脂质体介导增强型绿色荧光蛋白基因在鼠视网膜Müller细胞中的表达

目的研究脂质体介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因对体外培养的鼠视网膜Müller细胞转染的有效性及安全性。方法采用视网膜组织块法培养鼠视网膜Müller细胞,振荡法分离纯化细胞,并对其进行免疫细胞化学鉴定。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000负载pEGFP-N1质粒转染Müller细胞,荧光显微镜检测转染后12、24、48、72h的转染效率。台盼蓝排斥实验检测转染和未转染细胞的活力,明确脂质体Lipofectamine 2000对Müller细胞的毒性作用。结果成功培养视网膜Müller细胞,传代后90%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。Lipofectamine 2000介导质粒pEGFP-N1转染Müller细胞后12、24、48、72h的转染效率分别为（9.7±1.9）%、（18.1±16）%、（17.2±2.5）%、（16.9±1.7）%。台盼蓝排斥实验显示Lipofectamine 2000转染前后活细胞率分别为（98.2±5.6）%、（96.1±6.2）%。结论脂质体Lipofectamine 2000可安全有效地介导Müller细胞的转染,为进一步明确Müller细胞的病理、生理功能及靶向Müller细胞的基因治疗提供了新的手段。     

脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜M-ller细胞的比较

目的:探讨脂质体法及电穿孔法介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养的视网膜Müller细胞的可行性和区别.方法:体外培养出生后7～10d的SD大鼠视网膜Müller细胞,免疫荧光染色法鉴定95%以上为视网膜Müller细胞.分别用阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导的脂质体转染法和电穿孔法将质粒PEGFP-N1转染视网膜Müller细胞,荧光显微镜下检测转染后1,2,3,4d的转染效率,并持续观察至转染后14d,比较两者基因表达持续时间.结果:荧光显微镜下检测转染后1d,两组均可见少量细胞表达EGFP绿色荧光蛋白.转染后2d,两者转染效率均达到最大,并且电穿孔法介导质粒PEGFP-N1转染Müller细胞效率约为31.0%±2.8%,较脂质体法转染效率(10.5%±2.4%)更高.两者比较有统计学意义(P＜0.01).随后,两者转染效率均逐渐降低.电穿孔转染后的PEGFP-N1可在视网膜Müller细胞内持续表达近14d,而脂质体转染后仅能表达约7d.结论:脂质体法和电穿孔法均适用于视网膜Müller细胞的基因转染,但电穿孔法效率更高,表达时间更长.     

脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜Mller细胞的比较

目的:探讨脂质体法及电穿孔法介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养的视网膜Mller细胞的可行性和区别。方法:体外培养出生后7～10d的SD大鼠视网膜Mller细胞,免疫荧光染色法鉴定95%以上为视网膜Mller细胞。分别用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导的脂质体转染法和电穿孔法将质粒PEGFP-N1转染视网膜Mller细胞,荧光显微镜下检测转染后1,2,3,4d的转染效率,并持续观察至转染后14d,比较两者基因表达持续时间。结果:荧光显微镜下检测转染后1d,两组均可见少量细胞表达EGFP绿色荧光蛋白。转染后2d,两者转染效率均达到最大,并且电穿孔法介导质粒PEGFP-N1转染Mller细胞效率约为31.0%±2.8%,较脂质体法转染效率(10.5%±2.4%)更高。两者比较有统计学意义(P<0.01)。随后,两者转染效率均逐渐降低。电穿孔转染后的PEGFP-N1可在视网膜Mller细胞内持续表达近14d,而脂质体转染后仅能表达约7d。结论:脂质体法和电穿孔法均适用于视网膜Mller细胞的基因转染,但电穿孔法效率更高,表达时间更长。     

脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜M-ller细胞的比较

目的:探讨脂质体法及电穿孔法介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养的视网膜M-ller细胞的可行性和区别。方法:体外培养出生后7～10d的SD大鼠视网膜M-ller细胞,免疫荧光染色法鉴定95%以上为视网膜M-ller细胞。分别用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导的脂质体转染法和电穿孔法将质粒PEGFP-N1转染视网膜M-ller细胞,荧光显微镜下检测转染后1,2,3,4d的转染效率,并持续观察至转染后14d,比较两者基因表达持续时间。结果:荧光显微镜下检测转染后1d,两组均可见少量细胞表达EGFP绿色荧光蛋白。转染后2d,两者转染效率均达到最大,并且电穿孔法介导质粒PEGFP-N1转染M-ller细胞效率约为31.0%±2.8%,较脂质体法转染效率(10.5%±2.4%)更高。两者比较有统计学意义(P<0.01)。随后,两者转染效率均逐渐降低。电穿孔转染后的PEGFP-N1可在视网膜Mller细胞内持续表达近14d,而脂质体转染后仅能表达约7d。结论:脂质体法和电穿孔法均适用于视网膜Mller细胞的基因转染,但电穿孔法效率更高,表达时间更长。     

脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜Mueller细胞的比较

目的：探讨脂质体法及电穿孔法介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因转染体外培养的视网膜Mueller细胞的可行性和区别。方法：体外培养出生后7～10d的SD大鼠视网膜Mueller细胞,免疫荧光染色法鉴定95％以上为视网膜Mueller细胞。分别用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导的脂质体转染法和电穿孔法将质粒PEGFP—N1转染视网膜Mueller细胞,荧光显微镜下检测转染后1,2,3,4d的转染效率,并持续观察至转染后14d,比较两者基因表达持续时间。结果：荧光显微镜下检测转染后id,两组均可见少量细胞表达EGFP绿色荧光蛋白。转染后2d,两者转染效率均达到最大,并且电穿孔法介导质粒PEGFP—N1转染Mueller细胞效率约为31．0％±2．8％,较脂质体法转染效率（10．5％±2．4％）更高。两者比较有统计学意义（P〈0．01）。随后,两者转染效率均逐渐降低。电穿孔转染后的PEGFP—N1可在视网膜Mueller细胞内持续表达近14d,而脂质体转染后仅能表达约7d。结论：脂质体法和电穿孔法均适用于视网膜Mueller细胞的基因转染,但电穿孔法效率更高,表达时间更长。     

羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞表皮生长因子受体表达的影响

目的研究羊膜对兔视网膜Müller细胞表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响及其机制。方法取出生15d新西兰白兔视网膜Müller细胞进行原代培养及传代,采用神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S-100进行细胞鉴定。0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA酶消化取第3代Müller细胞,实验组加0.5mL羊膜匀浆上清液继续培养12h,采用免疫组织化学法检测羊膜诱导和非诱导条件下兔视网膜Müller细胞EGFR表达的变化并进行分析。结果培养的兔视网膜Müller细胞GFAP和S-100表达阳性,透射电镜检查细胞质内可见8～10nm的中间丝。未经羊膜诱导的视网膜Müller细胞EGFR有少量表达,经羊膜诱导12h后,EGFR表达明显增多,2组灰度值分别为571588.80±67862.68和1000352.00±98386.22,差异有统计学意义（t=4.035,P〈0.01）。结论经羊膜诱导后可促进培养的兔视网膜Müller细胞EGFR的表达。     

脂质体介导转染神经干细胞行糖尿病大鼠视网膜下移植的研究

目的观察大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)阳离子脂质体法转染增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的效果;研究阳离子脂质体Lipofectamine介导转染对大鼠胚胎NSCs糖尿病大鼠视网膜下移植的影响。方法将报告基因pEGFP-N1经Lipofectamine介导转染NSCs(EGFP组),观察EGFP的表达;以同期培养未转染的细胞作为对照组,测定细胞活力、生长曲线和转染效率。将两组NSCs分别行糖尿病大鼠视网膜下移植,RT-PCR、Westernblot分别检测TOLL受体4(TLR4)、NF-κB的mRNA及蛋白质表达。结果被转染的体外培养大鼠胚胎NSCs长期表达EGFP,两组细胞具有相似的形态学变化和生长曲线,流式细胞仪结果显示转染率最高可达35.2%。行视网膜下移植后,TLR4、NF-κBmRNA及蛋白质的表达差异无统计学意义。结论阳离子脂质体Lipofectamine介导转染NSCs效率较高,报告基因表达时间长,不影响糖尿病大鼠NSCs视网膜下移植。     

