蛋白激酶A在TGF—β1刺激增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成中的作用

目的探讨蛋白激酶A在TGF－β     

粘着斑激酶在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达和意义

目的探讨粘着斑激酶（FAK）在增生性瘢痕成纤维细胞（HSFB）中的表达和意义。方法运用细胞免疫组化技术，测定HSFB和正常皮肤成纤维细胞（NSFB）中的FAK、整合素α1、转化生长因子受体1（TGF-βR1）及α肌动蛋白（α—SMA）的表达；同时将HSFB分别用抗FAK、整合素α1、TGF-βR1及α—SMA抗体进行阻断培养，并测定培养前后整合素α1、TGF—βR1、α—SMA及FAK的表达。结果与NSFB相比，HSFB中的FAK、整合素α1、TGF—βR1、α—SMA的表达增高，差异具有显著意义（P〈0．05）。分别用抗整合素α1、TGF-βR1、α—SMA抗体进行阻断培养后，HSFB中的FAK表达下降（P〈0．01）；阻断FAK表达也可分别导致了整合素α1、TGF-βR1、α—SMA的表达降低（P〈0．01）。结论FAK对整合素α1、TGF-βR1及α—SMA的蛋白合成具有重要的调控作用，与增生性瘢痕的发生、发展关系密切。减少FAK在成纤维细胞中的过度表达，可能是抑制瘢痕增生、软化瘢痕的新途径。     

粘着斑激酶在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达和意义

目的探讨粘着斑激酶(FAK)在增生性瘢痕成纤维细胞(HSFB)中的表达和意义。方法运用细胞免疫组化技术,测定HSFB和正常皮肤成纤维细胞(NSFB)中的FAK、整合素α1、转化生长因子受体1(TGF-βR1)及α肌动蛋白(α-SMA)的表达;同时将HSFB分别用抗FAK、整合素α1、TGF-βR1及α-SMA抗体进行阻断培养,并测定培养前后整合素α1、TGF-βR1、α-SMA及FAK的表达。结果与NSFB相比,HSFB中的FAK、整合素α1、TGF-βR1、α-SMA的表达增高,差异具有显著意义(P<0.05)。分别用抗整合素α1、TGF-βR1、α-SMA抗体进行阻断培养后,HSFB中的FAK表达下降(P<0.01);阻断FAK表达也可分别导致了整合素α1、TGF-βR1、α-SMA的表达降低(P<0.01)。结论FAK对整合素α1、TGF-βR1及α-SMA的蛋白合成具有重要的调控作用,与增生性瘢痕的发生、发展关系密切。减少FAK在成纤维细胞中的过度表达,可能是抑制瘢痕增生、软化瘢痕的新途径。     

17—β雌二醇、孕酮对增生性瘢痕成纤维细胞转化生长因子—β1合成的影响

目的 研究雌激素、孕激素对增生性瘢痕形成的影响。方法 体外培养增生性瘢痕成纤维细胞（HSFB）,利用免疫组化及计算机图像分析系统测定转化生长因子（TGF－β1）含量。结果 较对照组,17－β雌二醇（17－βE2）各组的HSFB胞浆内阳性信号明显加强（P＜0．05）;而孕酮（P）各组均不明显（P＞0．05）。结论 在体外,17－βE2可以明显促进增生性瘢痕成纤维细胞的TGF－β1合成,而P的作用不明显。     

TGF-β1及α-SMA在积水肾盂组织中的表达及其相关性研究

目的：检测转化生长因子β1(TGF-β1)和α－平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在肾积水肾盂肌层的表达，以探讨TGF－β1对积水肾脏的保护作用。方法：应用免疫组织化学方法对30例积水肾盂和5例正常肾盂标本进行染色观察。结果：积水肾盂标本TGF－β1和α-SMA的表达较正常肾盂标本均增高（P＜0．01），且二者存在显著正相关关系（γ=0.71,P＜0．05）。结论：TGF－β1通过促进肾盂肌层肥厚在肾积水的病理生理过程中发挥保护作用。     

磷酸化Smad2和Smad7在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达

Smads蛋白家族是近年来发现的转化生长因子（TGF）-β1受体下游信号蛋白，也是目前公认的介导TGF-β1胞内反应的主要通路。笔通过检测体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞（HSF）和正常皮肤成纤维细胞（NSF）中磷酸化Smad2和抑制性信号介导子Smad7的表达差异，拟探讨二在增生性瘢痕发病机制中的作用。     

