K562／H20和K562／Mel细胞株对高三尖杉酯碱与马法兰耐药机制…

为比较高三尖杉酯碱和马法兰的耐药机制，对天然来源抗肿瘤药不打自招 高三尖杉酯碱耐药株Ｋ５６２／Ｈ２０与烷化剂马法兰耐药株Ｋ５６２／Ｍｅｌ耐药机制进行研究，发现前者对长春新碱、柔红霉素、阿霉素具有广泛交叉耐药，对马法兰耐药水平较低；后者对氮齐、噻替派有明显交叉耐药。在耐药机制上，前者主要由于多药耐药基因过度表达所致，谷胱甘肽－Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）π、α基因也参与部分耐药机制，后者主要由于ＧＳＴα基因     

烷化剂马法兰耐药细胞系L1210／Mel的建立及其耐药机制的研究

应用逐步增加剂量的方法在体外建立两株耐不同剂量马法兰（Ｍｅｌ）的小鼠白血病细胞系，命名为Ｌ＿（１２１０）／Ｍｅｌ＿１及Ｌ＿（１２１０）／Ｍｅｌ＿２，它们分别对Ｍｅｌ耐药３．６倍及９．９倍，后者对氮芥及噻哌有明显交叉耐药，而对卡氮芥及阿霉素仍敏感。我们发现随着Ｍｅｌ耐药水平增加，其谷胱甘肽－Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）总量及ＧＳＴα基因表达水平明显增加，而ＧＳＴπ轻度升高，多药耐药基因ＭＤＲ－１及ＧＳＴμ基因表达水平无明显升高，表明ＧＳＴα基因与马法兰耐药密切相关。此外，还检测了马法兰诱导的ＤＮＡ交联率，结果发现耐药株在４小时后ＤＮＡ交联宰低于敏感株，在２４小时ＤＮＡ交联得到完全恢复。这表明耐药株中ＤＮＡ损伤减少，而ＤＮＡ修复功能大大增强。     

耐药人白血病细胞GSH含量、GST活力及其同工酶、MRP表达的研究

目的：了解多药耐药基因（ｍｄｒ１）机制以外导致人白血病细胞耐药的因素。方法：采用生化方法，对Ｋ５６２和ＨＬ６０敏感和耐药细胞株谷胱甘肽（ＧＳＨ）含量、谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴ）活力进行测定；用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交对ＧＳＴα、π、μ和多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）ｍＲＮＡ表达进行检测；用Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交对ＧＳＴα、π、μ蛋白表达进行检测。结果：与敏感株相比，Ｋ５６２／Ｈ２０和Ｋ５６２／ＶＣＲ的ＧＳＨ含量、ＧＳＴ活力明显增高，ＨＬ６０／Ａｄｒ的ＧＳＨ含量和ＧＳＴ活力无明显增高，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ和Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交可见ＧＳＴα、π和ＧＳＴπ、μ在Ｋ５６２／Ｈ２０和Ｋ５６２／ＶＣＲ过度表达，ＨＬ６０／Ａｄｒ无ＧＳＴ同工酶过度表达，ＭＲＰ在三种耐药株均有过度表达。结论：ＧＳＨ、ＧＳＴ和ＭＲＰ参与了Ｋ５６２／Ｈ２０和Ｋ５６２／ＶＣＲ耐药，ＨＬ６０／Ａｄｒ耐药与ＧＳＨ、ＧＳＴ无关，与ＭＲＰ有关。在实际应用中，应对多种耐药指标同时进行检测     

干扰素α体外逆转烷化剂马法兰耐药的研究

在两株对烷化剂马法兰（Ｍｅｌ）耐药的白血病细胞系Ｌ１２１０／Ｍｅｌ及Ｋ５６２／Ｍｅｌ中，我们发现无细胞毒性剂量的干扰素。（ＩＦＮ－α）能明显逆转Ｍｅｌ耐药。在该两个耐药细胞系中，Ｍｅｌ杀伤率被ＩＦＮ－α分别增强３．７倍及２．１倍，其效果优于国际上常用烷化剂耐药逆转剂利尿酸（ＥＡ）。其逆转机制与ＥＡ不同，ＩＦＮ－α不能抑制谷恍甘肽－Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）总活性，却能够特异性降低ＧＳＴ－α基因的表达水平。这一研究结果表明，干扰素－α可作为骨髓移植预处理方案的辅助药物以增强烷化剂对肿瘤细胞的清除率，并且为ＧＳＴα参与烷化剂Ｍｅｌ的耐药机制提供进一步证据。     

