乙肝病毒X基因的转染及表达对HL-7702肝细胞凋亡的影响

目的 探讨乙肝病毒(HBV)X基因及其蛋白产物HBxAg对肝细胞HL-7702凋亡的影响，阐释HBVX基因及产物在包括肝细胞癌(HCC)的HBV感染相关疾病中的作用。方法 用分子克隆方法构建HBVX基因重组质粒pcDNA3-X，并用脂质体转染法将其导入肝细胞HL-7702中，G418选择培养，RT-PCR鉴定以构建稳定表达HBVX基因的肝细胞株HL-7702／HBx．以转染空质粒pcDNA3的HL-7702(HL-7702／pcDNA3)和未转染的HL-7702作对照，用流式细胞分析，TUNEI．技术和电镜来分析细胞凋亡情况。用pcDNA3-X瞬时转染肝细胞HL-7702，在转染后24．48，72．96，120h，分别抽提RNA后用RT-PCR法对HBVX基因表达进行半定量检测，并对不同时段的转染细胞行流式细胞分析探讨肝细胞凋亡的状况。结果 重组质粒pcDNA3-X转染后经G418筛选，肝细胞株HL-7702／HBx经RT-PCR鉴定证实有稳定表达HBVX基因；流式细胞、TUNEL技术显示HL-7702／HBx细胞凋亡明显高于HL-7702／pcDNA3和HL-7702．电镜报告HL-7702／HBx细胞出现凋亡现象．有凋亡小体，对照组未发现；瞬时转染RT-PCR显示转染后72hHBVX基因表达量最高，流式细胞仪分析发现肝细胞凋亡于72h达到最高值，之后随着X基因表达量下降，肝细胞凋亡减少。结论 HBVX基因及其蛋白产物X蛋白有促进HL-7702肝细胞凋亡的作用．二者间存在着量效关系．即X基因表达越高，肝细胞凋亡越明显。HBxAg通过调控肝细胞凋亡在肝细胞的恶性转化中起重要作用。     

IL-10对稳定转染HBx基因的HL-7702细胞增殖的影响

目的 探讨白细胞介素-10(IL-10)在稳定转染乙型肝炎病毒X(HBx)基因的HL-7702肝细胞增殖的作用及机制.方法 CCK-8法测定HBx基因对HL-7702细胞增殖的作用及IL-10对HL-7702/HBx细胞增殖的作用;流式细胞术测定IL-10对HL-7702/HBx细胞凋亡的影响;RT-PCR法测定HBx基因对HL-7702细胞表达CDKN1B蛋白质mRNA的作用及IL-10对HL-7702/HBx表达CDKN1B mRNA的作用.结果 CCK-8法显示,HL-7702/HBx细胞比HL-7702细胞和HL-7702/MOCK细胞增殖速度明显加快(P<0.05);80 ng/mL的IL-10作用24 h可抑制HL-7702/HBx细胞增殖(P<0.05);流式细胞术显示,80 ng/mL的IL-10作用24 h对HL-7702细胞、HL-7702/HBx细胞及HL7702/MOCK细胞凋亡均无影响;RT-PCR法显示,HL-7702/HBx细胞CDKN1B mRNA表达量较HL-7702细胞和HL-7702/MOCK细胞降低(P<0.05),80 ng/mL的IL-10作用24 h后,HL-7702/HBx细胞较HL-7702/HBx空白组CDKN1B mRNA表达量上调(P<0.05).结论 HBx基因可促进HL-7702细胞增殖,IL-10可抑制HL-7702/HBx细胞增殖而对其凋亡无影响.HBx基因可能通过下调HL-7702/HBx细胞CDKN1B mRNA的表达量而促进细胞增殖,IL-10可能通过上调HL-7702/HBx细胞CDKN1B mRNA的表达量而抑制细胞增殖.     