缺氧对视网膜Müller细胞中谷氨酸转运体及未折叠蛋白相关因子XBP1、CHOP表达的影响

目的研究体外缺氧刺激后视网膜Müller细胞是否存在未折叠蛋白反应(unfol-dedprotein reaction,UPR),及其与L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体(glutamate-aspartatetrans-porters,GLAST)的关系。方法出生3～7d大鼠视网膜组织采用胰蛋白酶消化法培养视网膜Müller细胞,氯化钴(CoCl2)200μmol·L-1对视网膜Müller细胞进行体外缺氧干预,干预时间为0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h;UPR诱导剂二硫苏糖醇(DTT)2mmol·L-1刺激视网膜Müller细胞为阳性对照,干预时间为0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h。采用实时荧光定量PCR检测GLAST与UPR相关因子X盒结合蛋白1、C/EBP同源蛋白的表达并分析其相关性。结果视网膜Müller细胞鉴定:细胞免疫荧光染色示90%以上细胞GS、GLAST表达阳性;流式细胞仪检测结果:Müller细胞的GLAST表达阳性率为(84.66±3.51)%。缺氧刺激后,GLAST与X盒结合蛋白1、C/EBP同源蛋白在Müller细胞上均有表达,缺氧早期呈上升趋势,干预后24h表达最强,后呈下降趋势。DTT干预组表达趋势与缺氧干预组一致。结论体外缺氧刺激后视网膜Müller细胞存在UPR,其相关因子的变化与GLAST的变化趋势一致,提示UPR可能是调控GLAST变化的原因之一。     

增强型绿色荧光蛋白基因在人胚胎视网膜前体细胞中的表达

目的:研究增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转染人胚胎视网膜前体细胞的转染效率及瞬时表达情况,建立人胚胎视网膜前体细胞的示踪方法,为视网膜前体细胞移植提供示踪依据。方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,通过磷酸钙介导法转染人胚胎视网膜前体细胞．应用流式细胞仪检测其转染效率,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其瞬时表达情况。结果:pEGFP-N1在基因转染24 h细胞转染率为28．98％,48 h为32．45％,72 h为30．40％,对照未转染细胞24 h、48 h分别为2．50％和2．04％:体外观察培养细胞转染24 h已有绿荧光表达,48-72 h细胞荧光强度最强,96 h荧光强度减弱。结论:pEGFP-N1质粒能有效转染人胚胎视网膜前体细胞,其转染效率可达到30％,是人胚胎视网膜前体细胞较为理想的瞬时表达载体和细胞示踪报告分子。     

高浓度葡萄糖对体外培养大鼠Müller细胞P2Y2受体的影响

目的:观察高浓度葡萄糖对体外培养的大鼠视网膜Müler细胞P2Y2受体表达的影响。方法:用改进的酶消化法纯化培养并用胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和谷氨酰胺合成酶(GS)鉴定大鼠Müller细胞。分别在对照组(5.5mmol/L)与高糖组(10,25,50mmol/L)中孵育24h和72h,通过免疫荧光及荧光强度半定量分析检测Müller细胞中P2Y2受体表达的变化。结果:纯化培养到第3~4代的Müller细胞,经鉴定纯度大于90%,表达GFAP和GS。在24h,10,25,50mmol/L组的荧光强度分别为31.05±7.06,59.17±11.42和84.11±12.72,与对照组(26.60±5.15)相比较均明显增高(P<0.01)。而在72h,仅25和50mmol/L组的荧光强度明显强于对照组(P<0.01)。结论:高浓度葡萄糖上调大鼠视网膜Müller细胞P2Y2受体的表达,提示这一受体可能参与糖尿病视网膜病变过程。     