甲诺孕酮和屈洛昔分对K562／A02细胞株多种耐药机制的调节

目的 研究甲诺孕酮（ＮＯＭ）和屈洛昔芬（ＤＲＯ）对Ｋ５６２／Ａ０２细胞株耐药基因ｍｄｒｌ、谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴπ）、拓扑异构酶Ⅱα（ＴｏｐｏⅡα）和多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）的调节。方法 应用细胞培养技术，采用ＭＴＴ比色法、免疫组织化学、逆转录－聚合酶链反应和流式细胞术分析。结果 ＮＯＭ和ＤＲＯ均可明显提高Ｋ５６２／Ａ０２细胞株对阿霉素（ＡＤＭ）的敏感性，增加细胞内ＡＤＭ积累量。可显下调ｍ     

人类白血病耐药细胞系K562／VCRmdrl及GST表达的研究

建立了一种高度敏感、特异性强并能定量的逆转录／多聚酶链反应（ＲＴ／ＰＣＲ）检测ｍｄｒｌｍＲＮＡ的方法，用该法研究Ｋ５６２／Ｓ及Ｋ５６２／ＶＣＲ细胞系ｍｄｒｌ基因表达。结果显示Ｋ５６２／ＶＣＲ有较高水平ｍｄｒｌ基因表达（０．８６），而Ｋ５６２／Ｓ未检测到表达。此外，利用酶学方法和点杂交方法在蛋白质和ｍＲＮＡ水平上检测了Ｋ５６２／Ｓ和Ｋ５６２／ＶＣＲ中谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴ）活性及其基因表达，发现Ｋ５６２／ＶＣＲ中ＧＳＴ活性明显高于Ｋ５６２／Ｓ（Ｐ＜０．００５），且该种活性的增高是由ＧＳＴπ、ＧＳＴμ过度表达引起。     

甲诺孕酮和屈洛昔芬对K562/A02细胞株多种耐药机制的调节

目的研究甲诺孕酮（ＮＯＭ）和屈洛昔芬（ＤＲＯ）对Ｋ５６２／Ａ０２细胞株耐药基因ｍｄｒ１、谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴπ）、拓扑异构酶Ⅱα（ＴｏｐｏⅡα）和多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）的调节。方法应用细胞培养技术,采用ＭＴＴ比色法、免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应和流式细胞术分析。结果ＮＯＭ和ＤＲＯ均可明显提高Ｋ５６２／Ａ０２细胞株对阿霉素（ＡＤＭ）的敏感性,增加细胞内ＡＤＭ积累量。可显著下调ｍｄｒ１、ＧＳＴπ的ｍＲＮＡ和蛋白表达,明显上调ＴｏｐｏⅡα基因表达。Ｋ５６２敏感株的ＧＳＴπ基因表达同样被抑制。都具有明显的时间依赖性。ＭＲＰ基因表达的变化差异无统计学意义。结论ＮＯＭ和ＤＲＯ可明显逆转Ｋ５６２／Ａ０２细胞株对ＡＤＭ的耐药性。ＮＯＭ与异搏定逆转强度相似;两药对ｍｄｒ１、ＧＳＴπ和ＴｏｐｏⅡα基因表达均有明显调节作用。调节呈时间依赖性。     

rhG-CSF对K562／A02多药耐药细胞增殖的影响

ｒｈＧ－ＣＳＦ对Ｋ５６２／Ａ０２多药耐药细胞增殖的影响祁明芳魏素芳汪明春齐静杨纯正造血细胞生长因子是否存在促白血病细胞增殖作用仍是临床医师所担心的问题。我们就重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）对多药耐药细胞系Ｋ５６２／Ａ０２和药物敏感细胞系Ｋ...     