乙型肝炎病毒X基因对正常肝细胞HL7702凋亡影响的初步探讨

目的 研究乙型肝炎病毒X基因(HBX基因)对HL7702肝细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响.方法 用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3.1( )-X瞬时转入HL7702细胞,以转染空质粒pcDNA3.1( )的细胞及未转染的HL7702细胞为对照.转染后72 h收集细胞标本,作以下处理:RT-PCR法检测HBX mRNA的表达,免疫荧光鉴定HBx蛋白的表达;流式细胞术检测细胞凋亡率;以β-actin为内参,半定量RT-PCR法检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2 mRNA的表达量变化.结果 转染72h后,转染pcDNA3.1( )-X真核表达载体的HL7702细胞经RT-PCR扩增出HBX片段,免疫荧光结果 显示细胞内出现HBx蛋白的较强荧光;而转染空质粒组及未转染对照组经RT-PCR法及免疫荧光检测均显示无HBx表达.通过流式细胞术和半定量RT-PCR法检测细胞凋亡情况,结果 显示:转染HBX的细胞凋亡率(3.38%±0.67%)相对于转染空质粒组(1.25%±0.30%)及未转染质粒组(1.40%±0.37%)凋亡率增高, 差异均有显著性意义(P<0.05);转染HBx的细胞Bax mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差异均有显著性意义(P<0.05),Bcl-2 mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显降低,差异均有显著性意义(P<0.05).转染空质粒组和未转染质粒组之间,对细胞凋亡率、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA进行比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论成功将HBX转染入HL7702细胞,并在细胞中表达;转染后72 h HBx可上调Bax表达,而下调Bcl-2表达,表明HBx能促进HL7702细胞凋亡.     

HBx基因缺失突变体(HBx-d382)对L02细胞cyclinD1、cyclinG1和E2F1表达的影响

目的 前期的研究成功构建了稳定表达HBx基因及其缺失突变体( HBx-d382)的L02细胞,分别命名为L02/HBx和L02/HBx-d382,并证实其可导致肝细胞恶性转化.该研究进一步探讨HBx-d382对L02细胞G1期细胞周期调控相关基因cyclinD1,cyclinG1和E2F1表达的影响.方法 实验分为L02/pcDNA3.0(稳定转染pcDNA3.0)、L02/HBx和L02/HBx-d382(分别稳定转染质粒pcDNA3.0/HBx和pcDNA3.0/HBx-d382)3组.通过实时定量PCR以及wester-blot检测转染HBx基因及其缺失突变体HBx-d382后L02细胞cyclinD1、cyclinG1和E2F1表达的改变.结果 实时定量PCR以及wester-blot结果表明稳定表达HBx基因或HBx-d382的L02细胞cyclinD1、cyclinG1和E2F1表达上调,表达HBx-d382的L02细胞上调最为明显.结论 HBx-d382可能通过上调cyclinD1、cyclinG1和E2F1从而影响细胞G1期调控,进一步导致肝细胞恶性转化.     

HBx及其突变体X17-3对Hippo信号途径表达的影响

目的初步探寻HBx及其不同突变体表达与Hippo信号途径的关系,以及对细胞凋亡的影响。方法 HBx及其突变体载体转染人正常肝细胞系L02,转染48 h后,提取总蛋白,Western blot检测细胞中Hippo信号途径MST1、YAP(yes-associated protein)的表达,磷酸化和去磷酸化的情况。采用Annexin V/PI标记流式细胞术检测细胞凋亡。结果HBx及其突变体载体转染L02细胞48 h后,Western blot结果显示细胞MST1表达下调,p-MST1/2表达上升(P<0.05);YAP表达上升,p-YAP表达下调(P<0.05)。Annexin V/PI标记法流式细胞术结果显示HBx及其突变体能促进L02细胞发生凋亡(P<0.05),其介导的细胞早期凋亡尤为明显。结论 HBx通过Hippo信号通路途径调控下游致癌基因YAP的表达。结合HBx介导的L02细胞凋亡这一结果说明HBx可能通过多种途径调节细胞周期。     

HL7702-HBX与HepG2-HBX细胞株的建立及鉴定

目的建立稳定、高效的HBx蛋白体外表达细胞株。以便进一步研究HBX基因和HBx蛋白的致癌作用及机理。方法建立HBX真核表达载体pcDNA3．1-HBX,通过脂质体介导将pcDNA3．1-HBX转染到人正常肝细胞株HL7702及人肝肿瘤细胞株HepG2中。结果RT-PCR、蛋白质印迹及免疫荧光的实验结果显示,HBX基因在人正常肝细胞株HL7702及人肝肿瘤细胞株HepG2中得到了表达。结论成功构建了表达HBx蛋白的HL7702-HBX与HepG2-HBX细胞株,为进一步研究HBX基因和HBx蛋白的致癌作用及机制奠定了实验基础。     