表皮生长因子对人眼Müller细胞增生迁移的影响及其作用机制

背景研究证实表皮生长因子（EGF）可促进鼠视网膜Müller细胞的增生和迁移,但EGF能否促进人眼Müller细胞的增生迁移尚未见报道。目的探讨人眼Müller细胞能否自身表达和分泌EGF及EGF对Müller细胞增生迁移的影响及其作用机制。方法同一代人永生株Müller细胞系MIO—M1细胞用高糖DMEM进行培养,利用MTT比色法观察不同质量浓度EGF作用24、48、72h,不同浓度CoCl2作用12h和24h,加入导致Müller细胞半数致死量的CoCl,浓度前2h加入不同质量浓度EGF的Müller细胞增生情况;Transwell小室观察正常及CoCl2缺氧条件下用不同质量浓度EGF作用24、48、72h后Müller细胞的迁移情况;采用ELISA法观察Müller细胞表达和分泌EGF的情况;通过Westernblot法检测体外不同条件培养下EGF对ERK1/2及Akt信号转导通路的作用。结果正常培养条件下,不同质量浓度的EGF作用后Mfiller细胞的吸光度（A570）值的总体比较差异有统计学意义（F=123．765,P=0．000）,100mg／LEGF促Müller细胞增生作用最强,为对照组的1．6倍,10mg／LEGF促Müller细胞迁移的作用最强,为对照组的4．5倍。各EGF组Müller细胞的A570,值均明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈O．01）。缺氧条件下培养,Müller细胞半数致死量的CoCl2浓度为600nmol／L,提前2h加入10～100阻g／LEGF后,EGF对抗缺氧所致Muller细胞的损伤作用最明显。700nmol／LCoCl2致Müller细胞损伤80％时其自身低分泌7．8ng／LEGF。10～100mg／LEGF作用Müller细胞促增生迁移作用信号最明显,600nmol／ LCoCl2作用Müller细胞24h后ERKl／2及Akt信号强度减弱,提前2h加入外源性EGF后,ERK1／2及Akt两条信号通路最明显。结论EGF能以剂量依赖的方式促进体外培养的Müller细胞增生及迁移。正常培养条件下的Müller细胞自身不表达,缺氧条件下Müller细胞自身可少量分泌EGF。EGF可能通过ERK1／2及Akt信号转导通路介导Müller细胞的增生和迁移,并对CoCl2损伤的Müller细胞发挥保护作用。     

脑源性神经营养因子对鼠视网膜Müller细胞GLAST蛋白表达及功能的调控

目的 研究脑源性神经营养因子（BDNF）对鼠视网膜Müller细胞L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体（GLAST）蛋白表达及功能的调控作用.方法 实验研究.取出生3～7 d的新生昆明小鼠视网膜组织进行Müller细胞培养,取传代后第3代Müller细胞进行后续试验.实验分为BDNF干预组和空白对照组：BDNF干预组小鼠视网膜Müller细胞分别加入50、75、100、125和150 ng/ml的BDNF培养24 h：空白对照组培养的Müller细胞不加BDNF.采用Western blot方法检测Müller细胞GLAST蛋白的表达.采用L-[3,4-H3]-谷氨酸检测100 ng/ml的BDNF干预组与空白对照组Müller细胞对谷氨酸的摄取功能的差异.对各组视网膜Müller细胞GLAST蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析,100ng/ml的BDNF干预组与空白对照组对谷氨酸摄取量的比较采用独立样本t检验.结果 Western blot检测结果显示,空白对照组GLAST蛋白的相对表达量为0.151±0.025,50、75、100、125和150 ng/ml的BDNF干预组蛋白相对表达量分别为0.331±0.076、0.413±0.110、0.497±0.080、0.411±0.072、0.319±0.084,不同浓度的BDNF均能上调GLAST蛋白的表达水平（F=6.793,P=0.003）.当BDNF浓度为100 ng/ml时,CLAST蛋白表达量最大.100 ng/ml的BDNF组与空白对照组对谷氨酸的摄取量分别为（81 213±5982）和（68 743±2688）cpm/（mg·ml）,100 ng/ml的BDNF组能够增加Müller细胞对谷氨酸的摄取,两组差异有统计学意义（t=6.462,P=0.023）.结论 BDNF能够上调GLAST蛋白的表达,并增加细胞对谷氨酸的摄取.     