人类白血病耐药细胞系K562／VCR mdr1及GST表达的研究

建立了一种高度敏感、特异性强并能定量的逆转录／多聚酶链反应（ＲＴ／ＰＣＲ）检测ｍｄｒ１ ｍＲＮＡ的方法，用该法研究Ｋ５６２／Ｓ及Ｋ５６２／ＶＣＲ细胞系ｍｄｒ１基因表达。结果显示Ｋ５６２／ＶＣＲ有较高水平ｍｄｒ１基因表达（０．８６），而Ｋ５６２／Ｓ未检测到表达。此外，利用酶学方法和点杂交方法在蛋白质和ｍＲＮＡ水平上检测了Ｋ５６２／Ｓ和Ｋ５６２／ＶＣＲ中谷脱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴ）活性及其基因表达，发现     

高三尖杉酯碱诱导K562细胞凋亡的实验研究

高三尖杉酯碱（ＨＨＴ）是从三尖杉属植物中分离出来的一种生物碱，临床上广泛地用于急性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病等的治疗。我们以Ｋ５６２细胞为材料，观察ＨＨＴ对白血病细胞的杀伤模式及其引发的细胞死亡形式，以进一步研究ＨＨＴ对白血病细胞损伤的机制。材...     

Biochemically-defined differentiation markers on human early haemopoietic (K562) cells

Both haemin, contrary to a previous report, and the tumor promoter TPA induce pronounced changes in surface protein patterns of human erythroleukaemic (K562) cells. Three major surface proteins are down-regulated by both inducers. These are not merely growth-related proteins and therefore represent candidate markers for an early stage of haemopoietic differentiation.     

K562细胞及其耐药细胞株K562/A02细胞白血病耐药相关microRNA筛选

目的 通过检测慢性粒细胞白血病急变细胞系K562及其阿霉素耐药株K562/A02的微小RNA(microRNA、miR)表达差异,探讨microRNA与白血病化疗耐药的关系.方法 MTT法检测K562/A02及其亲本细胞系K562的耐药性能;流式细胞术检测K562与K562/A02细胞的P-gp表达;运用microRNA芯片技术筛查K562与K562/A02细胞之间差异表达的microRNA,随后用实时荧光定量RT-PCR方法进一步证实.结果 阿霉素耐药株K562/A02相对于其亲本细胞系K562对阿霉素的耐药倍数为180倍;K562细胞P-gp的表达率为0.2%,K562/A02细胞P-gp的表达率为86%;microRNA芯片结果显示K562/A02与K562细胞之间有22种microRNA表达存在显著的差异(P<0.01),表达差异在2倍以上的有9种,其中miR-221、miR-155、miR-451在K562/A02细胞表达上调,而miR-98、miR-181a、let-7f、miR-424、let-7g和miR-563则表达下调.实时荧光定量RT-PCR进一步证实了上述结果,并显示miR-451、miR-155、miR-221、let-7f、miR-424在两种细胞中表达差异显著.结论 K562/A02与K562细胞存在microRNA表达差异,其中miR-451、miR-155和miR-221在K562/A02中表达显著上调,而let-7f、miR-424则显著下调,提示microRNA可能参与白血病耐药形成,差异表达的microRNA可能为逆转白血病耐药提供新的作用靶点.     

K562细胞及其耐药细胞株K562/A02细胞白血病耐药相关microRNA筛选

目的 通过检测慢性粒细胞白血病急变细胞系K562及其阿霉素耐药株K562/A02的微小RNA(microRNA、miR)表达差异,探讨microRNA与白血病化疗耐药的关系.方法 MTT法检测K562/A02及其亲本细胞系K562的耐药性能;流式细胞术检测K562与K562/A02细胞的P-gp表达;运用microRNA芯片技术筛查K562与K562/A02细胞之间差异表达的microRNA,随后用实时荧光定量RT-PCR方法进一步证实.结果 阿霉素耐药株K562/A02相对于其亲本细胞系K562对阿霉素的耐药倍数为180倍;K562细胞P-gp的表达率为0.2%,K562/A02细胞P-gp的表达率为86%;microRNA芯片结果显示K562/A02与K562细胞之间有22种microRNA表达存在显著的差异(P<0.01),表达差异在2倍以上的有9种,其中miR-221、miR-155、miR-451在K562/A02细胞表达上调,而miR-98、miR-181a、let-7f、miR-424、let-7g和miR-563则表达下调.实时荧光定量RT-PCR进一步证实了上述结果,并显示miR-451、miR-155、miR-221、let-7f、miR-424在两种细胞中表达差异显著.结论 K562/A02与K562细胞存在microRNA表达差异,其中miR-451、miR-155和miR-221在K562/A02中表达显著上调,而let-7f、miR-424则显著下调,提示microRNA可能参与白血病耐药形成,差异表达的microRNA可能为逆转白血病耐药提供新的作用靶点.     

