抗肝癌单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体的构建及病毒包装细胞系的建立

人类基因治疗技术的迅速发展使越来越多针对先天性和获得性疾病的基因治疗方案进入临床试验,同时,逆转录病毒作为介导基因转染的载体也是目前基础和临床应用研究中最广泛使用的基因转移方法[1-3].迄今所掌握的研究资料表明,接受逆转录病毒介导基因治疗的患者中尚未发现因病毒感染导致的不良反应.因此,我们选择改造的缺陷型逆转录病毒载体pLXSN,将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因(sFv-TNF-α)克隆至该载体,进行病毒包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系的研究.     

人Tum-5基因逆转录病毒载体及包装细胞株的构建

目的 构建携带Tum-5基因的逆转录病毒载体并对其进行包装,获得稳定的产毒细胞系.方法 采用RT-PCR法从胎肾组织中扩增Tum-5基因片断,并将其定向克隆到逆转录病毒载体pLXSN中进行PCR、双酶切和测序鉴定.利用电穿孔方法 将获得的重组质粒转染PA317细胞,经G418 筛选抗性克隆,收集病毒上清后感染NIH3T3 细胞测定病毒滴度.结果 PCR、酶切证实Tum-5基因克隆至逆转录病毒载体pLXSN,Tum-5基因测序结果 和原始序列相同.重组逆转录病毒载体转染PA317 包装细胞,RT-PCR证实转染后的PA317细胞上清液中存在携带人Tum-5基因的病毒RNA,病毒滴度为2.05×104cfu/ml.结论 成功的构建了携带人Tum-5基因的逆转录病毒载体,获得了稳定的产毒细胞系.     

HSV1-tk基因逆转录病毒载体构建、病毒包装及稳定细胞株建立

目的构建携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pDON-AI-HSV1-tk,包装后产生携带相应基因的逆转录病毒并稳定感染T47D乳腺癌细胞。方法用PCR方法扩增HSV1-tk基因,利用基因重组技术构建逆转录病毒载体pDON-AI-HSV1-tk,经PCR及BamHI、SalI双酶切鉴定后与gag-pol和env表达载体用脂质体法共同转染293T包装细胞,产生含有HSV1-tk基因的逆转录病毒并用其感染T47D细胞,经G418筛选获得稳定表达株,命名为tk/T47D。结果构建了携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pDON-AI-HSV1-tk,并通过PCR及BamHI、SalI双酶切证实。包装产生的逆转录病毒提取病毒基因组后PCR扩增出目的基因HSV1-tk,并成功地建立稳定表达HSV1-tk基因的T47D细胞。结论成功的构建了含有HSV1-tk基因的逆转录病毒载体并包装出携带相应基因的逆转录病毒,建立稳定表达HSV1-tk基因的乳腺癌T47D细胞株。     

携带GFP基因逆转录病毒感染原代培养脐带基质间充质细胞

目的应用携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的逆转录病毒感染原代培养脐带基质间充质细胞,为细胞重编程实验提供有效基因转移载体。方法利用酶消化法在体外分离培养脐带基质间充质细胞。应用磷酸钙法将GFP基因转染到293T细胞内,包装生产携带GFP基因的逆转录病毒。收集病毒上清液感染脐带基质间充质细胞,应用倒置荧光显微镜观察逆转录病毒感染脐带基质间充质细胞情况。结果体外分离培养出脐带基质间充质细胞;293T细胞包装生产携带GFP基因逆转录病毒;包装生产后的逆转录病毒成功地感染脐带基质间充质细胞。结论逆转录病毒可作为有效载体将外源性基因转染入脐带基质间充质细胞内,并且细胞能够稳定表达被导入的外源性基因。     

造血干细胞基因治疗的研究进展

由于造血干细胞具有高度自我更新能力 ,且能分化产生各系血细胞 ,将基因转导至造血干细胞 ,能使转导基因终生存在于血细胞内 ,故造血细胞成为基因治疗的理想靶细胞。逆转录病毒是目前造血细胞基因转导最主要的载体系统 ,它能有效地将外源基因整合到宿主基因组中 ,使外源基因稳定表达而不丢失〔1〕。在 2 0世纪 80年代早期 ,以小鼠白血病病毒(MLV)为基础的逆转录病毒载体引进不久 ,就成功地将基因转导至鼠造血干细胞中 ,并在子代细胞中有效稳定的表达。之后 ,人们设想人造血干细胞基因治疗将成为现实。造血干细胞基因治疗的主要目标是使转…     

HSV-TK逆转录病毒包装细胞系建立及病毒滴度测定

目的 建立HSV-TK逆转录病毒包装细胞系并获得高产病毒的细胞株.方法 将TK基因与逆转录表达载体PLEGFP-N1连接后转染到包装细胞PA317中,经G418及荧光蛋白双重筛选得到高产病毒的细胞株.结果 经酶切鉴定成功构建PIEGFP-N1-TK重组载体,含HSV-TK基因重组逆转录病毒包装细胞PA317成功建立,经病毒滴度测定获得高产病毒的PA317/TK细胞株.结论 制备的重组病毒具有感染靶细胞的活性,为进一步应用HSV-TK基因进行肺癌的自杀基因治疗研究奠定基础.     