人肝细胞生长因子基因表达对CCl4损伤的人肝细胞及大鼠肝星状细胞株的影响及其机制

目的：探讨人肝细胞生长因子(hHGF) 基因的表达对CCl4损伤的人肝细胞及大鼠肝星状细胞株（CFSC-2G）生物学效应的影响及其对CCl4损伤的人正常肝细胞株（HL-7702）的保护作用,进一步探讨凋亡产生的机制。方法：将获得的稳定转染HL-7702细胞克隆,分为4组,Ⅰ组为转染PCI-neo-hHGF实验组,Ⅱ组为转染PCI-neo空载体对照组,Ⅲ组为仅加入脂质体的对照组,Ⅳ组为空白对照组。采用MTT法测定细胞增殖活性。采用Western blotting测定转染PCI-neo-hHGF的HL-7702细胞和CFSC-2G细胞中hHGF、caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白质的表达。结果：HL-7702细胞转染PCI-neo-HGF并培养48 h后,细胞的增殖活性明显高于PCI-neo空载体对照组、脂质体转染对照组和空白对照组HL-7702细胞（P<0.01）,而且随着转染PCI-neo-HGF剂量增加,细胞的增殖活性有一定的增长趋势,但各组间比较差异无显著性（P>0.05）;PCI-neo-HGF转染的HL-7702细胞caspase-3蛋白质表达量较CCl4损伤的HL-7702细胞和PCI-neo转染的HL-7702细胞明显降低,未检测到caspase-8和caspase-9蛋白质的表达;PCI-neo-HGF转染的CFSC-2G细胞caspase-3蛋白质表达量较CCl4诱导的CFSC-2G增加,caspase-9蛋白质表达也呈阳性。结论：PCI-neo-HGF可促进体外培养的HL-7702细胞的生长增殖,能够抑制CCl4损伤的HL-7702细胞的凋亡,促进大鼠CFSC-2G细胞的凋亡,其作用机制可能与上调caspase-3和caspase-9蛋白质表达有关。     

DESI2基因在肝细胞癌中的表达及其对HepG2细胞凋亡的影响

目的：研究DESI2基因在肝细胞癌中的表达及其对肝癌细胞的影响。方法 Real-time PCR检测53例肝细胞癌与相应癌旁组织中DESI2 mRNA表达。构建DESI2基因真核表达载体pcDNA3．3-DESI2,转染HepG2细胞。 Western blot检测转染后HepG2细胞DESI2蛋白的表达,流式细胞术双标记法检测细胞凋亡率。结果与癌旁组织相比,DESI2 mRNA在肝细胞癌组织中表达下调63．95％。转染DESI2基因真核表达载体pcDNA3．3-DE-SI2后,HepG2细胞DESI2蛋白表达明显增加,细胞凋亡率明显增加。结论 DESI2基因在肝细胞癌中表达下调,其表达上调能够促进肝癌细胞凋亡。     

乙肝病毒X蛋白对肝星状细胞的增殖及其表达TGFβ1和CTGF的影响

目的研究乙肝病毒X蛋白(HBx)对肝星状细胞(HSC)增殖的影响及其可能的分子机制。方法运用分子生物学方法构建稳定表达HBV X基因的HL-7702肝细胞株(L02/x)。RT-PCR、Western blot鉴定L02/x细胞HBV X基因的稳定表达。将HSC细胞分别与L02/x、转染空质粒和未转染的肝细胞共培养36h,分别命名为HSC/x、HSC/ctr和HSC/NC。CCK-8法检测各组HSC增殖,Real-time PCR法检测在HSC增殖中起重要作用的TGFβ1和CTGF基因在各组HSC中的mRNA表达。结果 RT-PCR和Western blot结果显示,L02/x细胞中有HBV X基因mRNA和蛋白的表达。CCK-8法检测显示,HSC/x的增殖(0.737 7±0.014 2)显著高于HSC/ctr(0.497 0±0.008 5)和HSC/NC(0.491 3±0.018 6),差别具有统计学意义(P<0.01)。Real-time PCR显示,HSC/x细胞中的TGFβ1和CTGF mRNA相对表达量(3.146 1±0.070 5,2.982 9±0.031 5)均显著高于HSC/ctr(1.004 6±0.004 0,1.022 2±0.062 7)和HSC/NC(1.000 0±0.000 0,1.000 0±0.000 0),差别具有统计学意义(P均<0.01)。结论肝细胞中表达的HBV X基因可以上调HSC细胞TGFβ1和CTGF基因的表达,促进共培养的HSC增殖。     

