HBV基因分型和耐药突变基因检测

目的探讨东营地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布,乙型肝炎患者耐药情况,HBV基因型别与耐药以及突变位点关系。方法收集乙型肝炎患者血清300例,采用离心柱法提取HBV-DNA,聚合酶链反应(PCR)-反向点杂交法检测HBV分型和耐药突变。结果 300例HBV-DNA阳性患者中,检出B型、C型、B/C型及其他未检测出的基因型,未检出D型分型,检出结果中以C型为主,占81.8%;HBV患者耐药药物以拉米夫定和替比夫定的联合耐药为主,占43.6%;HBV耐药突变基因型主要为rt204I(24.35%)、rt204V(17.39%)及rt180M(17.39%);B型和C型的耐药突变率分别为30.77%和42.42%,差异有统计学意义(P0.05)。结论东营地区HBV基因C型多于B型,C型容易产生耐药,以rt204I,rt204V及rt180M基因突变型多见,拉米夫定和替比夫定的联合耐药多见,应根据基因分型和耐药突变结果对乙型肝炎患者选择适合的治疗方案。     

某地区乙型肝炎病毒基因型分布和P区耐药突变模式分析

目的探讨十堰地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布和P区耐药突变模式及两者的相关性。方法将在该院进行治疗的224例慢性乙型肝炎患者纳入本研究,提取患者血液标本中的HBV DNA,利用ABI 3730型遗传分析仪对DNA进行测序,通过SeqMan软件实施序列比对,分析HBV DNA的基因型和P区耐药突变的情况。结果检出HBV基因型为B型者136例,占60.71%;为C型者62例,占27.68%。二者比例均高于D型、B+C型及未分型者,差异有统计学意义(P0.05)。78例明确出现耐药突变,其中B基因型对于拉米夫定以及阿德福韦的耐药率分别为18.38%与9.56%,与C基因型对于二者的耐药率16.13%与9.68%相比,差异均无统计学意义(P0.05)。B基因型患者M204V、M204I耐药突变的发生率分别为38.60%、17.54%,C基因型患者则分别为28.57%与38.10%,两种基因型患者比较差异无统计学意义(P0.05)。B、C型基因突变患者间YMDD突变(M204V、M204I)及非YMDD突变所占比例比较,差异均无统计学意义(P0.05)。B基因型及C基因型分别与M204V及M204I两种突变均呈正相关。结论十堰地区HBV的基因型主要是B型及C型,发生的HBV耐药突变则以M204I和M204V为主,在临床治疗时应按照基因分型以及耐药突变情况合理选择药物进行慢性乙型肝炎的治疗。     

南通地区乙型肝炎病毒P区耐药突变与基因型及其临床意义

目的 探讨南通地区乙型肝炎病毒P区耐药基因突变特征与基因型,为临床合理用药提供科学依据。方法 选择158例经核苷(酸)类似物治疗至少2年以上慢性乙型肝炎(CHB)患者和30例未接受过核苷(酸)类似物治疗的CHB患者作为研究对象,采用PCR产物直接测序法检测HBV P区耐药基因和基因型,同时观察三种主要突变模式与ALT和HBV DNA水平的关系。结果 158例CHB患者检出B基因型42例(26.58%),C基因型116例(73.42%)。131例发生P区不同位点突变,突变率为82.91%。共检出11个HBV突变位点,主要突变位点是M204I,L180M,M204V,A181V和A181T,耐药频率依次为41.14%,37.34%,22.15%,11.39%和10.13%,11个突变位点有21种突变模式。拉米夫定(LAM)耐药相关突变中以L180M和M204V合并出现为主,其次以M204I单独出现; 阿德福韦酯(ADV)耐药相关突变中以A181V为主; 恩替卡韦(ETV)耐药率较低。结论 南通地区HBV基因型以B和C型为主,C型为优势基因型; 耐药突变主要集中在拉米夫定和阿德福韦酯耐药相关的突变位点,而恩替卡韦耐药率较低。多位点耐药突变检测有助于及时发现病毒耐药,更好地指导临床治疗。     