K562细胞及其耐药细胞株K562/A02细胞白血病耐药相关microRNA筛选

目的 通过检测慢性粒细胞白血病急变细胞系K562及其阿霉素耐药株K562/A02的微小RNA(microRNA、miR)表达差异,探讨microRNA与白血病化疗耐药的关系.方法 MTT法检测K562/A02及其亲本细胞系K562的耐药性能;流式细胞术检测K562与K562/A02细胞的P-gp表达;运用microRNA芯片技术筛查K562与K562/A02细胞之间差异表达的microRNA,随后用实时荧光定量RT-PCR方法进一步证实.结果 阿霉素耐药株K562/A02相对于其亲本细胞系K562对阿霉素的耐药倍数为180倍;K562细胞P-gp的表达率为0.2%,K562/A02细胞P-gp的表达率为86%;microRNA芯片结果显示K562/A02与K562细胞之间有22种microRNA表达存在显著的差异(P<0.01),表达差异在2倍以上的有9种,其中miR-221、miR-155、miR-451在K562/A02细胞表达上调,而miR-98、miR-181a、let-7f、miR-424、let-7g和miR-563则表达下调.实时荧光定量RT-PCR进一步证实了上述结果,并显示miR-451、miR-155、miR-221、let-7f、miR-424在两种细胞中表达差异显著.结论 K562/A02与K562细胞存在microRNA表达差异,其中miR-451、miR-155和miR-221在K562/A02中表达显著上调,而let-7f、miR-424则显著下调,提示microRNA可能参与白血病耐药形成,差异表达的microRNA可能为逆转白血病耐药提供新的作用靶点.     

K562 leukemia cells express P2T (adenosine diphosphate) purinergic receptors.

The P2T purinergic receptor for ADP has previously been found only in platelets. We investigated the effect of ADP on the concentration of intracellular free calcium ([Ca++]i) in fura-2-loaded K562 leukemia cells, a cell line with the potential for megakaryocytic differentiation. ADP causes a rapid and transient increase in [Ca++]i, which peaks within 5 to 10 sec. The EC50 for this response is 0.4 microM. A major portion of the increased calcium is due to mobilization of intracellular stores because the response to ADP is only partially reduced in the absence of extracellular calcium. Exposure to ADP desensitizes K562 cells to additional administrations of this nucleotide. Pretreatment of K562 cells with the protein kinase C activator phorbol 12-myristate 13-acetate completely blocks the response to ADP. This effect of phorbol 12-myristate 13-acetate is prevented by the protein kinase C inhibitor staurosporine, but staurosporine does not affect the progression of desensitization after repeated ADP exposures. ATP does not increase [Ca++]i in K562 cells, but antagonizes the response to ADP. We propose that the P2T receptor for ADP in K562 cells is an early marker for megakaryocytic differentiation. Furthermore, this immortalized nucleated cell line may be a useful model to decipher the signal transduction pathways involved in the ADP response.     