β1转化生长因子对瘢痕成纤维细胞纤维粘连蛋白及其受体α5β1整合素表达的影响

目的　研究 β1转化生长因子 (TGF β1)对瘢痕成纤维细胞纤维粘连蛋白 (FN)及其受体α5β1整合素表达的影响 ,探讨TGF β1、FN及其受体α5β1整合素在增生性瘢痕形成发展中的作用。方法　采用细胞培养、ELISA法、免疫组织化学、图像分析技术 ,观察浓度分别为 0、5、10、2 5、5 0、10 0 μg/L的TGF β1作用下 ,瘢痕成纤维细胞FN及其受体α5β1整合素表达的变化。结果　TGF β1浓度在 10～ 5 0μg/L之间时 ,可明显刺激瘢痕成纤维细胞FN及其受体α5β1整合素的表达 ,与对照组相比较 ,两者差异有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ,其作用呈一定的剂量效应关系 ,随着TGF β1浓度增加 ,促合成作用也随之增加 ,浓度在 10 0 μg/L时 ,作用达到饱和。 结论　TGF β1作用下FN及其受体α5β1整合素在成纤维细胞中的过度表达可能与增生性瘢痕形成有关。     

结缔组织生长因子介导转化生长因子β1促进瘢痕成纤维细胞转分化的研究

目的 了解结缔组织生长因子(CTGF)介导TGF-β1发挥促人增生性瘢痕Fb(HSFb)转分化的作用.方法 体外培养人HSFb,取5份细胞标本分别加入不同浓度TGF-β1(0、2.5、5.0、7.5、10.0 ng/mL),作用48 h后待测.余下标本分为:空白对照组;CTGF刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人CTGF;TGF-β1刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1;CTGF反义寡脱氧核苷酸(ASODN)转染组,细胞转染CTGF ASODN后,加入培养液;CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组,细胞转染CTGF ASODN后2 h,加人含终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1的培养液.蛋白质印迹法分析不同浓度TGF-β1刺激对细胞CTGF表达的影响,比较各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化;流式细胞仪检测α-SMA阳性细胞百分率.结果 TGF-β1浓度为10.0 ng/mL时,CTGF的表达明显高于未受刺激的细胞(P<0.05).CTGF刺激组与TGF-β1刺激组α-SMA表达明显高于空白对照组(P<0.01).CTGF ASODN转染组以及CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组α-SMA表达与空白对照组接近(P>0.05).上述各组细胞α-SMA阳性细胞百分率依次为(10.8±2.8)%、(29.1±4.0)%、(28.7±4.8)%、(10.7±2.3)%、(14.3±2.9)%,统计学分析结果类似于α-SMA表达.结论 CTGF是TGF-β1发挥促人HSFb转分化的重要下游效应分子之一.     

反义寡核苷酸对TGF-β1诱导的人增生性瘢痕成纤维细胞的影响

目的 观察结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ASODN)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人增生性瘢痕成纤维细胞(HSF)的影响,探讨CTGF ASODN对人增生性瘢痕的作用.方法 将体外分离、培养的人正常皮肤成纤维细胞(NSF)和HSF分成A(NSF)、B(HSF)、C(HSF+TGF-β1)、D(HSF+TGF-β1+CTGFASODN)四组.经TGF-β1(5.0μg/L)诱导HSF后,将CTGFASODN以脂质体介导的方法转染HSF.用RT-PCR方法检测四组中CTGF mRNA的表达,用MTT比色法和流式细胞仪分别检测转染6、12、24、48、72 h的成纤维细胞的增殖和凋亡情况.结果 CTGF mRNA在NSF中的表达极其微弱;在HSF中,B组的表达量为0.31±0.14,C组的表达量为0.64±0.32,D组的表达量为0.12±0.62.A组与B、C、D组比较,其差异有统计学意义(P<0.05);而D组与B、C组比较,其差异也有统计学意义(P<0.05).结论 CTGF ASODN具有降低HSF中CTGF的表达从而延缓瘢痕纤维化的作用,可能成为治疗瘢痕增生的有效手段.     

三七总甙对人增生性瘢痕成纤维细胞转分化的作用

目的 观察三七总甙（PNS）对人增生性瘢痕成纤维细胞（HSF）向肌成纤维细胞转分化的作用，探讨PNS抗瘢痕纤维化的机制。方法 体外培养HSF，采用不同浓度的PNS进行干预，根据细胞培养所加PNS浓度分为400μg／ml组、800μg／ml组及空白对照组（不加PNS）。采用细胞三维培养法检测HSF凝胶收缩情况，计算其收缩指数；免疫细胞化学染色法检测HSF中“平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达；流式细胞仪检测HSF中α-SMA阳性细胞率。结果 400μg／ml、800μg／ml组各时相点的胶原凝胶块收缩程度明显减轻，其收缩指数均小于空白对照组（P〈0．05或P〈0．01）。HSF中α-SMA阳性表达颗粒在细胞质内呈弥漫性分布；空白对照组HSF中α-SMA的阳性表达明显强于400μg／ml、800μg／ml组。400μg／ml、800μg／ml组α-SMA的阳性细胞率（31．52％、24．28％）均明显低于空白对照组（45．74％，P〈0．05）。400l,Lg／ml、800μg／ml组α-SMA的阳性细胞染色强度积分均明显低于空白对照组（P〈0．05或P〈0．01）。结论 PNS能够抑制HSF向肌成纤维细胞的转分化，具有体外抗瘢痕纤维化的作用。     