病毒载体介导的帕金森病基因治疗研究进展

帕金森病 (PD)是一种常见的神经系统变性疾病 ,其病理改变主要为中脑黑质致密区多巴胺能神经元变性和消失 ,以及体内多巴胺水平的下降。 80年代末 ,随着基因治疗概念的不断深入 ,基因治疗技术日趋成熟 ,人们开始了对PD基因治疗的尝试。近年来PD动物模型基因治疗已经取得了不少进展。在基因治疗的体外及体内两种途径中 ,研究最多的是病毒载体相关的基因导入系统。目前研究较多病毒载体有 :腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体、其他逆转录病毒载体。　　一、病毒载体的制备　　用于基因治疗的病毒载体应具备以下条…     

腺相关病毒为载体的基因治疗在肝病应用中的进展

基因治疗是目前医学研究的热点课题。将目的基因转入细胞的方法有很多，包括脂质体包裹转染、电打孔、微注射等，最近以重组病毒为载体的基因治疗因其独特的优势受到关注。比较常用的三大病毒载体是逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒（adeno—associated virus，AAV）。各种病毒载体都有各自的优点和不足，在细胞和动物实验研究中均有大量的应用。但是在临床应用中，逆转录病毒为载体的基因治疗由于在法国的临床试验出现2例白血病病历，     

嗜肝细胞腺相关病毒载体的构建

HBV具有天然嗜肝性,其中由HBVpreS1基因编码的前S1(PreS1)抗原位于病毒外壳表面,是HBV嗜肝性的主要分子机制[1].重组腺相关病毒(rAAV)是目前常用的基因治疗载体.我们以腺相关病毒载体系统为基础,用PreS1的编码基因HBVpreS1替代腺相关病毒载体系统的Cap基因,构建出以PreS1为衣壳的重组腺相关病毒载体(rA AVHBVpreS1),旨在探索构建肝病基因治疗特异性载体,为肝病靶向基因治疗提供实验研究基础.     

嗜肝细胞腺相关病毒载体的构建

HBV具有天然嗜肝性,其中由HBVpreS1基因编码的前S1(PreS1)抗原位于病毒外壳表面,是HBV嗜肝性的主要分子机制[1].重组腺相关病毒(rAAV)是目前常用的基因治疗载体.我们以腺相关病毒载体系统为基础,用PreS1的编码基因HBVpreS1替代腺相关病毒载体系统的Cap基因,构建出以PreS1为衣壳的重组腺相关病毒载体(rA AVHBVpreS1),旨在探索构建肝病基因治疗特异性载体,为肝病靶向基因治疗提供实验研究基础.     

慢病毒载体在RNA干扰中的应用

慢病毒载体是以人类免疫缺陷1型病毒为基础发展起来的基因治疗载体.区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力.该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久件表达.在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的基因治疗效果.RNA干扰技术是近年来发展起来的新技术,通过产生针对特定基因的小分子干扰RNA,能高效特异地抑制特定基因的表达,在探查基因功能和治疗人类疾病方面有广阔的应用前景.     

P~(LXSN/Lacz)逆转录病毒载体的构建及其在大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达

血管成形术后再狭窄的药物防治失败促使人们寻找其它干预手段.基因转染效率的提高使得人们对基因治疗攻克再狭窄抱以很大的希望.本研究构建了携带Lacz基因的逆转录病毒载体P~(LXSN/Lacz),通过Lipofectin导入PA317细胞,G418筛选后获得了高滴度病毒分泌细胞株PA317~(LXSN/Lacz).将PA317~(LXSN/Lacz)的上清液转染SMC,G418筛选后获得阳性克隆SMC~(LXSN/Lacz),对PA317~(LXSN/Lacz)和转染的SMC进行X-gal染色.结果:成功构建了P~(LXSN/Lacz);PA31~(LXSN/Lacz)和SMC~(LXSN/Lacz)经X-gal染色均被染成蓝色;逆转录病毒体对体外SMC的转染效率接近100%.结论:Lacz基因整合于PA317~(LXSN/Lacz)和SMC~(LXSN/Lacz)中并得到了有效表达;在体外,逆转录病毒载体对SMC的转染效率很高,本研究为再狭窄的基因治疗研究奠定了基础并提供了一极好的对照载体P~(LXSN/Lacz).     

腺病毒载体在心血管基因转移体系中的应用

基因转移是实现基因治疗的关键所在,对心血管疾病进行基因治疗,需一高效的基因转移载体和实用的转移体系将目的基因导入心脏和血管,并安全忠实地表达。腺病毒是目前广泛应用于心血管基因转移的病毒载体,因它提供了一种简单、瞬间显改善可行的方法。     

可溶性TGF-β1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建表达人TGF-β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础.方法:以RT-PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度.结果:经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系.结论:成功构建了重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.     