深圳地区慢性乙型肝炎病毒感染者天然耐药现状及其与基因型的关系

目的 了解深圳地区慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者的天然耐药现状,并对其基因分型和天然耐药基因进行分析。方法 收集2017年3月～2018年2月来深圳市龙华区人民医院就诊并确诊为HBV感染且未使用核苷(酸)类似物抗病毒治疗的患者503例。采用PCR-反向点杂交基因芯片法对患者标本的HBV基因型及其与HBV耐药相关基因突变进行分析。结果 503例HBV感染者中检出64例对拉米夫定(LMV)和/或阿德福韦酯(ADV)天然耐药,耐药率为12.72%,其中对LMV天然耐药率为73.44%,明显高于对ADV天然耐药率的23.44%和对LMV和ADV同时耐药的3.13%,差异有统计学意义(P0.01～0.05)。503例HBV感染者B基因型检出率68.59%,明显高于C基因型的23.06%、D基因型的2.59%及B+C混合基因型的5.77%,差异有统计学意义(P0.05～0.01)。对LMV和ADV天然耐药基因突变中,耐药基因型均以B型为主,其中对LMV天然耐药基因突变类型以rtM204V为主,突变率为36.17%,明显高于其他突变类型,差异有统计学意义(P0.01～0.05),对ADV天然耐药基因突变类型以rt236T为主,突变率为46.67%,明显高于其他突变类型,差异有统计学意义(P0.01～0.05),而2例对LMV和ADV同时耐药基因型以B型为主,基因突变类型均为rtM204V+rtN236T。结论 深圳地区慢性HBV感染者对LMV和/或ADV有一定的天然耐药率,基因突变主要见于B基因型,基因突变类型以rtM204V和rtN236T为主。因此,HBV感染者治疗前进行天然耐药、基因分型及突变类型检测,对提高HBV治疗效果和降低耐药率具有重要的临床意义。     

武汉市乙型肝炎病毒基因型分布和P区耐药突变模式及两者相关性分析

目的探讨武汉地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布情况和P区耐药突变模式及两者的相关性。方法提取HBV-DNA进行聚合酶链反应(PCR)扩增后以直接测序法检测HBV基因型及P区耐药突变位点,用SPSS19.0软件进行统计学分析。结果 219例慢性乙型肝炎患者血浆中检出HBV基因型B型135例(61.6%)、C型61例(27.9%)、D型2例(0.9%)、B+C混合型3例(1.4%)、B+F+G混合型1例(0.4%)、未分型17例(7.8%)。对202例分出基因型的标本进行耐药突变检测,其中76例发生耐药突变,突变位点以M204I(42.9%)、M204V(22.1%)、L180M(27.3%)多见。YMDD突变的发生率在B、C基因型之间比较差异无统计学意义(P0.05),但YMDD突变类型中的M204V和M204I在B、C基因型中的分布比较差异有统计学意义(P0.05)。结论武汉地区HBV基因型以B型和C型为主,HBV耐药突变以M204I、M204V、L180M多见,临床医生应根据基因分型和耐药突变结果为慢性乙型肝炎患者选择适合的治疗方案。     

乙型肝炎基因分型同耐药位点突变的关系研究

目的：探讨耐药位点突变与乙型肝炎病毒(HBV)基因分型及其他临床信息的相关性。方法以358例慢性乙型肝炎(CHB)患者为研究对象,采用聚合酶链反应(PCR)-反向点杂交法检测耐药位点及基因分型。收集患者血清 HBV DNA 载量、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平,以及乙型肝炎病毒 e 抗原(HBeAg)、性别、年龄、核苷(酸)类似物用药时间等临床资料。结果所有标本均成功扩增阳性条带。HBV 基因型以 B 型(267例)为主,其次为 C 型(81例)、D 型(10例)。使用核苷(酸)类似物的311患者中完全野生型269例,未用药的47例患者均未见耐药突变。耐药位点突变以204及180/204位点突变为主。耐药突变与患者性别、年龄、血清 HBV DNA 载量、病毒基因型、ALT 水平及 HBeAg 无明显相关性(P >0.05);用药时间越长,耐药突变率越大(P <0.05);180位点突变与204位点突变有一定相关性(P <0.05)。结论PCR-反向点杂交技术可有效检测 HBV 基因型及突变位点,可有效指导临床用药。     