FK506对高糖培养视网膜Müller细胞血管内皮生长因子表达的抑制作用

背景 视网膜M＆#252;ller细胞可通过表达血管内皮生长因子（VEGF）参与糖尿病视网膜病变（DR）的病理过程.FK506可抑制实体肿瘤及实验性角膜新生血管中VEGF的表达,但其对视网膜M＆#252;ller细胞中VEGF的表达是否有抑制作用鲜见文献报道.目的 观察FK506对高糖培养的大鼠视网膜M＆#252;ller细胞表达血管内皮生长因子（VEGF）的影响.方法 将大鼠永生化视网膜Müller细胞系进行常规培养并将对数生长期的Müller细胞分别接种到96孔培养板中,分别在培养液中加入800.00、400.00、200.00、100.00、75.00、50.00、25.00、12.50和6.25 pg/ml FK506 100 μl/孔（细胞密度为1×10^4个/ml）,MTT比色法确定Müller细胞半数抑制浓度（IC50）的最适FK506质量浓度.将大鼠视网膜Müller细胞系分为正常对照组、FK506组、高糖组和高糖＋ FK506组,分别用高糖DMEM培养液（含50 mmol/L D-葡萄糖）和正常DMEM培养基（含5.5 mmol/L D-葡萄糖）进行培养,并分别在培养基中加入FK506,至质量浓度为75 pg/ml.ELISA法检测培养细胞上清液中VEGF的质量浓度;分别采用逆转录PCR（RT-PCR）和Western blot法检测各组大鼠视网膜Müller细胞中VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量,分别以目的基因与内参β-actin吸光度（A）比值和灰度比值表示.结果 光学显微镜下正常对照组、FK506组、高糖组及高糖＋Fk506组培养12、24、48 h的大鼠视网膜Müller细胞均呈多角形,大小一致.致大鼠视网膜Müller细胞IC50的FK506质量浓度为75 pg/ml.正常对照组、FK506组、高糖组和高糖＋FK506组细胞上清中VEGF蛋白的质量浓度分别为（966.46±13.59） pg/ml、（1 059.42±67.43） pg/ml、（16 243.11±3 926.38）pg/ml和（9 467.25±1 525.56） pg/ml,总体差异有统计学意义（F=20.51,P=O.00）,其中高糖组细胞上清中VEGF的质量浓度明显高于正常对照组,差异有统计学意义（P=0.00）;高糖＋FK506组较高糖组细胞上清中VEGF的质     