目的基因CXCL-1慢病毒表达系统的构建及在人正常肝细胞中的功能研究

目的：探讨含目的基因趋化因子生长调节基因1（CXCL-1）慢病毒表达系统的构建及CXCL-1对7702正常肝细胞生长、增殖、迁移生物学功能的影响。方法：构建含目的基因CXCL-1的慢病毒表达系统,建立携带GFP荧光标记并过度表达CXCL-1的7702正常肝细胞系,Western blot方法检测CXCL-1在转染细胞中的表达,细胞单克隆形成实验,MTT实验,Transwell实验检测7702细胞表达CXCL-1后生长、增殖和迁移能力的变化情况。结果：1成功构建目的基因CXCL-1慢病毒表达系统,病毒滴度检测结果为2.00E＋8TU/mL;2转染48h后经流式细胞仪检测,转染率达94.5%;3CXCL-1/7702组克隆形成率显著高于其余两对照组（P〈0.05）;4MTT比色法结果显示：CXCL-1/7702组分别与空载GFP/7702组及空白对照7702组相比较,生长速度明显较快（P〈0.05）;5Transwell实验显示：CXCL-1/7702组、GFP/7702组、7702组肝细胞系均无迁移能力。结论：成功构建含目的基因CXCL-1的慢病毒表达系统,CXCL-1对正常肝细胞具有明显的促细胞生长与增殖功能,但无促进正常肝细胞迁移的功能。     

乙肝病毒X基因慢病毒载体的构建和鉴定

目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白的重组慢病毒载体pRRLsincPPT-hPGK-X-IRES-eGFP-WPRE(pRRL-X),并感染正常组织来源的人肝细胞HL-7702,以验证其在体外的感染效率.方法 采用PCR技术扩增出HBV X基因的DNA片段,用IN-Fusion技术构建表达载体pRRL-X并鉴定,j...     

The Effect of HBx Gene on the Apoptosis of Hepatic Cells

To study the effect of HBx gene on the apoptosis of the cell lines (L02, HepG2) and the interaction between HBx and X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP), the apoptosis of pcDNA3.1-HBx transiently transfected cell lines (L02, HepG2) was detected by flow cytometry and the mRNA expression of XIAP was assayed by real-time RT-PCR. Our study showed (1) the mor- phology of L02/pcDNA3.1-HBx was changed and the appearance of the cells mimicked that of HepG2 cells; (2) HBx gene could be detected in L02/pcDNA3.1-HBx and HepG2/ pcDNA3.1-HBx; (3) the apoptosis rate of L02/pcDNA 3.1-HBx was higher than that of L02 cells (P<0.01) and the apoptosis rate of HepG2/pcDNA3.1-HBx was lower than that of HepG2 cells (P<0.05); (4) the XIAP expression in L02 was about 3 times that in L02/pcDNA3.1-HBx cells (P<0.01), and the expression of XIAP in HepG2/pcDNA3.1-HBx was about 4 times that in HepG2 (P<0.01). It is concluded that HBx gene may promote the apoptosis of normal hepatocytes and inhibit the apoptosis of cells of he- patic carcinoma by regulating the expression of XIAP.     

丹皮酚逆转内质网应激诱导的HepG2细胞凋亡抵抗

目的 探讨丹皮酚逆转内质网应激诱导的HepG2肝癌细胞凋亡抵抗的作用机制.方法 采用MTT及末端双脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记技术(TUNEL)观察内质网应激诱导剂衣霉素对正常人肝细胞株HL-7702及人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖抑制及凋亡作用;Western blot法测定内质网应激诱导剂衣霉素对正常肝细胞HL-7702及肝癌细胞HepG2的环氧合酶-2(COX-2)表达的影响;采用Western blot法及TUNEL法观察COX-2的选择性抑制剂塞来昔布对内质网应激下的肝癌细胞HepG2 COX-2的表达及凋亡的影响;采用MTT及TUNEL法观察丹皮酚对内质网应激下的HepG2肝癌细胞的增殖抑制及凋亡作用;Western blot法观察丹皮酚对内质网应激诱导的HepG2肝癌细胞 COX-2表达的影响:结果与正常肝细胞HL-7702相比,在 TM诱导的内质网应激作用下肝癌细胞HepG2的增殖抑制率及凋亡率减少(P＜0. 05),并且内质网应激可诱导肝癌细胞HepG2产生COX-2蛋白.而丹皮酚可下调内质网应激诱导的HepG2肝癌细胞中COX-2的表达,并使内质网应激诱导的肝癌细胞的凋亡增加.结论 丹皮酚可通过下调COX-2的表达从而逆转内质网应激诱导的HepG2肝癌细胞凋亡抵抗.     