乙型肝炎病毒基因分型与耐药突变基因位点的检测分析

目的分析乙型肝炎病毒(HBV)基因型及耐药突变基因位点,为指导临床抗病毒治疗合理用药提供依据。方法回顾分析2014年3月～2016年10月安徽中医药大学第一附属医院114例乙型肝炎患者HBV基因分型和拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、阿德福韦酯(ADV)和恩替卡韦(ETV)四种核苷类药物(NAs)耐药及耐药突变位点分布情况、HBV核酸(HBVDNA)定量、HBVE抗原(HBeAg)定量、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的浓度、血小板(PLT)的含量。结果 114例乙型肝炎患者中检测出HBV基因C型61例,B型45例,D型3例,B+C混合型1例,B+D混合型1例,其他基因型5例。其中C型多于B型(P 0.05)。检出39例NAs耐药,耐药率为34.21%;C型与B型耐药无显著差异。C型患者HBeAg定量高于B型患者(P 0.05),PLT计数低于B型患者(P 0.05)。耐药突变位点最多见于rt204I;C型多位点突变高于B型(P 0.05)。LAM和LdT联合耐药最多见,两种及两种以上多重耐药高于单一耐药(P 0.01)。结论本研究中乙型肝炎患者HBV基因型多为C型,其次为B型。C型患者容易发生肝纤维化,更易发生多位点突变。NAs耐药以LAM和LdT联合耐药为主,多为两种以上联合耐药。检测HBV基因型和耐药突变基因位点对评价乙型肝炎临床治疗效果和指导临床抗病毒治疗合理用药具有十分重要的意义。     

新疆汉族与维吾尔族HBV耐药变异类型与基因型研究

目的探讨新疆地区慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)耐药变异类型与基因型的关系。方法应用聚合酶链反应(PCR)对245例HBV DNA阳性标本进行HBV基因分型。采用基因芯片技术对HBV拉米夫定及阿德福韦酯相关耐药基因突变位点(包括180、204、181、236位点)进行检测。结果 245例慢性乙型肝炎患者检出HBV基因型B型40例、C型137例、C/D混合型48例、其它型别20例,在不同性别及年龄间的分布差异无统计学意义(χ2=1.791,P=0.617;χ2=14.214,P=0.115),而在不同民族间的分布差异有统计学意义(χ2=83.076,P=0.000)。HBV在180、204、181、236位点的突变检出率分别为33.8%、76.8%、66.9%、45.0%,差异有统计学意义(P0.05);HBV常见变异类型的基因型构成差异无统计学意义(χ2=14.969,P=0.454),但C型HBV在各变异类型中所占的比例均最高。结论 HBV基因型在不同民族间的分布不同;HBV常见耐药位点的突变情况不同;HBV基因型在常见变异类型中的分布相同。     

核苷(酸)类似物治疗慢性乙型肝炎患者HBV逆转录酶区变异的研究

目的分析核苷(酸)类似物治疗的慢性乙型肝炎患者HBV逆转录酶区耐药相关变异位点、变异位点组合模式、HBV DNA水平和HBeAg等特征,为临床应用核苷(酸)类似物抗乙肝病毒治疗提供参考。方法纳入研究的141例慢性乙型肝炎患者,使用NAs治疗的107例为治疗组,未使用药物抗病毒治疗的34例为对照组。采用线性探针反向杂交法(PCRRLP)检测HBV逆转录酶区耐药相关变异位点,实时荧光定量PCR法检测乙型肝炎病毒DNA水平,酶联免疫吸附试验检测乙肝免疫标记物,并对耐药相关变异的特点和研究病例的临床资料进行统计学分析。结果核苷(酸)类似物治疗效果不佳组耐药相关变异检出率(82.5%)明显高于未治疗的对照组(5.9%)和抗病毒治疗有效组(有效组10例未检出耐药相关变异)(P0.01)。97例核苷(酸)类似物抗病毒效果不佳的病例中80例检出140个耐药相关变异位点,包括rtM204I 45个、rtM204V 32个、rtA181V 28个、rtL180M 25个、rtN236T 10个;变异位点组合模式主要有:rtL180M+rtM204I、rtM204V、rtM204I+rtM204V、rtA181V+rtM204V、rtM204I、rtA181V+rtN236T等;51个对NAs应答不佳病例耐药变异检出率70.59%,46个病毒学突破病例耐药变异检出率95.65%,差异明显(P0.01)。NAs单药治疗病例早于多药治疗病例检出耐药相关位点(P0.01);NAs治疗时间越长,耐药变异检出率越高(P0.01);病例HBV-DNA水平等级越高,耐药变异检出率也越高(P0.01)。结论⑴NAs治疗慢性乙型肝炎可导致HBV逆转录酶区变异,NAs抗乙型肝炎病毒效果不佳与HBV逆转录酶区变异密切相关;⑵不同NAs药物导致慢性乙肝患者HBV逆转录酶区变异位点、变异模式特点不同;⑶NAs治疗慢性乙型肝炎的用药种类与方式、治疗时长,患者HBV-DNA水平等对HBV逆转录酶区发生耐药变异均可能产生重要影响。提示在NAs治疗前、治疗过程合适时间点检测NAs耐药相关变异位点和HBV DNA水平,可为临床慢性乙型肝炎的抗病毒治疗提供重要参考。     

