过亲和纯化获得目的蛋白LytM及LytM185～316,并制备LytM的多克隆抗体;用薄层层析法测定LytM以及LytM185～316的生物活性,并检测重组蛋白对SAU 8325-4菌体的裂解作用。结果成功构建了表达载体pET-28a-LytM和pET-28a-LytM185～316,获得了纯度较高的重组蛋白LytM及LytM185～316,经测定LytM不能够水解底物而LytM185～316具有较强的糖肽水解酶活性。制备了高效价的抗LytM的多克隆抗体,并证实其可以与LytM及LytM185～316特异性结合。结论只含有C端185～316 aa的重组蛋白能够水解底物,而全长的LytM不具有糖肽水解酶活性。     

烧伤病人耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及其肠毒素的检测和耐药性分析

目的:评价乳胶结合实验,检测重症监护病房(ICU)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)及其肠毒素(SE),并进行耐药性分析。方法:收集260株金黄色葡萄球菌临床分离株,通过药敏试验将其分为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA),用反向间接血凝试验(RPHA)检测金黄色葡萄球菌肠毒素。结果:MRSA产肠毒素为134株,MSSA产肠毒素为38株,MRSA产肠毒素率为100％,MSSA产肠毒素率为30％。结论:重症监护病房应重视MRSA的检测和金黄色葡萄球菌肠毒素的检测,合理使用广谱抗菌药物。     

158株金黄色葡萄球菌耐药性分析

目的了解住院患者感染的金黄色葡萄球菌(methicillin sensitive staphylococcus aureus,MSSA)对常用抗生素的耐药情况,以指导临床合理使用抗生素。方法应用VITEK32微生物自动鉴定分析系统,采用K-B法对2009-03至2011-10临床各科室分离的158株MSSA进行药物敏感性试验,并对其药敏结果进行统计分析。结果 158株MSSA中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)96株,占60.76%,对青霉素G、氨苄西林100%耐药,对万古霉素100%敏感;对甲氧西林敏感MSSA,占39.24%,对青霉素G、氨苄西林耐药率分别为69.35%和67.74%,对利奈唑胺、喹努普汀/达福普汀和万古霉素100%敏感。结论 MSSA是临床感染的主要病原菌之一,分析MSSA耐药情况,可以指导临床合理选用抗生素。     

黄芩苷协同头孢唑啉对金黄色葡萄球菌生物膜的体外研究

目的 研究黄芩苷对金黄色葡萄球菌（S.a）生物膜（BF）的破坏作用以及与头孢唑啉（CEZ）的协同杀菌效果。方法选取临床分离的编号为17546的S.a构建体外BF模型,试管二倍稀释法测定最低抑菌浓度（MICs）和最低杀菌浓度（MBCs）,结晶紫染色法半定量BF,连续稀释法活茵计数。结果BF经黄芩苷作用24h后BF半定量结果显示,黄芩苷组吸光度值为（1．284±0．076）,黄芩苷＋CEZ组第16h、24h分别为（0．931±0．206）、（0．611±0．738）,均少于空白对照组（P〈0．01）。黄芩苷＋CEZ组第8h、16h、24hBF内的活菌计数分别为（6．906±0．376）×lgCFU／ml、（6．801±0．109）×lgCFU／ml、（6．014±0.340）×lgC-FU／ml．均少于空白对照组（P〈0．01）。结论黄芩苷和CLA能破坏S.a已形成的BF,并可增强CEZ对BF内S.a的清除作用。     

荧光定量PCR快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立

目的利用SmartCycler系统建立一种简便、快速的荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,简称SAU）的方法。方法根据SAU特异nuc基因设计引物和探针,建立检测体系,并在体系中加入内质控IAC,通过另一个标记不同荧光基团的TaqMan探针来监测IAC。用SAU6538株污染饮用水和牛奶模拟实际样本,以评价体系的性能。结果以含nuc片段的线性质粒为模板,反应体系的灵敏度为5拷贝/μl;以6538株基因组DNA为模板,最低检测限为10fg/μl;用涂平板法计数并10倍梯度稀释的菌液提取DNA为模板,最低检测限为50cfu/ml。建立的定量标准曲线的循环域值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r2≥0.998）,PCR效率E≥96.7%。用SAU6538污染饮用水和牛奶模拟实际样本,灵敏度可达5×102cfu/25ml样本。结论所建立的nuc-IAC荧光定量PCR具有内质控IAC,既能定量检测食物是否被污染,又能监测PCR体系,防止假阴性发生或低估病原菌污染量。     

烧伤创面耐药金黄色葡萄球菌的分离及其norA基因突变分析

目的 探讨野生型耐药金黄色葡萄球菌的norA基因及其启动子的突变情况.方法 分离并筛选出10株烧伤刨面的耐药性金黄色葡萄球菌,对norA基因及其启动子进行测序并分析其改变.结果 共分离出金黄色葡萄球菌87株,它们对万古霉素100%敏感,对奎奴普汀和呋喃妥因也有很高的敏感性,而对其余抗生素的耐药率则非常高;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的阳性率达到91.7%.所有10株实验菌的norA基因编码区都有1 349位G→A的点突变,也就是氨基酸的291位处存在Gly(甘氨酸)→A8p(天冬氨酸)的突变.利血平逆转实验提示10株细菌对三种抗生素的MICs值均存在不同程度的下降.结论 norA基因突变是金黄色葡萄球菌耐药的机制之一.

Abstract：

Objective To investigate the genetic mutation of the norA gene and its promotor from the wild-type drug-resistance Staphylococeus aureus(S.aureus)strains. Methods A total of 10 antibiotic-resistant S.aureus strains were isolated and screened from the burn wound for the sequencing and analysis of the nora gene and its promoter. Results There isolated 87 S.aureus strains from the burn wound flora,which were completely sensitive to vacomycin,highly sensitive to Quinupristin and Nitrofurantoin,but highly resistant to the other antibiotics,even up to91.7% of MRSA.There found the same point mutation(G→A) located at 1 349 sites of the norA gene coding region in all the S.aureus strains,saying that the amino acid was changed from Gly(glycin)to Asp(agpartic acid) in 291 sites.The resetpine reverse test showed that the MICs value of three antibiotics was lowered at various degrees in all 10strains.Conclusion NorA gene mutation is one of the mechanisms for antibiotic-resistance of S.aureus.