体外诱导大鼠视网膜Müller细胞向神经节细胞定向分化的研究

目的 研究鼠视网膜Müller细胞经体外条件培养基诱导后去分化为神经干细胞及进一步定向分化成神经节样细胞的特性.方法 实验研究.体外培养出生后7-10 d的Sprague Dawley大鼠视网膜Müller细胞,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法及免疫荧光染色法鉴定Müller细胞纯度.取培养的第3或4代Müller细胞,用含有N2、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的Delbeccon's modified Eagle's medium(DMEM)-F12干细胞条件培养基培养3～5 d后,再用含5%胎牛血清、脑源性神经营养因子和视黄酸的DMEM培养基诱导分化7～10 d,采用免疫荧光染色法分别鉴定去分化及再诱导分化后的细胞.结果 RT-PCR及免疫荧光染色结果显示,分离培养的视网膜Müller细胞纯度可达(95.17±2.68)%以上.干细胞条件培养基培养3～5 d后,大部分Müller细胞汇集形成细胞球,经免疫荧光染色法鉴定,显示细胞球内(95.26 ±1.35)%以上的细胞Nestin表达阳性,(90.33±4.12)%以上细胞BrdU表达阳性.将这些细胞球进一步诱导分化后,可见细胞球内细胞可向外扩展、铺开,分化出形态各异的细胞,其中约(21.14±1.49)%细胞表达神经节细胞特异性标记物Thy1.1阳性.结论 成年啮齿动物视网膜Müller细胞经体外条件培养基诱导后,可以产生具有增殖能力和分化潜能的神经干细胞,并可进一步定向分化为神经节样细胞,这为干细胞研究和视神经再生治疗等提供了新的方法和手段.     

色素上皮衍生因子对高糖刺激下大鼠视网膜Müller细胞凋亡的影响

目的 探讨色素上皮衍生因子(pigmentepitheliumderivedfactor,PEDF)对高糖刺激下视网膜Müller细胞凋亡的影响,为PEDF治疗糖尿病视网膜病变提供实验依据。方法 实验分3组,分别是正常对照组、高糖模型(HG)组(培养基内含有25mmolL-1的葡萄糖)和PEDF处理高糖模型(HG+PEDF)组(在高糖培养基础上加入25mgL-1的PEDF)。反复胰蛋白酶消化法培养纯化SD大鼠视网膜Müller细胞,免疫荧光双标鉴定纯度;应用倒置相差显微镜观察Müller细胞形态,AnnexinVFITC、PI染色流式细胞技术检测Müller细胞的凋亡率,RTPCR测定Müller细胞bcl2、baxmRNA的表达变化。结果 原代培养的Müller细胞传至3代时纯度为95%以上。正常对照组、HG组、HG+PEDF组Müller细胞早期凋亡率分别为(1.223±0106)%、(2.657±0.120)%、(1.907±0.117)%,baxmRNA相对灰度值分别为0.269±0.041、0.804±0.052、0.528±0.018,bcl2mRNA相对灰度值分别为0.904±0.021、0.413±0015、0.521±0.010。HG组与正常对照组相比,Müller细胞形态发生明显改变,细胞凋亡率显著增加(P<0.001),baxmRNA表达显著升高,bcl2mRNA表达显著降低(均为P<0.01);HG+PEDF组Müller细胞凋亡率较HG组显著降低(P<0.001),baxmRNA表达显著降低,bcl2mRNA表达显著升高(均为P<0.01),但仍有别于正常对照组(均为P<005)。结论 外源给予PEDF可以显著减少高糖刺激引起的Müller细胞的凋亡,对视网膜Müller细胞具有显著的保护作用。     

氮酮促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞及毒性的实验研究

目的探讨氮酮(AZONE)促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞的作用及其对细胞活性的影响。方法采用细胞培养方法,利用绿色荧光蛋白基因做报告基因,配制不同转染液,脂质体联合pEGFP-N1、氮酮联合脂质体及pEGFP-N1、氮酮联合pEGFP-N1、单纯pEGFP-N1、单纯脂质体、单纯氮酮,分别处理兔角膜内皮细胞,荧光显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白的表达。用RT-PCR方法检测EGFPmRNA表达情况。采用MTT法研究不同转染液对细胞活性的影响。结果单纯氮酮、单纯脂质体及对照组处理的细胞不表达绿色荧光蛋白。氮酮联合脂质体及pEGFP2N1对兔角膜内皮细胞的转染效率为42.6%,脂质体联合pEGFP2N1组的转染效率为22.4%,氮酮联合PEGFP-N1组的转染效率为7.2%,单组质粒组的转染效率为1%。氮酮加脂质体加PEGFP-N1组转染效率高于其他转染组(P<0.01)。各组转染液对角膜内皮细胞活性无影响。结论氮酮可促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞,在有效的转染浓度下对细胞无明显毒性,有望成为促进角膜内皮细胞基因转染的新型试剂。     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞近视因子基因的表达

