软骨发育不全植入前遗传学诊断的方法学研究

目的：针对软骨发育不全（ACH）高危家系的 FGFR3基因的突变类型（c.1138G 〉 A, p.G380R）,建立多种快速特异、行之有效的植入前遗传学诊断（PGD）方法,为实施该 ACH 家系的 PGD创造必要的前提条件。方法在确诊该 ACH 患者特定突变类型的基础上,首先用外周血建立各种PGD方法,包括： A.直接测序法; B. ARMS法; C.酶切鉴定法;D. ARMS／RE法。然后对单个卵裂球的全基因组扩增（WGA）产物进行相应方法学的研究。最后,对各种方法进行优化优选。结果 A.直接测序法：正常对照c.1138为G 纯合子,而患者为G／A 杂合峰; B. ARMS 法：正常对照扩增阴性,而患者有445 bp 的特异扩增条带。 C.酶切鉴定法：正常对照酶切后仍为513 bp,而患者酶切后产生205 bp、308 bp、513 bp三条带; D. ARMS／RE法：正常对照扩增阴性,无法做酶切鉴定。而患者有445 bp扩增产物,经SfcI酶切后可产生27 bp和418 bp两个片段。结论本研究已成功建立针对c.1138 G 〉 A 杂合错义突变的直接测序法、ARMS 法、酶切鉴定法和ARMS／RE 法。所建立的4种方法快速、特异,但各有利弊,同时使用可相互弥补,结合STR 连锁分析可把误诊风险降到最低程度。在正常情况下,可在24 h 内完成对ACH高危胚胎的PGD。     

双错配碱基ARMS结合RE法快速检测FGFR3基因的突变超热点

目的建立快速简便、特异灵敏的鉴定FGFR3基因c．1138G〉A突变超热点的基因诊断方法,为软骨发育不全（ACH）的产前基因诊断或植入前遗传学诊断（PGD）创造条件。方法针对突变率高达95％以上的FGFR3基因的突变热点c．1138G〉A,设计双错配碱基的ARMS特异引物,对已经临床确诊的先证者家系及正常对照和非c．1138G〉A突变的患者对照,分别用普通引物和特异引物进行PCR扩增和直接鉴定,然后对扩增产物进行DNA序列分析及sfcI酶切鉴定。结果用普通引物扩增,对照组和先证者均扩增阳性。sfcI酶切后,对照组仍为一条513bp的带,而患者切出205bp、308bp和513bp三条带;而用ARMS特异引物扩增,则先证者扩增阳性,而对照组扩增阴性,阳性者酶切后产生27bp和418bp两条带。这一切都与预期的结果完全吻合。结论该法快速、特异、准确性高,结合DNA序列分析和酶切鉴定（RE）,可用于ACH高危胎儿的快速产前诊断。     

致死性侏儒症Ⅰ型高发突变发生机制浅析

致死性侏儒症(thanatophoric dysplasia,TD)是重型短肢畸形病中相对常见的致死性遗传性骨病,分为TD-Ⅰ和TD-Ⅱ 2型,它们都是由于FGFR3基因发生致死突变所致.TD-Ⅰ型存在多种致病性突变,其中以c.742C＞T/p.R248C突变最为常见.本病为常染色体显性遗传(autosomal dominant,AD),杂合突变即可致死,但为何表型、基因型正常的父母会生出带有p.R248C突变的患胎并且是纯合突变的死胎？如果是新生突变,又为何会接连数胎生出同样的患胎？p.R248C高发突变的机制是什么？本文重点围绕这些问题,从“FGFR3 (Fibroblast growth factor receptor 3)基因和FGFR3受体(Fibroblast growth factorreceptor 3)的结构和功能,TD-Ⅰ型p.R248C高发突变的发生机制,正常父母生出纯合致死突变的可能机制”几方面进行剖析,指出:①FGFR3基因及其受体蛋白结构和功能的特殊性是高发突变发生的物质基础;②位于IgⅡ和IgⅢ结构域连接区的氨基酸是极性很强的亲水氨基酸,很容易与带电离子结合而影响α螺旋结构,故易受外来理化因素的攻击、诱变而发生改变;③正常父母生出纯合致死突变,推测有两种可能:一种是夫妇一方的生殖腺已带有该高发突变,当胎儿从亲代遗传了一次突变后,只需在另一位点上再发生一次新生突变即可产生;另一种是夫妇双方的生殖腺都是该突变的嵌合体,当两者结合在一起,就有可能产生纯合突变.此外,还对未来发展趋势进行了展望.本文旨在探讨c.742C＞T/p.R248C高发突变和纯合突变发生的机制,进而为其今后的诊断和防治工作提供理论依据.     

