靶向survivin的RNA干扰对裸鼠前列腺癌的影响

目的探讨利用RNA干扰技术在裸鼠体内抑制survivin基因表达并诱导前列腺癌细胞凋亡的作用。方法设计、构建靶向survivin的重组质粒载体并导入裸鼠皮下移植瘤,称量瘤重,计算抑瘤率,应用RT-PCR法检测survivin基因的干涉效率,TUNEL染色法技术检测细胞凋亡效果。结果PBSsi-survivin A和PBSsisurvivin B两种阳性表达载体转染组均具有显著低瘤重和高抑瘤率特点,两组均显著抑制了Survivin mRNA表达,并诱导前列腺癌细胞凋亡。结论RNAi可有效抑制前列腺癌PC-3细胞survivin基因mRNA表达,减缓肿瘤生长,并诱导细胞凋亡。     

DNA聚合酶θ对乳腺癌细胞株MCF-7放射敏感性的影响

目的 观察DNA聚合酶θ(POLQ)对人类乳腺癌细胞株MCF-7放射敏感性的影响.方法 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot法检测siRNA转染前后POLQ表达率的变化;利用噻唑蓝(MTT)比色法、平板克隆形成实验、流式细胞术对不同实验组进行分析.结果 POLQ-siRNA组细胞POLQ mRNA和POLQ蛋白表达量分别是空白对照组的(12.16±0.56)％和(32.01±0.65)％ (P＜0.01).转染后72 h,POLQ-siRNA组、空白对照组细胞吸光度(A)值分别为(0.76±0.02)和(0.81 ±0.02),POLQ-siRNA 组细胞增殖能力明显低于空白对照组(P＜0.01);平板克隆形成实验分析结果显示POLQ-siRNA组放射增敏比(SER)为1.24(＞1),表明转染POLQ-siRNA后MCF-7细胞放射敏感性显著增强.结论 抑制POLQ表达可以显著提高MCF-7细胞对放射的敏感性.     

雷公藤内酯醇对小鼠前列腺癌细胞株RM-1的影响

目的:探讨雷公藤内酯醇(TL)对前列腺癌细胞株RM-1增殖的影响,分析其抗前列腺癌细胞的作用机制。方法:MTT实验检测TL对RM-1细胞的增殖抑制;吖啶橙染色检测细胞形态学变化;FCM分析细胞周期及凋亡峰;DNA电泳分析细胞凋亡断裂带;RT-PCR检测RM-1细胞中caspase-3及bcl-2 mRNA表达。结果:MTT实验结果显示,TL(5、10、20、40、80ng/ml)处理后RM-1细胞生长抑制率分别为9.8%、25.1%、39.2%、48.8%、53.2%,以TL(10、20ng/ml)处理RM-1细胞12、24、36、48h后,细胞生长抑制率分别为8.4%、25.1%、36.1%、42.4%和10.2%、39.2%、50.2%、58.5%;经TL处理后吖啶橙染色观察发现,细胞核浓缩,细胞膜内陷、胞内有不规则橘黄色颗粒,呈凋亡样形态学改变;FCM检测显示TL(10、20ng/ml)作用RM-1细胞48h后,在G1期前出现明显的凋亡峰;TL处理RM-1细胞24、36、48h后,均可见DNA“梯形”条带;TL处理RM-1细胞caspase-3 mRNA表达高于未处理对照细胞(P<0.05),bcl-2 mRNA表达低于对照细胞(P<0.05)。结论:TL可抑制小鼠前列腺癌细胞株RM-1增殖,此作用是通过降低bcl-2、提高caspase-3表达诱导小鼠前列腺癌细胞凋亡来实现的。     