石家庄地区L-核苷类抗病毒药物耐药突变情况分析

目的 分析石家庄地区L-核苷类抗病毒药物耐药突变情况.方法 对石家庄市第五医院就诊的慢性乙型肝炎患者119例进行乙型肝炎病毒逆转录酶区(HBV P区)基因序列测定.结果 119例患者HBV基因分型中B型5例(4.2％),C型114例(95.8％).在B型中4例rtM204I突变;C型中73例rtM204I突变,40例rtM204V突变,1例rtM204I/V突变.119例存在204位点变异的慢性乙型肝炎患者中,共有9种突变模式,其中rtM204I单位点突变占总突变比例的23.5％(28/119),rtM204V单点突变占总突变比例的6％(7/119),rtL180M+rtM204I联合突变占总突变比例的22.7％(27/119),rtL180M+ rtM204V联合突变占总突变比例的27.8％(33/119).结论 慢性乙型肝炎核苷类药物抗病毒治疗过程中,及时监测HBV P区基因耐药情况,尤其是出现rtM204I/V突变后,很容易联合其他位点突变.     

Posttransfusion hepatitis B transmitted by blood from a hepatitis B surface antigen-negative hepatitis B virus carrier

A female blood donor at our institution was implicated in three cases of clinical posttransfusion hepatitis B. She had given blood 25 times in 8 years. Twenty-seven recipients were followed up, and about one-half of those who were still living had serologic markers of hepatitis B virus (HBV) infection. The donor was repeatedly negative for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and antibody, but she had high titers of antibody to hepatitis B core antigen. We conclude that blood from this HBsAg-negative blood donor was capable of transmitting hepatitis B.     

Management of hepatitis B

Treatment of chronic hepatitis B needs to consider two aspects. First, a certain proportion of patients will spontaneously undergo a stable remission of the underlying liver disease, i.e. without therapeutic intervention, on occasion of the HBeAg --> anti-HBe seroconversion. Second, all drugs that have been used so far in the treatment of HBV have rarely resulted in the definitive eradication of the viral infection, i.e. a permanent disappearance of HBsAg with development of anti-HBs. Thus, the most reasonable, albeit surrogate endpoint of treatment is the acceleration towards HBeAg --> anti-HBe seroconversion and/or the stable suppression of HBV replication at levels below 500000 copies/ml, which is associated with disappearance of intrahepatic necrosis and inflammation and slowing down of the fibrosis progression. Two drugs are currently available--interferon-alpha and lamivudine--and a third antiviral compound (adefovir dipivoxil) will soon appear in the market. Advantages and disadvantages of different therapeutic options are discussed below.     

Treatment of hepatitis B

Hepatitis B virus (HBV) is a major world health problem and a common cause of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The natural history of HBV varies with many factors, including age of acquisition. Persistent elevation of alanine aminotransferase (ALT) levels and presence of hepatitis B surface antigen for > 6 months after infection suggest chronic HBV. Presence of hepatitis B e antigen (HBeAg) and HBV DNA in serum indicate active disease. Treatment is indicated for chronic active HBV. The aim of treatment is to suppress viral replication and eliminate the virus. Endpoints of treatment are normalization of ALT levels and elimination of HBeAg and HBV DNA from the blood. Available treatments are interferon alfa and lamivudine. Interferon is effective in 25% to 40% of patients, but has serious side effects. Lamivudine is effective in a similar percentage of patients and has fewer side effects; however, it is associated with the emergence of viral mutations and drug-resistant strains.     