四引物扩增受阻突变体系快速检测Wilson病基因Arg778 Leu突变

目的 建立一种不需要限制性片段长度多态性或直接测序的新方法检测肝豆状核变性（WD）病人突变热点ATP7B基因的Arg778Leu突变基因型。方法 用四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应（tetra-primer amplification refractory mutation system-PCR,tetra-primer ARMS—PCR）检测47例WD患者和30例正常对照的ATP7B基因Arg778Leu突变,并用测序进行验证。结果 47例WD患者中检出Arg778Leu纯合突变4例,杂合突变14例,总检出率38．3％（18／47）;30例正常对照未发现突变;DNA测序结果与四引物ARMS—PCR结果完全一致。结论 ATP7B基因Arg778Leu突变是中国人WD突变热点;四引物ARMS—PCR法检测Arg778Leu突变有快速、简便、准确的优点,可以区分等位基因是否纯合,适于大样本的人群筛查。此法也可用于检测其他点突变。     

突变特异性扩增系统和变性高效液相色谱分析法结合DNA测序法快速产前诊断黏多糖贮积症Ⅱ型高危胎儿

目的为了快速、准确地对黏多糖贮积症Ⅱ型(MPSⅡ)高危胎儿做出产前基因诊断,从而及时而高效地防止病胎的出生。方法在阐明先证者病因及其父母基因型的基础上,采用已建立的突变特异性扩增系统(ARMS)特异引物直接鉴定法、变性高效液相色谱(DHPLC)快速筛检法,结合DNA序列分析法,对已孕20周的高危胎儿的艾杜糖-2-硫酸酯酶(IDS)基因相应突变位点进行快速检测和鉴定。由于MPSⅡ为XR病,故又用SRY引物对胎儿进行性别鉴定,以避免可能出现的母血污染而导致的误诊。结果所怀胎儿未获得母源性的c.1344delA突变,是1例基因型完全正常的女胎。后经随访和复检,证实所生小孩的基因型、表现型都与产前诊断结果完全一致。结论 ARMS特异引物直接鉴定法、DHPLC快速筛检法结合DNA序列分析法是快速、准确产前诊断MPSⅡ高危胎儿的有效方法。其中,所建立的ARMS和DHPLC方法,既快速特异,又简便经济,可在一天之内送报结果 ,特别适用于已明确病因的高危胎儿的早期诊断以及正常组和患者试验组的快速鉴别。这一产前基因诊断工作的成功实施为今后继续开展本病以及其他相关遗传病的遗传咨询、基因诊断和产前诊断积累了宝贵的经验,也为今后开展...     

Bcl-x微基因及其突变微基因的构建与鉴定

背景:Bcl-xL/Bcl-xS比值的增高与肿瘤的发生密切相关,其机制尚未阐明.Bcl-x微基因是研究其选择性剪接机制的重要工具.目的:构建人类凋亡相关基因Bcl-x的微基因及其突变微基因,为进行Bcl-x基因选择性剪接方面的研究打下基础.方法:首先采用PCR法从人白血病细胞K562基因组DNA中扩增出Bcl-x基因外显子2及内含子2的5'部分序列片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(-)中,然后扩增出Bcl-x基因内含子2的3'端及外显子3部分序列,定向插入上一片段下游,构建成pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因,测序鉴定无误后,用pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因瞬时转染HL-60,通过RT-PCR方法对其在细胞内表达作进一步鉴定.另外,以pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因为模板,利用反向PCR法构建突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE1(M).结果与结论:以人白血病细胞K562基因组DNA为模板,P1和P2为引物,经PCR扩增得约686 bp的目的片段;以P3和P4为引物扩增出约178 bp的目的片段.微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x分别经Xba Ⅰ和Eco R Ⅰ双切、Xba Ⅰ和Xho Ⅰ双切鉴定均得到预期的片段,突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE1(M)经EcoR Ⅰ单酶切后,均得到预期片段,测序结果正确,表明成功构建人类凋亡相关基因Bcl-x的微基因及其突变微基因.     