基因治疗进展及其在心血管疾病中的应用

随着分子生物学理论和技术的进展,特别是在载体的构建、靶基因的界定和活体内基因转移技术等方面所取得的重要进展,使许多因基因结构或表达异常引起的心血管疾病利用基因治疗可获得根治。自1992年人类首次成功地应用低密度脂蛋白受体基因治疗家族性高胆固醇血症,揭开了心血管疾病基因治疗的序幕,近十年时间内,心血管疾病基因治疗取得了一系列令人瞩目的成就。本文就基因治疗方法学及其在心血管领域的应用进展作一综述。1　基因治疗方法学及进展1.1　基因治疗的概念:基因治疗指将正常和野生型的基因插入靶细胞的染色质基因组中,以补充缺失基…     

逆转录病毒介导HSV-TK基因治疗胰腺癌——实验研究

目的:探讨应用逆转录病毒载体介导HSV-TK基因治疗实验性人胰腺癌细胞系8988的价值。方法:HSV-TK被定向克隆入逆转录病毒载体pMNSM的SV_(40) 下游。重组逆转录病毒载体pMNS-TK-M转染至逆转录病毒包装细胞PA317细胞,产生的重组病毒将HSV-TK转入人胰腺癌细胞系8988细胞内。结果:Southern-blot试验及药敏试验均证实HSV-TK基因已整合至细胞DNA中并完全表达。体外试验证实,HSV-TK阳性8988细胞对ACV的敏感性较母细胞明显为高;裸鼠移植瘤试验证实,腹腔注射ACV有明显阻止移植瘤的形成以及对移植瘤的治疗作用。结论:HSV-TK/ACV有体内治疗胰腺癌的作用,可作为胰腺癌基因治疗的潜在方法之一。     

消化疾病的基因治疗

基因治疗旨在从分子水平纠正疾病,将靶基因传递进宿主细胞以提供新的基因功能,或阻止有害基因表达的合成。靶基因可以是ＤＮＡ或ｍＲＮＡ水平。基因治疗可通过体外或体内途径达到。载体一、病毒载体１．逆转录病毒载体：逆转录病毒载体已被广泛运用,操作简便,病毒产量高,转染各型分裂相细胞的效率高。已成功地应用这一系统于体外,将ＩＬ－７和新霉素磷酸转移酶转移入大鼠肝细胞,以及在体内,将ＩＸ因子传递入血友病Ｂ犬模型的肝细胞。转基因的表达分别维持在期望水平２１天和５个月。除肝细胞外,肠道上皮细胞也是基因转移的可行目标…     

pSLX-CMV/TβRII-IgG1Fc载体的构建

目的构建表达人TGFβ1II型受体细胞外结合区和人IgG1Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础。方法以RTPCR方法扩增目的基因TβRIIIgG1Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEMTEasy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRIIIgG1Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pSLXCMV中,重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度。结果经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确无误,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系。结论成功构建了重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径。     

双嗜性逆转录病毒感染日本血吸虫细胞的生物学理论与可行性探讨

目的探讨用双嗜性逆转录病毒载体将外源基因导入日本血吸虫（Sj）细胞的生物学理论与实验依据。方法用生物信息学方法对双嗜性逆转录病毒rRam-1受体同源性分布、结构与功能作系统的分析与比较;利用携带外源E77.43基因的双嗜性逆转录病毒感染Sj童虫培养细胞,经PCR和RT-PCR检测感染细胞目的基因（E77.43）的整合与表达。结果根据生物信息学分析结果推断,Sj细胞膜上存在的SjCHGC09605和SjCHGC05362两种蛋白为非分泌性跨膜蛋白,可能具有细胞膜离子转运通道或受体蛋白的功能及双嗜性逆转录病毒感染的膜受体样作用,可能参与病毒对细胞的吸附和穿入过程;利用携带外源E77.43基因的双嗜性逆转录病毒感染Sj童虫培养细胞后,用PCR及RT-PCR检测到目的基因整合与表达,扩增的目的片段大小为330 bp,与理论值相符。结论用载有E77.43基因的双嗜性逆转录病毒感染Sj童虫细胞获得成功,推测SjCHGC09605和SjCHGC05362两种与rRam-1受体同源的蛋白可能是Sj感染过程中起作用的分子。研究结果为下一步用双嗜性逆转录病毒载体转导永生化基因到Sj细胞提供了生物学理论与实验依据。     

pSLX-CMV/TβRⅡ-IgG1 Fc载体的构建

目的构建表达人TGF-β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础.方法以RT-PCR方法扩增目的基因TβRII-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRII-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pSLX-CMV中,重组质粒pSLX-CMV/TβRII-IgG1 Fc在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度.结果经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确无误,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系.结论成功构建了重组质粒pSLX-CMV/TβRII-IgG1 Fc,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.