慢性HBV感染者肝组织HBV cccDNA的定量检测

目的建立一种肝活检组织中HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）的定量检测方法。方法待检肝组织标本共21份，来源于江苏省人民医院肝脏手术患者，包括19份慢性HBV感染，其中HBeAg（＋）标本10份，HBeAg（-）标本9份，4份非HBV感染为阴性对照组，取HBVDNA阳性的患者外周血作为rcDNA组。检测方法的主要步骤为肝组织经蛋白酶K和细胞裂解缓冲液消化后，用液相抽提法提取核酸，将提取的核酸溶液分为2等份。1份用特异性降解单链DNA的核酸酶加以消化，纯化后使用跨缺口引物和SYBR GreenⅠ荧光染料进行实时荧光定量PCR分析；另1等份则用以定量检测肝细胞看家基因（β-Globin）作为样本细胞参数。检测结果的特异性主要通过PCR反应产物的序列分析及rcDNA组结果的对照进行证实，HBeAg（＋）组和HBeAg（-）组cccDNA水平的差异通过两样本t检验进行分析。结果PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增产物的碱基数为350bp左右，DNA测序分析提示产物与目的片段的序列符合率为99％以上，且以rcDNA为对照的结果均为阴性，排除最有可能造成假阳性的rcDNA对结果的干扰。本方法对10mg HBeAg（＋）肝组织标本的cccDNA的检测阳性率为100％。血清HBeAg（＋）的肝组织样本的平均HBV cccDNA水平高于HBeAb（＋）的肝组织标本（P〈0．05）。结论通过上述三种途径证实了本文所建立方法的特异性。应用SYBR GreenⅠ荧光染料和β-Globin作为样本细胞参数所建立的实时荧光定量PCR方法检测肝细胞内HBV cccDNA，具有较高的特异性、敏感性，且成本较低的特点。     

Hepatitis B virus DNA and hepatitis B surface antigen levels in chronic hepatitis B

Despite universal vaccination, chronic hepatitis B (CHB) continues to be a major health burden worldwide, with an estimated 350–400 million people infected with the virus. Over the past decade, rapid progress has been made with regards to antiviral therapy for CHB, from conventional interferon to pegylated interferon, and with the earliest oral agent lamivudine to the current, more potent drugs such as entecavir and tenofovir. There have also been new developments in the diagnostic and monitoring tools for CHB. Qualitative hepatitis B surface antigen (HBsAg) testing has been used to diagnose patients infected with CHB. More recently, quantitative HBsAg titers have been used to predict treatment outcome when measured at baseline or early into treatment. The progress on the use of hepatitis B virus (HBV) DNA levels has been more rapid. Serum HBV DNA levels have been shown to be important in the natural history of CHB infection, with higher levels being significantly associated with the development of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. For patients receiving antiviral therapy, the baseline and early on-treatment HBV DNA levels are important in determining treatment outcomes. Monitoring of HBV DNA levels during therapy will allow for early detection of drug resistance. The end-of-treatment and post-treatment HBV DNA levels have been demonstrated to be important indicators of treatment success and relapse, respectively. With newer and more powerful antiviral agents, and with the development of quantitative assays that are highly sensitive, further studies are needed to optimize the use of these tools and agents in the modern management of CHB.     

Quantitative analysis of hepatitis B virus precore mutant in hepatitis type B.

Active liver disease has been detected in chronic hepatitis B after seroconversion from positive HBe antigen to positive anti-HBe antibody. Active replication of HB virus (HBV) containing a precore stop-codon mutation has been implicated in this condition. The usual methods, such as direct sequencing, to characterize the responsible mutant of HBV are not suitable for routine clinical use. Here we employed the competitive mutation site specific assay (CMSSA) to detect precore mutant HBV-DNA in patients with positive HB surface antigen. In patients with HBe antigen, precore mutant HBV-DNA was significantly higher than in patients with HBe antibody. The level of precore mutant HBV-DNA in patients with elevated serum ALT was significantly higher than in patients with normal serum ALT. Sex, age and the level of serum HBV-associated DNA polymerase levels were not correlated with levels of precore mutant HBV-DNA. Ten of 11 negative patients for the precore mutant by polymerase chain reaction followed by restriction fragment length polymorphism assay (PCRRFLP) were positive for the precore mutant by CMSSA. These results suggest that the precore mutant has already emerged in the HBeAg-positive phase as determined by CMSSA, which is more sensitive than PCR-RFLP and is useful for evaluating the clinical course of patients with chronic hepatitis B.