突变受阻性扩增系统快速检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的初步研究

利福平 (RFP)是结核化疗方案中的一个关键药物 ,它的应用可明显缩短结核病的疗程。因此 ,创建快速、简便的检测方法一直是基础研究中的一个重要课题。突变受阻性扩增系统 (amplificationrefractorymutationsystem ,ARMS) [1] 是一种可以检测任何已知点突变或小基因片段缺失的扩增技术 ,简便、可靠、无放射性核污染。我们选择与结核分枝杆菌 (结核菌 )RFP耐药相关的rpoB基因中突变频率最高的 3种突变形式 :5 31TCG→TTG ,5 2 6CAC→TAC ,5 16GAC→GTC来设计ARMS特异性突变引物 ,ARMS 聚合酶链反应 (PCR)扩增后结合微孔板探针…     

一种新的IDUA基因复合杂合突变致姐弟同患Ⅰ型黏多糖贮积症

摘要：目的：分析一家系中2例黏多糖贮积症Ⅰ型（MPSⅠ）患儿α-L-艾杜糖醛酸酶（IDUA）基因突变。 方法：用PCR结合直接测序技术分析患儿IDUA基因14个外显子及侧翼序列的突变,对107例健康人行限制性酶切分析以排除新发现的突变为多态变异。 结果：2例患儿均携带IDUA基因复合杂合突变p.M1T/p.T179R,其父母分别为p.M1T突变和p.T179R突变的携带者。107例健康人未见p.T179R突变。 结论：p.M1T/p.T179R突变可能是该家系2例患儿的致病原因。     

五例遗传性凝血因子V缺陷症的基因分析

目的 分别对5例遗传性凝血因子V(FV)缺陷患者进行基因分析和家系调查,鉴定导致FV缺陷症的基因突变.方法 采用一期法检测血浆FV活性,ELISA法检测血浆FV的抗原含量,PCR法扩增FV基因的25个外显子及其侧翼序列,DNA测序并与基因文库比对以确定基因异常,限制性内切酶酶切分析或直接测序患者直系家属及正常人相应的等位基因排除多态性影响.结果 5例患者血浆FV活性和抗原含量均明显降低,基因分析共发现6个致病突变,分别为G69969T(G2079V)、C45533T(R712Ter)、C46796T(R1133Ter)、G45366A(C656Y)、C46253T(R952C)及G16088C(D68H),后3个是新的突变位点,其中C46253T(R952C)是国际上首次发现的位于B区的错义突变.通过对直系亲属和正常人相应的等位基因进行扩增测序或酶切分析证实了3个新的突变不是基因多态性所致.结论 鉴定了5例Ⅰ型遗传性FV缺陷症的基因突变,其中包括2种无义突变和4种错义突变;错义突变导致FV蛋白稳定性降低,引起血浆中FV的含量减少.     

采用PCR与RFLP方法快速诊断细菌感染

目的:探讨PCR与RFLP方法快速诊断细菌感染的临床应用价值.方法:选取14种下呼吸道常见病原茵制成DNA模板,用16S rRNA基因保守区建立一对通用引物对其进行PCR扩增,再分别用限制性内切酶Hae Ⅲ,Mnl Ⅰ,Alu Ⅰ,Dde Ⅰ和BstBⅠ酶切,根据RFLP分析鉴定细菌.结果:所有待测细菌经通用引物PCR扩增和HaeⅢ酶切后的电泳图谱呈现多态性,但有部分细茵图谱相同或相似,再分别用MnlⅠ、AluⅠ、DdeⅠ和BstBⅠ酶切,其产生的酶切图谱各异,可以相互区分,从而鉴定出痛原菌.结论:PCR与RFLP分析方法检测病原茵快速简便,是一种具有临床应用价值的快速诊断方法.     

环介导等温扩增技术快速检测副溶血性弧菌

目的建立一种检测副溶血性弧菌（Vp）快速且特异的环介导等温扩增（LAMP）检测方法。方法针对副溶血性弧菌不耐热溶血素（tlh）基因特异性序列的6个位点设计4条LAMP引物,65℃保温约60min,完成对副溶血性弧菌的扩增,扩增产物经肉眼、SYBR Green Ⅰ染色、电泳和酶切鉴定。利用LAMP和普通PCR方法同时检测1株副溶血性弧菌和12株非副溶血性弧菌来验证LAMP方法的特异性;将副溶血性弧菌菌液作一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法进行检测,比较两者敏感性。结果1株副溶血性弧菌出现LAMP扩增反应：通过肉眼、SYBR Green Ⅰ染色和电泳均能观察到LAMP扩增产物的出现,酶切证实了LAMP产物的特异性;12株非副溶血性弧菌未出现LAMP扩增。LAMP检测tlh基因的特异性和敏感性与普通PCR相同,LAMP检测tlh基因的检测下限为15cfu／mL。结论建立了一种快速、敏感、特异的副溶血性弧菌检测方法,适合日常监测及快速检测的需要。     