三氧化二砷联合丁硫氨酸亚砜胺对K562/ADM细胞的作用及其机制研究

目的 研究三氧化二砷（As2O3）联合γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂丁硫氨酸亚砜胺（BSO）对肿瘤多药耐药细胞株K562／ADM细胞的诱导凋亡效应，及对P糖蛋白（P—gp）和mdr1mRNA表达的抑制作用，探讨谷胱甘肽（GSH）的含量变化与As2O3作用效果的关系。方法As2O3（0．5、2．0、5．0μmol／L）单独及联合100μmol／LBSO作用于K562／ADM细胞，应用MTT比色法检测K562／ADM细胞的增殖活性；膜联蛋白V／碘化丙锭（AnnexinV／PI）标记法观察K562／ADM细胞的凋亡效应；分光光度法检测K562／ADM细胞内GSH含量变化；流式细胞术（FCM）检测P—gp水平变化；RT—PCR方法检测mdr1mRNA的表达变化。结果 K562／ADM细胞内的GSH含量为（81．13±3．91）mg／g蛋白，在BSO降低GSH含量后，临床剂量（0．5、2．0μmol／L）As2O3联合BSO（100μmol／L）24h内即可抑制K562／ADM细胞的增殖活性，诱导K562／ADM细胞发生凋亡，处理48h凋亡率分别为（59．29±6．01）％，（65．06±8．29）％；72h凋亡率分别为（82．15±9．28）％，（92．72±9．41）％；其诱导凋亡效果均明显强于单用As2O3，临床剂量和高剂量（5．0μmol／L）组。K562／ADM细胞P—gp表达阳性率为98．1％，mdr1mRNA的相对表达水平为1．85±0．13，临床剂量As2O3联合BSO处理48h，其抑制mdr1mRNA表达的作用效果以及处理72h对P—gP的抑制作用均明显强于单用高剂量As2O3组。结论 GSH的含量变化与As2O3的作用效果密切相关，As2O3联合BSO可有效诱导K562／ADM细胞发生凋亡，有效抑制P—gP及mdr1mRNA的表达。     

K562/NOD-SCID小鼠白血病模型的建立

本研究探讨人CML急性变的白血病细胞在NOD—SCID小鼠体内建立白血病模型的方法并研究其生长特性。首先将K562细胞接种于全身受照射后的裸鼠，待皮下成瘤后取出局部瘤块，选取无坏死的瘤组织制成瘤细胞悬液，再腹腔接种于全身受照射后的NOD—SCID小鼠。结果表明：成功建立全身播散的白血病模型。4周时外周血涂片可见白血病细胞，晚期浸润肝、脾、骨髓等造血器官，白细胞上升到接种前的8—10倍，血涂片中白血病细胞达20％-30％。腹腔局部出现瘤块，多位于腹腔内或大网膜，较少累及其他器官。结论：腹腔接种K562瘤细胞于全身照射后的NOD—SCID小鼠能建成全身播散的白血病模型，该模型较好地反映白血病在体内的演变过程，是进行新药疗效试验、生物导向治疗及基因治疗的理想工具。     

高压氧和三氧化二砷对K562细胞增殖抑制及相关机制研究

本研究旨在探讨高压氧联合三氧化二砷(As2O3)对K562细胞增殖、凋亡及低氧诱导因子-1a(HIF-1a)、血管内皮生长因子(VEGF)及caspase-3 mRNA表达的影响。用MTT法检测各组K562细胞在药物作用各时间点(24、48、72 h)的增殖率;AnnexinⅤ/PI荧光标记法检测K562细胞的凋亡率;实时荧光定量PCR检测K562细胞HIF-1a、VEGF、caspase-3 mRNA的表达。结果表明:与单用As2O3比较,As2O3联合高压氧可使K562细胞的增殖抑制率增加,凋亡作用明显加强,并可明显下调HIF-1a、VEGF的表达,上调caspase-3的表达,两者联用具有协同作用,效果明显优于单用As2O3(P<0.05)。结论:高压氧联合As2O3对K562细胞抑制增殖及加速凋亡的作用优于单独应用As2O3;二者联合后HIF-1a、VEGF mRNA的表达减弱,而Caspase-3 mRNA的表达增强。HIF-1a、VEGF、caspase-3mRNA表达的变化可能是As2O3与高压氧联合产生抗白血病细胞协同作用的分子机制之一。     

K562和K562/DNR细胞中mdr1基因启动子甲基化状态的分析

目的　分析K5 6 2和K5 6 2 /DNR细胞中mdr1基因启动子甲基化模式及其与P gp表达的关系。方法　用流式细胞术和RT PCR方法检测两个细胞系中mdr1基因的表达 ,用亚硫酸氢钠脱氨基 DNA测序的方法分析mdr1基因启动子甲基化模式。结果　K5 6 2细胞不表达P gp ,mdr1基因启动子甲基化 ;K5 6 2 /DNR细胞P gp表达阳性 ,mdr1基因启动子非甲基化。 结论　K5 6 2和K5 6 2 /DNR细胞mdr1基因启动子甲基化模式不同 ,前者有甲基化修饰 ,后者无甲基化修饰 ,mdr1基因沉默与其启动子甲基化有关