RNA干扰双位点抑制Survivin基因诱导雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞凋亡

目的研究采用RNA干扰技术抑制雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞中Survivin 基因的表达对PC-3细胞增殖及凋亡的影响。方法设计2条靶向Survivin mRNA的Survivin shRNA,克隆至同一质粒载体,并鉴定分析;质粒转染PC-3细胞,绘制细胞生长曲线;并于转染48 h 后进行Survivin基因蛋白表达及细胞凋亡检测。结果酶切鉴定、测序分析证实负载双片段Sur- vivin shRNA的质粒载体构建成功。转染PC-3细胞后,细胞生长曲线示实验组PC-3细胞增殖明显受抑制;转染后48 h．实验组、阴性对照组、空白对照组Survivin蛋白表达强度分别为(4．62± O．84)％、(38．83±7．96)％和(40．98±3．83)％,实验组与两对照组相比差异均有显著性意义(P< 0．05);转染48 h后PC-3细胞凋亡率开始增加。结论负载双片段Survivin shRNA的质粒载体转染PC-3细胞后能明显抑制PC-3细胞增殖,抑制PC-3细胞Survivin蛋白表达,并能诱导PC-3细胞凋亡。但诱导PC-3细胞凋亡最明显的时机需要进一步观察。     

RNA干扰技术沉默STAT3对人前列腺癌细胞生长的抑制作用

目的: 探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因表达对人前列腺癌细胞PC3及LNCaP的生长抑制作用。　方法: 针对STAT3mRNA序列设计合成 3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3重组质粒,转染PC3及LNCaP细胞;采用Western印迹、Northern印迹等技术观察重组质粒对STAT3基因表达的影响;用MTT法观察重组质粒对PC3及LNCaP细胞体外生长抑制作用;用流式细胞术(FCM)及吖啶橙染色检测重组质粒诱导细胞凋亡。　结果: 成功构建pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3重组质粒,并成功转染PC3及LNCaP细胞;Western印迹,Northern印迹结果证实重组质粒在mRNA及蛋白水平分别显著抑制STAT3基因表达,抑制率为60% ~75%;MTT及FCM结果证明上述重组质粒可显著抑制PC3及LNCaP细胞的体外生长并诱导PC3细胞凋亡。结论: pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3可抑制STAT3在人前列腺癌细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞的生长,促进其凋亡。     

RNA干扰对乳腺癌MCF7细胞株BCSG1基因表达的抑制作用

目的 观察RNA干扰(RNAi)对MCF7细胞株BCSG-1基因表达的抑制作用.方法 针对BCSG-1的已知cDNA序列,设计并体外转录合成4条特异性siRNA(BCSG-1-siRNA-1、BCSG-1-siRNA-2、BCSG-1-siRNA-3、BCSG-1-siRNA-4),1条非特异性siRNA,用脂质体介导转染MCF-7细胞48 h,同时设空白对照组(空脂质体)、正常MCF7对照组(不转染).采用免疫细胞化学及半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测7组细胞中BCSG-1蛋白及mRNA的表达,免疫细胞化学7组中BCSG-1蛋白表达分别为4.27±0.12、4.19±0.22、4.15±0.14、4.17±0.13、7.92±0.22、8.02±0.13、8.02±0.13;RT-PCR测7组细胞中BCSG-1 mRNA的表达分别为0.624±0.010、0.626±0.013、0.634±0.008、0.631±0.010、0.976±0.076、0.983±0.052、1.014±0.034.结果 7组中BCSG-1蛋白表达结果比较,差异有统计学意义(P＜0.01);mRNA的表达结果比较,差异有统计学意义(P＜0.01).与各对照组比较,BCSG-1-siRNA转染的4组细胞中BCSG-1蛋白及mRNA的表达均减弱,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 BCSG-1-siRNA能有效抑制乳腺癌MCF-7细胞中BCSG-1蛋白及mRNA的表达.     

RNA干扰对前列腺癌PC-3细胞血管内皮生长因子表达的研究

目的:构建前列腺癌血管内皮生长因子(VEGF)RNA干扰(RNAi)真核表达载体,并研究RNAi对前列腺癌VEGF表达的影响。方法:合成VEGFRNAi片段,将RNAi片段定向克隆于RNAi表达载体,测序鉴定;RNAi表达载体转染人前列腺癌PC-3细胞,Western印迹法检测VEGFRNAi表达载体对VEGF蛋白表达的影响,MTT法检测转染VEGFRNAi表达载体对细胞生长的抑制作用。结果:成功构建VEGFRNAi真核表达载体;VEGFRNAi组VEGF蛋白的表达明显降低,显著低于空载体组和未转染的对照组;前列腺癌PC-3细胞24、48、72h的生长抑制率分别为23.5%、33.5%、40.8%。结论:VEGFRNAi可以抑制前列腺癌PC-3细胞蛋白的表达和抑制细胞生长,为前列腺癌的生物治疗提供一定的实验基础。     