端粒酶逆转录酶启动子热点突变的ARMS-LNA-qPCR检测方法建立

目的建立一种定量检测端粒酶逆转录酶(TERT)启动子区-124bp(C/T)和-146bp(C/T)位点突变率的实时荧光定量PCR方法。方法以常规PCR扩增含有TERT热点突变位点的纯化产物作为检测标本,采用等位基因扩增阻滞原理(ARMS)的引物,并结合锁核酸(LNA)探针作为野生等位基因抑制子,建立实时荧光定量PCR的TERT启动子热点突变率检测方法(ARMS-LNA-qPCR)。在30例表观健康人确定检测下限。结果所建方法的突变率标准曲线为:-124bp(C/T)突变率%=10(0.262×ΔCt+4.325)(P<0.001,R2=0.999),-146bp(C/T)突变率%=10(0.261×△Ct+3.895)(P<0.001,R2=0.999)。在表观健康人中所确定的-124bp和-146bp检测下限分别是0.07%和0.05%。结论所建ARMS-LNA-qPCR的TERT热点突变检测方法具有定量检测突变率并适合临床常规开展的优势。采用普通PCR纯化产物作为检测标本,使得所建方法具有检测各种类型标本的普适性。     

转基因食品PCR定性检测技术的研究

目的 建立简便、快速、灵敏、特异的植物源性转基因食品DNA检测技术.方法 针对转基因植物技术中载体上常用花椰菜花叶病毒的35S启动子和根农杆菌的NOS终止子特异基因序列,设计合成特异的引物对35S、NOS,利用基因PCR扩增技术检测转基因食品.结果 引物对35S、NOS分别成功从转基因大豆中扩增出195bp和180bp特异的DNA带.结论 基于35S启动子和NOS终止子基因序列的PCR扩增技术是一种简便、快速、灵敏、特异的转基因食品DNA检测技术.     

TaqMan-ARMS法快速检测人MTHFR基因多态性

目的利用PCR引物的错配扩增和荧光定量PCR技术,建立一种针对人亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因多态性的快速荧光扩增检测方法。方法收集已经测序验证的MTHFR基因C677T,A1 298C位点的野生型、杂合型和突变型样本,并据此构建野生型和突变型质粒;根据野生型MTHFR基因序列设计ARMS(扩增阻碍突变系统)引物和Taq Man探针并筛选出最合适的突变检测体系,与已知突变信息的214例样本进行比较,以验证该检测体系的可行性。结果建立的Taq Man-ARMS法性能评估优异,样本的最低检测限为10 copies/μL,样本间交叉检测无核酸扩增,体系检测阴性对照无核酸扩增;重复性及实验室内精密度结果良好,MTHFR-667位点和1 298位点重复性检测的标准差介于0.11~0.44,纯合和杂合样本的变异系数(CV)均4.52%。214例临床样本用该法检测结果与测序法的一致性为100%。结论基于Taq Man-ARMS法检测MTHFR的基因多态性方法简单,快捷,精确,适合用于临床样本快速诊断。     

葡萄糖6磷酸脱氢酶缺陷的研究现状

红细胞葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷,是常见的红细胞酶病.常因某些诱因发生溶血,而引起G6PD缺陷的主要原因是G6PD基因突变[1],以往检测已知突变主要用错配PCR/酶切法、寡核苷酸探针杂交法(ASD).最近,杜传书等[2]报道用突变特异性扩增系统(ARMS)来检测中国人G6PD基因3种常见的突变,大大加快了寻找新突变的速度.     

等位基因特异-荧光定量PCR检测胱硫醚-β-合成酶基因T833C/G919A点突变及其与糖尿病肾病的关联性初步观察

目的建立胱硫醚-β-合成酶（CBS）基因T833C、G919A点突变的等位基因特异-荧光定量PCR（TaqMan—ARMS）测定方法，探讨2型糖尿病肾病患者CBS基因T833C、Gg19A点突变率及与糖尿病肾病（DN）的相互关系。方法采用PCR时引物3’端错配扩增阻滞（ARMS）原理，结合荧光定量PCR技术（TaqMan探针），制备野生和突变质粒标准品，建立野生引物和突变引物2个反应体系，根据荧光定量PCR时野生引物循环阈值（Wct）与突变引物循环阈值（Mct）的比值△ct（△ct=Wct／Mct）及扩增有无指数增长期出现，建立点突变等位基因型的判定标准，并对94例DN患者（组1）和140例尿微量白蛋白正常的非糖尿病对照者（组2）的CBS基因T833C、Gg19A点突变进行检测。结果建立的TaqMan-ARMS方法检测T833C野生等位基因型的判定标准为Act〈0．72或Met〉40，杂合突变型为0．9〈Act〈1．10，纯合突变型为1．40〈Act或Wet〉40；G919A野生等位基因型判定标准为Act〈0．74或Mct〉40，杂合突变型为0．92〈Act〈1．03，纯合突变型为1．26〈Act或Wet〉40。T833C点突变TY、TC、CC3种基因型在DN组分布频率分别为98．94％、1．06％和0，组2中分别是99．29％、0．71％和0；两组人群833C等位基因频率分别为0．53％和0．36％，基因型和等位基因频率差异均无统计学意义。各组中未发现G919A等位基因杂合突变和纯合突变型。结论成功建立了测定CBS基因T833C、G919A点突变的TaqMan—ARMS方法，该方法准确、特异，适合高通量点突变的检测。本研究未观察到CBS基因T833C、G919A点突变为DN的遗传危险因素。     