目的研究视网膜近视因子基因在原代培养的豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中的表达变化。方法3～4周龄断乳三色豚鼠40只,取20只建立近视眼模型（以右眼作为实验眼,以对侧未遮盖眼作自身对照）,剩余的20只豚鼠作正常对照。用眼罩遮盖法建立豚鼠近视眼模型,用酶消化法原代培养其视网膜Müller细胞。RT-PCR检测酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）、诱导型一氧化氮合成酶（induciblenitric oxide synthase,iNOS）、神经型一氧化氮合成酶（neu-ronal nitric oxide synthase,nNOS）、内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）、视黄醛脱氢酶（retinaldehyde dehydrogenase,RALDH）、醛脱氢酶（aldehydedehydrogenase,ALDH）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fi-broblast growth factor,bFGF）、转化生长因子β（transforminggrowth factor-β,TGF-β）的mRNA在正常对照眼、自身对照眼和近视眼视网膜Müller细胞中的表达情况。数据分析采用One-way ANOVA检验。结果眼罩遮盖10d后,遮盖眼眼轴延长,近视形成。酶消化法成功培养出视网膜Müller细胞。正常对照眼、自身对照眼和遮盖眼视网膜Müller细胞均阳性表达nNOS、bFGF、TH、TGF-βmRNA,且遮盖眼表达nNOS、bFGF和TGF-βmRNA上调（P〈0.05）,TH mRNA下调（P〈0.05）。iNOS mRNA仅在遮盖眼视网膜Müller细胞阳性表达。三组视网膜Müller细胞均不表达eNOS、RALDH和ALDHmRNA。结论豚鼠近视眼视网膜Müller细胞表达nNOS、iNOS、bFGF和TGF-βmRNA上调,TH mRNA下调。Müller细胞是近视眼视网膜信号因子一氧化氮（nitric oxide,NO）、多巴胺（dopamine,DA）、bFGF和TGF-β的一个重要来源。     

骨形成蛋白4靶向调控SMAD9表达影响Müller细胞迁移和活性氧产生

目的观察并初步探讨骨形成蛋白4(BMP4)靶向调控SMAD9表达对Müller细胞迁移、活性氧(ROS)生成以及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法体外培养的Müller细胞分为正常对照组、BMP4组、BMP4+空载质粒组(BMP4+NC组)、BMP4+SMAD9小干扰质粒组(BMP4+siSMAD9)。BMP4组、BMP4+NC组、BMP4+siSMAD9组细胞培养基加入100 ng/ml BMP4诱导细胞24 h。其后, BMP4+NC组转染空载质粒;BMP4+siSMAD9组转染SMAD9小干扰质粒48 h。细胞划痕实验测定BMP4对Müller细胞迁移的影响;流式细胞仪检测BMP4对Müller细胞内ROS生成的影响;蛋白质免疫印迹法(Western blots)、实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测Müller细胞内谷氨酰胺合成酶(GS)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)蛋白、mRNA相对表达量;免疫荧光检测Müller细胞内VEGF的表达。多组间比较采用单因素方差分析。结果细胞划痕实验检测结果显示, BMP4+ siSMAD9组细胞迁移率较BMP4组、BMP4+NC...     