RNA干扰沉默酸性鞘磷脂酶1基因对人成纤维细胞凋亡的影响

目的为研发保护女性生殖细胞的小分子干扰RNA（siRNA）类药物,以人包皮成纤维细胞（HFF）为模型,检测靶向凋亡关键基因酸性鞘磷脂酶1（SMPD1）基因的siRNA对HFF凋亡的抑制作用。方法设计合成三对靶向SMPDI基因的siRNA并体外转染HFF细胞,转染后48h用丝裂霉素（MMC）诱导细胞凋亡。荧光定量逆转录-聚合酶链反应（O-RT-PCR）法及免疫印迹（Western blot）检测siRNA转染后SMPD1在mRNA水平和蛋白水平的变化,Annexin V—PI双染检测细胞凋亡率。用脂质体（lipofectamine 2000）和无干扰siRNA（NT siRNA）作为对照。结果siRNA1、2、3对SMPD1基因mRNA的抑制效率分别为（67．0±9．0）％、0％、（45．0±2．1）％,以siRNA1最高,蛋白水平的抑制也呈现相同变化。siR-NA1组细胞凋亡率为15．2％,明显低于MMC组（26．3％）。结论靶向SMPD1的siRNA可以抑制人包皮成纤维细胞凋亡。     

吉非替尼和靶向表皮生长因子受体小干扰RNA治疗前列腺癌

目的 观察吉非替尼(Gefitinib)和靶向表皮生长因子受体(EGFR)小干扰RNA(siRNA)体内外抑制前列腺癌的效果并探讨其作用机制.方法 前列腺癌细胞PC-3转染慢病毒为载体的EGFR siRNA或Gefitinib(0～10 ms/L)处理后,噻唑蓝(iT)比色法检测细胞生长抑制率,荧光聚合酶链反应(PCR)检测EGFR mRNA表达,Western blot检测EGFR、丝氨酸蛋白激酶(Akt)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶c(PKC)表达.体内观察EGFR siRNA和Gefitinib单独或联合抑瘤效果.结果 EGFR siRNA对PC-3细胞转染率达85%,细胞生长抑制率为40%～50%,而Gefitinib细胞生长抑制率呈浓度.时间依赖性.EGFR siRNA对PC-3细胞EGFR mRNA和蛋白表达抑制率＞90%,明显高于Gefitinib的＜80%(P＜0.01);EGFR siRNA显著抑制Akt和MAPK表达,而Gefifimb仅明显抑制Akt表达.Gefitnib单独和联合EGFR siRNA的抑瘤率分别为53.95%和59.28%,明显高于EGFR siRNA组的34.83%(P＜0.05).结论 EGFR通路抑制剂能有效抑制前列腺癌生长,其机制主要通过阻断EGFR及其胞内蛋白Akt的表达来实现.     