蛇毒cystatin基因真核表达质粒的构建与表达

目的 构建蛇毒cystatin真核表达载体pcDNA3.1/His-cystatin,对其在COS7细胞中的表达进行初步研究.方法 采用PCR法扩增蛇毒cystatin基因片段,插入pcDNA3.1/His C载体中,测定DNA序列后,转染COS7细胞,利用Western-blot检测COS7细胞中cystatin基因的表达.结果 经酶切、测序鉴定证实插入片断已正确,Western-blot检测表明融合蛋白能够在COS7细胞中表达.结论 构建的真核表达载体peDNA3.1/His-cystatin能够在COS7细胞中表达蛇毒cystatin融合蛋白.     

鸡贫血病毒VP 3基因的克隆及其体外凋亡诱导效应的研究

用PCR方法扩增了鸡贫血病毒标准株的vp3基因,并将其克隆于真核表达载体pcDNA3上,构建了重组体pcDNA-vp3.经酶切鉴定及测序分析表明,该片段和预期相符.在体外利用LipofectAMINETM介导的基因转染,将pc-DNA-vp3、pcDNA3分别转入肝癌细胞系HepG2和二倍体肝细胞系L-02中,转染后的RT-PCR结果证实vp3基因在细胞中得到了表达.同时利用筛选稳定表达细胞株的技术和原位细胞凋亡检测法,证明了鸡贫血病毒是以凋亡的方式诱导细胞死亡,并且只诱导癌细胞的凋亡,而不诱导正常或二倍体细胞死亡.表明鸡贫血病毒vp3基因很可能成为一种极具潜力的抗肿瘤生物制剂.     

Cloning of Chicken Anemia Virus vp3 Gene and Apoptosis Inductive Effect of vp3 Gene In Vitro

Chickenanemiavirus (CAV)isaparticulartypeviruswithadiameterofabout 2 3nmandcontainsacircularsinglestrandDNA (minusstrand)of 2 .3kb .ItwasfirstisolatedbyYuasaetalin 1979[1] ,andbelongstotherecentlyestablishedvirusfamilyofCircovirdae[2 ] .ExperimentsperformedbyNotebornetaldemonstratedthatCAVinducesdepletionofcellsviaapoptosisandthecellularbackgroundspeci fiesthesusceptibilitytoCAV[3] .Theinvitroexper imentsdemonstratedthatVP3isthefunctionalpro teinofCAV .AndtheCAVVP3proteincanonlyin du…     

三氧化二砷诱导人食管癌Ec109细胞凋亡伴随c-myc基因的降调节

目的　探讨三氧化二砷 (As2 O3)对食管癌 Ec10 9细胞系的生物学效应及细胞和分子机制。方法　通过四氮唑 (MTT)还原法检测三氧化二砷 (As2 O3)对食管癌 Ec10 9细胞系存活率的影响 ,从形态观察、流式细胞仪分析、DNA凝胶电泳、细胞凋亡原位检测 (TU NEL)研究三氧化二砷诱导食管癌 Ec10 9细胞凋亡的情况 ,并以 Western blot检测基因表达。结果　 Ec10 9细胞经 As2 O3处理后 ,存活率明显降低。光学显微镜下可见到明显的凋亡细胞 ,在细胞周期 G1期前有低于 2倍体的凋亡峰 ;DNA凝胶电泳显示出典型的凋亡特征 :DNA有规律断裂形成的梯状图谱 ,细胞凋亡原位检测发现 DNA断裂 ,Western blot检测表明 c- myc基因的表达下降。结论　 As2 O3能诱导人食管癌Ec10 9细胞凋亡 ,并伴随 c- m yc基因的降调节。     

HBx基因及其缺失突变体(HBx-d382)对L02细胞microRNA表达谱的影响

目的 研究转染HBx基因(hepatitis B virus X gene)及其缺失突变体(HBX-d382)后L02细胞MicroRNA表达谱的变化.方法 通过脂质体转染和G418筛选获得L02/HBx、L02/HBx-d382阳性克隆,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和western blot鉴定目的 基因表达,利用MicroRNA芯片技术检测其对L02细胞MicroRNA表达的影响.结果 RT-PCR及Western blot表明在L02/HBx和L02/HBx-d382细胞株中存在目的 基因表达.MicroRNA芯片发现与L02细胞相比,L02/HBx-d382细胞有7个MicroRNA表达上调,5个MicroRNA表达下调,L02/HBx细胞有4个MicroRNA表达上调,12个MicroRNA表达下调.结论 成功构建HBx基因及其缺失突变体(HBx-d382)的真核表达模型,该类病毒基因会影响L02肝细胞的MicroRNA表达谱.