Müller细胞对大鼠视网膜微血管内皮细胞增生和迁移的影响

目的:用免疫磁珠法原代培养大鼠视网膜微血管内皮细胞(RMEC),观察共培养Müller细胞对视网膜微血管内皮细胞增生和迁移的影响。方法:采用免疫磁珠的细胞分选法分离大鼠视网膜微血管内皮细胞,在条件培养基中培养生长,采用第Ⅷ因子抗体免疫组化染色方法鉴定细胞,采用流式细胞术和台盼兰染色分析传代中的微血管内皮细胞纯度以及细胞活性。传统的方法培养并鉴定Müller细胞。采用不同孔径微孔滤膜培养小室,进行大鼠视网膜微血管内皮细胞与Müller细胞分离共培养,对照组培养环境中无Müller细胞。以细胞曲线描绘反映细胞增生,并用流式细胞仪测定细胞周期。相差显微镜下计算穿过微孔滤膜迁移贴附于背面的内皮细胞数量。结果:通过磁珠分离方法获得了纯度为97.13%大鼠视网膜微血管内皮细胞,细胞活力达92%,第Ⅷ因子抗体染色呈阳性。与Müller细胞共培养的RMEC可早于正常培养2～3d进入生长平台期。RMEC中S期和G2期比例增加,G1期比例相对减少。S、G2和G1期百分比,在共培养组24h分别为44.0%,11.2%和44.8%,48h分别为42.3%,10.9%和46.8%;对照培养组24h分别为41.3%,4.9%和53.8%,48h分别为40.1%,4.7%和55.2%。迁移的细胞数增加,共培养6h移行至膜下的内皮细胞数12.2±2.5个,12h为51.7±23.4个,对照培养6h移行至膜下的内皮细胞3.3±2.5个,12h为14.7±7.0个,6h和12h两组内皮细胞数差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:免疫磁珠细胞分选方法可以获得高纯度的大鼠视网膜微血管内皮细胞,且对细胞活力无影响。Müller细胞可以促进视网膜内皮细胞的迁移,促进该细胞的增生。     

体外诱导猪Müller细胞定向分化为光感受器细胞的研究

背景 大鼠、小鼠Müller细胞在体外能诱导分化为表达视网膜光感受器细胞特异标记的细胞,但目前有关成年猪Müller细胞分化为视网膜光感受器细胞的研究鲜有报道.目的 研究成年猪Müller细胞于体外定向诱导后分化成视网膜第一级传导神经元光感受器细胞.方法 消化成年猪眼视网膜组织,分离Müller细胞行体外继代单层贴壁培养.使用定向分化培养基对P2、P3和P4代Müller单层贴壁细胞及先形成细胞球悬浮培养2—3d,然后再对贴壁细胞进行诱导分化,最后结合细胞形态和免疫荧光染色结果鉴定Müller细胞以及诱导分化效果.结果 免疫荧光染色结果显示,P2,P3和P4 Müller细胞均能表达Müller细胞特异蛋白分子标记,即谷氨酸合成酶(GS),P3 Müller细胞还同时表达另一种Müller细胞特异蛋白分子标记,神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP).免疫荧光染色分析并计算视网膜光感受器细胞特异标记视紫质Rhodopsin阳性率,P2 Müller单层贴壁分化细胞为(27.99±6.53)％,P2悬浮细胞球分化为(16.54±3.40)％.P2悬浮细胞球诱导分化后形态更趋向神经元,而P2代Müller单层贴壁细胞分化后形态仍趋向于成纤维细胞.随着培养代数的增加,细胞球定向分化Rhodopsin阳性表达程度逐渐减弱,P2、P3和P4 Rhodopsin阳性率分别为(56.23±7.32)％、(35.26±8.55)％和(12.68±3.18)％,差异无统计学意义(F=2.618,P=0.099).同代细胞随着诱导时间的延长,Rhodopsin阳性表达有所减弱,差异无统计学意义(P=0.099),但分化细胞形态更为细长.结论 成年猪Müller细胞离体培养后可定向分化为表达视网膜光感受器样细胞特异标记的细胞.细胞球悬浮培养2～3d,以及延长诱导分化时间都能使得分化细胞形态更为细长.