微小RNA-494过表达与RNA干扰抑制Survivin基因对前列腺癌移植瘤生长的比较

目的 比较过表达微小RNA (microRNA)-494与采用RNA干扰抑制前列腺癌PC-3细胞中Survivin基因的表达,对前列腺癌移植瘤生长的影响.方法 将过表达microRNA-494的腺病毒载体Ad-494及负载Survivin短发卡RNA (shRNA)腺病毒载体Ad-sur分别或联合感染PC-3细胞后,将相应PC-3细胞接种于裸鼠右前肢皮下,建立前列腺癌移植瘤模型.并以磷酸盐缓冲液(PBS)组及空载体组(Ad-GFP)作为对照.动态测量肿瘤体积.55 d后处死各组裸鼠,瘤体称重计算抑瘤率.Western blot检测肿瘤组织中Survivin表达变化.免疫组织化学测定Survivin、B淋巴细胞/白血病-2(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bax)及半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3表达变化.结果 Ad-sur组、Ad-494组、Ad-sur+ Ad-494组裸鼠前列腺癌移植瘤的生长明显被抑制.第35天时即表现差异.其中Ad-sur+ Ad-494组瘤体积最小,为(40.69±0.69) mm3,Ad-sur、Ad-494组瘤体体积分别为(102.11±5.32) mm3、(99.03±3.50) mm3,3组肿瘤体积均明显小于PBS组(572.72±10.46) mm3、Ad-GFP组(544.85 ±10.28) mm3(P＜0.05).但Ad-sur组与Ad-494组间瘤体大小差异无统计学意义(P＞0.05).55 d后,Ad-sur、Ad-494、Ad-sur+ Ad-494组对移植瘤抑制率分别64.62％、65.98％、86.67％,Ad-sur+ Ad-494组具有抑瘤增效的相加作用(Q=0.99).同对照组比较,实验各组的Survivin基因均表达下降,差异有统计学意义(P＜0.05).其中,Ad-494组与Ad-sur组间差异无统计学意义(P＞0.05),Ad-sur+ Ad-494组较Ad-494、Ad-sur组更为显著;实验各组中的bax、Caspase-3表达上调,bcl-2表达下调,且Ad-sur+ Ad-494组效果优于Ad-sur、Ad-494组.结论 过表达microRNA-494与RNA干扰方法均可抑制前列腺癌裸鼠移植瘤Survivin基因表达,从而抑制移植瘤的生长,且两者联合效果更加显著.     

沉默RelB表达诱导耐受性树突状细胞产生

目的 利用RelB短发卡RNA(shRNA)慢病毒转染树突状细胞(DC)诱导耐受性DC的产生.方法 将Lenti-RelB shRNA转染未成熟DC后,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测DC中RelB的表达;流式细胞仪检测DC凋亡以及表型分子人类主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅱ、CD80、CD86、CD83的表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测分泌的细胞因子白细胞介素(IL)-10、IL-12、转化生长因子-β1(TGF-β1)以及核因子(NF)-κB各亚基的DNA结合活性.结果 比较不成熟组、成熟组、空载体对照组DC 、Lenti-RelB shRNA-DC下调RelB的表达;而凋亡率同其余3组比较差异无统计学意义(P＞0.05);同时下调DC表型分子MHC-Ⅱ(0.34±0.04)、CD80(0.38±0.03)、CD86(0.17 ±0.02)、CD83(0.21 ±0.02)的表达;转染后的DC低表达IL-12[(96.3±32.8)ng/L],高表达IL-10[(218.2 ±43.3) ng/L];而RelB的DNA结合活性(0.28±0.06)较其他组显著下降,但其他亚基的DNA结合活性各组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用LentiRelB shRNA沉默RelB表达可体外诱导耐受性DC的产生.     

RNAi对前列腺癌细胞水通道蛋白-1的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默AQP1基因对前列腺癌PC-3细胞AQP1蛋白表达影响。方法设计合成针对前列腺癌PC-3细胞AQP1基因的小干扰RNA并构建高效表达载体,脂质体法转染PC-3细胞,Western Blot检测AQP1蛋白表达的变化。结果 AQP1在前列腺癌PC-3细胞表达,针对AQP1基因siRNA高效表达载体能够抑制AQP1蛋白在PC-3细胞的表达,AQP1蛋白相对表达量为：转染组0.54±0.04,正常对照组0.82±0.08,差异有显著性（P〈0.01）。结论通过抑制AQP1基因的表达,有效抑制了前列腺癌PC-3细胞AQP1蛋白表达。     