诱导型一氧化氮合酶基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建诱导型一氧化氮合酶基因真核表达载体pcDNA3／iNOS，并以脂质体为介导观察其在肝窦内皮细胞中的转染效率及表达情况。方法 先用限制性核酸内切酶HincⅡ ClaⅠ酶切质粒PSP／iNOS和PUC6s，构建PUC6s／iNOS中间质粒，再用HindⅢ Xhol酶切质粒PUC6s／iNOS和pcDNA3，构建pcDNA3／iNOS重组质粒，鉴定正确后以Lipofec tamine为介导将其与pEGFP共转染分离培养的大鼠肝窦内皮细胞，在荧光显微镜下计算转染效率并用RT-PCR和Western blot检测iNOS基因的表达。结果成功构建了诱导型一氧化氮合酶基因真核表达载体pcDNA3／iNOS，以脂质体为介导转染肝窦内皮细胞后其转染效率为35．6％土3．4％，用RT--PCR和Westernblot检测到相应的iNOSmRNA和蛋白。结论以脂质体介导的iNOS基因能高效转染内皮细胞并表达相应的基因产物。     

THE SIGNIFICANCE OF EXPRESSION OF P16

为探讨抑癌基因     

碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的构建人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)真核表达质粒,研究其在体内外的表达.方法通过基因克隆技术,构建并大量制备pcDNA3.1/myc-His(-)-bFGF真核表达体系,RT-PCR和细胞免疫组织化学方法检测体外瞬时表达情况;直流电脉冲介导重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)-bFGF和pCD2-血管内皮细胞生长因子121(vascular endothelial growth factor,VEGF121)在兔颈部肌肉瓣内转移并表达,测定其促血管生成的生物学效应.结果构建的pcDNA3.1/myc-His(-)-bFGF真核表达体系成功转染体外培养HeLa细胞,目的基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达.pcDNA3.1/myc-His(-)-bFGF和pCD2-VEGF121重组质粒分别转染在体肌瓣,获得外源基因高水平表达.转基因肌肉发生血管增生、血流增强的生物学效应.结论构建了人bFGF真核表达质粒,并可在体内外顺利表达,为进一步组织移植或组织工程基因治疗研究奠定了基础.     

细胞周期素D1,Rb及p16在早期胃癌中的表达及意义

目的 观察细胞周期素Ｄ１、Ｒｂ及ｐ１６在早期胃癌发生中的作用及相互关系。方法 采用免疫组化ＳＰ法对３９例早期胃癌癌旁肠化组织及３４例非癌胃粘膜肠化组织进行对比研究。结果 癌组织中３３／３９例（８４．６％）显示细胞周期素Ｄ１过度表达,癌旁肠化组织也显示细胞周期素Ｄ１过度表达。１２／３９例ｐ１６表达阴性,３例中弱阳性。２６例Ｒｂ阳性的肿瘤中,１５例显示ｐ１６不表达或低表达,而９例Ｒｂ阴性的肿瘤中则ｐ１６显示表达增高。结论 细胞周期素Ｄ１是早期胃部发生过程中常见的分子异常,细胞周期素Ｄ１的激活及Ｒｂ的失活在早期胃癌中可共同存在;Ｒｂ失活与ｐ１６表达之间存在负相关关系;早期早胃癌的发生可能与细胞周期素Ｄ１、ｐ１６及Ｒｂ负反馈调节环路的异常有关。     

SOCS-1在肝癌中的表达及其与BCL-XL的关系

目的 探讨SOCS-1在肝癌中的表达及其对BCL-XL表达的影响.方法 采用免疫组织化学SP法检测36例肝细胞癌,8例肝硬化以及4例正常肝组织中SOCS-1和BCL-XL蛋白的表达水平.结果 SOCS-1在正常肝组织和肝硬化组织中呈强胞浆表达.66.7%(24/36)的肝细胞癌组织SOCS-1异常低表达与BCL-XL过表达显著相关(P=0.00011).36例肝癌中20例(55.6%)显示SOCS-1异常低表达伴BCL-XL阳性染色.10例(27.8%)显示SOCS-1正常表达伴BLC-XL阴性染色.结论 SOCS-1异常低表达与肝癌的进展和转移有关.其机制可能是通过上调BCL-XL基因的表达,促使肝细胞增殖和恶化转化而实现.     