用PCR-RFLP检测血红蛋白E基因CD26突变

目的建立PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)法检测血红蛋白E(HbE)基因CD26突变。方法对HbE复合β地中海贫血(β地贫)家系的患者基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物经限制性内切酶MnlⅠ消化,通过分析酶切产物PAGE图谱确定是否携带CD26突变。结果筛选出2个家系中4例CD26突变携带者。结论CD26突变在四川人群中有一定的频率,PCR-RFLP方法能快速、准确、特异地检测CD26突变。     

HBV核心蛋白与A3C融合蛋白HBV载体质粒的构建

目的:构建HBV核心蛋白与人类载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3C(A3C)融合蛋白HBV载体质粒.方法:构建表达HBV核心蛋白的乙肝病毒载体质粒PdssX;以质粒PC-A3C为模板扩增A3C,将扩增的A3C及PdssX分别用Aor13H Ⅰ和BSEⅡ酶切双酶切,以T4连接酶连接转化TOP10感受态细胞,然后PCR和双酶切鉴定及测序鉴定.结果:酶切所获载体片段和目的基因片段的大小均与预期的相一致,经测序证实为pCH-CoreA3c基因,表明CoreA3c基因HBV载体质粒pCH-CoreA3c构建成功.结论:成功构建HBV核心蛋白与A3C融合蛋白HBV载体质粒pCH-CoreA3c,为下一步CoreA3c融合蛋白的原核表达及其抗病毒作用研究奠定了基础.     

人降钙素原的原核表达、纯化和鉴定

目的构建人降钙素原(procalcitonin,PCT)原核表达载体,获得高纯度PCT重组蛋白。方法根据NCBI上PCT基因序列设计引物,利用PCR技术扩增PCT基因,构建PCT/p ET-22b(+)重组表达载体,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21中诱导表达;采用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,用western blot和胶体金法对其进行鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增产物约为350 bp。同源性比对分析结果表明,PCT基因片段(348 bp)成功插入p TG19-T载体,未出现碱基突变。用Bam HⅠ和HindⅢ对重组表达载体双酶切,得到约为350 bp和5 500 bp片段。SDS-PAGE电泳显示PCT重组蛋白以可溶性形式存在,Mr约14 000,经镍柱亲和层析法纯化后即可获得。western blot和PCT胶体金法结果呈阳性,显示融合蛋白含组氨酸标签(His-tag),成功表达出PCT重组蛋白。结论应用重组DNA技术成功构建PCT基因融合重组表达载体,通过蛋白质表达纯化技术获得PCT融合蛋白。     

东南亚缺失型α地中海贫血的聚合酶链反应快速诊断技术及产前诊断

目的　针对东南亚缺失型α地中海贫血 (- - SEA)建立一种快速、简便的聚合酶链反应(PCR)基因诊断技术 ,并初步应用于高危胎儿的产前诊断。方法　采用跨越断裂点的PCR设计方案 ,其中一对引物用于扩增 - - SEA缺失基因 ,另一对引物设计在 - - SEA、-α3 .7、-α4 .2 的公共缺失区域 ,用于扩增正常的α珠蛋白基因 ,两对引物在单管中反应。用该方法对 8例高风险Bart’s水肿胎进行产前诊断。结果　 - - SEA缺失基因的扩增产物为 740bp ,正常等位基因的扩增产物为 10 5 2bp。进行产前诊断的 8例高风险Bart’s水肿胎 ,检出正常胎儿 3例 ,- - SEA杂合子 3例 ,HbBart’s水肿胎儿 2例。结论　该法快速、准确 ,可作为常规方法用于临床样品的分子筛查及Bart’s水肿胎和缺失型HbH病的产前诊断。