靶向环氧合酶-2的RNA干扰诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡

目的探讨靶向环氧合酶-2(COX-2)的RNA干扰(RNAi)对胃癌SGC-7901细胞增生和凋亡的影响。方法设计并合成6条COX-2小分子干扰RNA(siRNA)和1条阴性对照siR- NA,用TOPtranfection介导转染胃癌SGC7901细胞,荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测胃癌SGC7901细胞中COX-2基因和蛋白的表达,用流式细胞仪检测胃癌细胞凋亡情况,并与对照组进行比较。结果TOPtranfection能够有效介导COX-2 siRNA和阴性对照siRNA转染胃癌SGC7901细胞；TOPtranfection介导的COX-2 siRNA有效抑制了胃癌细胞COX-2 mRNA表达,与对照组相比抑制效率90．0%以上,最高达98．3%,同时抑制胃癌SGC7901细胞COX-2蛋白表达,与阴性对照组及对照组相比,COX-2蛋白抑制率分别为72．0%和72．1%。试验组、阴性对照组及对照组胃癌细胞凋亡率分别为：22．28±3．62、1．23±0．27和1．03±0．14。试验组与阴性对照组(t= 14．214,P＜0．01)和对照组(t=14．378,P＜0．01)比较,差异均具有统计学意义,阴性对照组与对照组比较(t=1．635,P＞0．05)差异无统计学意义。结论靶向COX2的RNA干扰能有效抑制胃癌细胞中COX-2基因和蛋白的表达,同时能明显增加胃癌细胞凋亡、抑制胃癌细胞增生。     

应用RNA干扰下调多药耐药蛋白4表达对结直肠癌细胞照射敏感性的影响

目的探讨多药耐药蛋白4（MRP4）表达对结直肠癌细胞照射敏感性的影响。方法应用慢病毒感染RNA干扰技术（RNAi）稳定下调人结直肠癌细胞株HCT116中MRP4的表达。将HCT116细胞分为未感染任何病毒的细胞株（CON）、加阴性对照病毒感染的细胞株（NC）和加RNAi靶点病毒感染的细胞株（KD）3组,应用实时定量RT-PCR和Western blot分别从RNA和蛋白水平检测MRP4表达变化,以验证RNAi的有效性。4Gy剂量照射后24h,流式细胞术检测细胞凋亡,MTT检测细胞增殖,比较RNAi后HCT116细胞株照射敏感性的差异。结果成功构建并转染慢病毒质粒,获得稳定沉默MRP4表达的HCT116-KD细胞株,HCT116-KD细胞株MRP4mRNA和蛋白表达水平较对照均明显下调（P〈0．05）。照射后24h,KD细胞株凋亡率为（71．7±0．8）％,明显高于CON组[（56．1±0．9）％]和NC组[（59．8±0．8）％]（P〈0．05）。照射后48h和72h,KD细胞增殖能力较对照组明显下降（火0．05）。结论MRP4在结直肠癌细胞中的表达水平与照射耐受显著相关,应用慢病毒感染RNA干扰下调MRP4表达可以增强结直肠癌细胞照射敏感性。MRP4有可能成为预测放疗敏感性的分子标志物。     

Characterization of PacMetUT1, a recently isolated human prostate cancer cell line

BACKGROUND: Existing prostate cancer cell lines have limitations. METHODS: Cells were characterized using Western blotting, immunohistochemistry, invasion into Matrigel, and by studying xenograft tumors. RESULTS: We describe a cell line (PacMetUT1) isolated from a lymph node of a 57-year-old male with prostate cancer. Compared to existing prostate cancer cell lines, the growth rate of PacMetUT1 xenograft tumors is slower with tumors occurring at injection sites and with metastases to lung and liver. Androgen receptor (AR) was detected in vivo by Western blotting and the cells responded to methyltrienolone (R1881). PacMetUT1 cells are more invasive in Matrigel than DU-145, PC-3, and LNCaP cells, and showed greater anchorage-independent growth in soft agar. The cells do not express prostate specific antigen (PSA) in vitro or in xenografts. However, the green fluorescent protein (GFP) gene was introduced and stably expressed in PacMetUT1 cells, allowing tumor imaging in vivo. Xenograft tumors show epithelial features and are positive for keratin, epithelial membrane antigen, EGF receptor, and E cadherin. In contrast, fibroblast markers vimentin, desmin, and Factor VIII, were negative. Karyotyping showed losses of 6p, 7q, 8p, 18q, and 22q, and gains of 8q and 9q; additional genetic material was observed at 2q and 12p. CONCLUSION: The PacMetUT1 cell line allows metastases to be assessed using a single animal model. Because of its slower growth, PacMetUT1 more closely mimics the human disease. Studies of tumor progression or metastasis can be conducted over a longer period of time.