胃癌雌激素受体表达与生物学行为及预后的关系

应用ＡＢＣ免疫组化法检测１０４例胃癌组织中雌激素受体，结果ＥＲ阳性率为３４．６％，进展期胃癌ＥＲ阳性率高于早期，分化不良型高于分化型，硬癌型高于髓样型，ＢｏｒｒｍａｎｎⅢ、Ⅳ型高于Ⅰ、Ⅱ型。提示ＥＲ可作为胃癌生物学行为为恶性程度的标志。１０４例胃癌病人经１￣８年随访结果表明，ＥＲ阳性病人根治术后１、３、５年生存率比阴性组低，但无统计学差异。     

Bax基因表达在胰腺癌组织细胞凋亡中的作用

目的:探讨胰腺癌组织中细胞凋亡与bax基因表达的相互关系及其在肿瘤发生发展中作用。方法：采用原位末端标记法（ISEL）和免疫组织化学技术检测40例胰腺癌组织及14例慢性胰腺炎组织的细胞凋亡（AI），凋亡相关基因bax蛋白的表达。结果：胰腺癌组织中的AI均值明显高于慢性胰腺炎组织（P＜0．01），随肿瘤进展AI逐渐减少。在癌组织中bax 基因阳性表达率为72．50％（29／40），且bax基因高表达组的AI均值明显高于低表达组（P＜0．01）。结论：细胞凋亡相对减少，在胰腺癌发生发展中起重要作用。bax蛋白是调节胰腺癌组织中细胞凋亡的重要因素。     

原发性肝细胞癌组织中CD40分子表达的研究

目的探讨原发性肝细胞癌组织中CD 40分子的表达情况。方法用SABC免疫组化法对60例原发性肝细胞癌组织中CD 40分子的表达情况进行回顾性研究,并用25例非肝癌组织作为对照。结果51.4%的原发性肝细胞癌组织检测到CD 40抗原;与非肝癌组织相比,具有显著性差异(P<0.05)。结论原发性肝细胞癌组织中有CD 40分子的表达,为进一步研究肝癌的肿瘤生物学及基因治疗打下基础。     

唾液酸化LewisX在大肠癌中的表达及其意义

目的 研究大肠癌组织中细胞粘附分子唾液酸化Lewis X(sialy-LeX)表达状况与肿瘤发生、分化、转移及预后的关系。方法 应用免疫组化微波－LSAB法和计算机图像分析技术，对90例大肠癌和30例远离癌组织的正常大肠粘膜进行sialyl-LeX表达和反应强度定量检测，并对其中53例患者进行随访。结果 sialyl-LeX阳性物质在远离癌组织的正常大肠粘膜中阳性率为16．7％（5／30）, 仅限于一些深部腺腔缘游离面；而大肠癌组织中sialyl-LeX阳性表达率高达92．2％（83／90），主要分布于腺管顶面细胞浆、腺腔内和癌细胞胞浆内以及粘液湖内。图像分析，sialyl-LeX阳性细胞平均积分光密度值在低分化腺癌中显著高于高、中分化腺癌和粘液腺癌（P＜0．01）；有淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者（P＜0．01）；5年内死亡患者显著高于生存患者（P＜0．01）。结论 sialyl-LeX表达阳性率和反应强度对反映大肠癌组织发生、判断恶性程度、预测转移和评估患者预后具有重要意义。     

C-met在肝细胞癌中的表达及意义

目的探讨肝细胞癌组织中C-m et的表达及其临床意义。方法选择2001年1月至2002年12月我院肝脏外科行手术治疗的肝细胞癌病例共47例,收集全部病例术后肝细胞癌组织蜡块并对病例定期随访,确定患者复发转移情况。采用免疫组织化学S-P法检测肝细胞癌组织中C-m et的表达。结果肝细胞癌组织中C-m et的表达阳性率均显著高于正常对照组(P<0.05)。在肝细胞癌病例中,C-m et在多结节组的表达阳性率显著高于单结节组(100.0%vs 60.5%,P<0.05),C-m et在1年内有复发转移组的表达阳性率显著高于1年内无复发转移组(82.1%vs 47.4%,P<0.05)。COX比例危险模型多因素分析表明:C-m et和门静脉癌栓是影响肝细胞癌术后复发转移的风险因素,绘制kap lan-m e ier生存曲线显示:C-m et高表达组的肝细胞癌术后的平均复发时间明显低于C-m et低表达组和阴性组(P<0.05)。结论肝细胞癌组织中C-m et呈高表达,C-m et的表达与肝细胞癌的早期复发转移有关,是肝细胞癌早期复发转移的风险因素。