人角膜缘干细胞的原代培养和生物学鉴别

目的 探讨人角膜缘干细胞（stem cell,SC)体外培养方法并观察其生物学活性。方法 应用消化培养法对人角膜缘组织进行原代培养,记录其生长特性。待细胞生长至80％汇合时,分别采用针对64KD角蛋白的AE5、针对一组酸性角蛋白的AE1单克隆抗体,抗增殖细胞核抗原单克隆抗体（anti-proliferatin cell nuclear antigen,PCNA),针对50KD烯醇酶特异的单克隆抗体4G 10．3,通过间接免疫荧光细胞化学染色对培养细胞进行鉴别。结果 人角膜缘组织应用消化培养法在6－7d达到80％汇合状态,应用间接免疫细胞化学染色,AE1、AE5染色,胞浆染色呈阳性。PCNA染色、细胞核染色阳性,4G 10．3亦可见阳性结果。结论 应用消化培养法可成功地对人角膜缘组织进行原代培养,培养后细胞既可保持角膜上皮特性,又含有具有强增殖潜力的原始细胞,适合用于临床移植治疗眼表疾病。     

角膜缘干细胞培养体系的研究进展

正常角膜上皮形态稳定和功能的维持是依靠角膜缘干细胞的不断增殖和移行来实现。近年来，角膜缘干细胞的重要作用逐渐被人们所认识。本文从角膜缘干细胞的定位、体外取材、分离培养、培养条件的选择、常用体外培养的载体、鉴别方法等对角膜缘干细胞培养体系进行综述。     

兔角膜缘干细胞的体外培养

目的 探寻兔角膜缘干细胞体外培养方法。方法 分别用20％小牛血清营养液和20％胎牛血清营养液兔角膜缘干细胞行体外培养，观察细胞贴壁生长情况；同时对生长良好的原代细胞进行消化传代，进一步观察传代细胞的形态和生长情况。结果 20％胎牛血清营养液组，角膜缘干细胞在培养48－72h有80％贴壁生长，7－10天形成良好单层，细胞呈圆形、卵圆形或多边形，类似角膜上皮细胞；传代培养细胞形态仍正常，生长良好，但混有成纤维细胞。20％小牛血清营养液培养72h，仅有20％细胞贴壁生长，且细胞形态极不规则，有细胞“拉网”现象，培养14天仍未形成单层。结论 角膜缘干细胞的培养较常规细胞培养难，需要特殊培养基。20％胎牛血清营养液能作为角膜缘干细胞培养的基础液。     

培养的角膜缘干细胞移植研究进展

由于传统治疗方法的局限性，培养的角膜缘干细胞移植成为近年来眼表疾病研究的核心内容之一。动物实验和基础临床研究证实，培养的角膜缘干细胞移植能有效恢复眼表正常结构，具有较多优越性，但仍有诸多问题亟待解决。本就其近年的进展进行综述。     

人角膜缘干细胞体外培养后生物学特性的变化

目的 探讨人角膜缘干细胞体外培养后细胞形态学，抗原性和增殖能力的变化。方法 消化培养法体外培养人角膜缘干细胞。获得细胞单层并观察细胞形态学变化。利用间接免疫荧光组化检测人角膜缘组织HLA-DR抗原在培养前，后的变化，检测培养后细胞增殖核抗原和角膜上皮64KD角蛋白的表达。结果 原代细胞在培养1周形成单层细胞形态以圆柱状细胞为主，培养前角膜缘上皮下少星HLA-DR抗原分布，培养后单层细胞DR抗原表达阴性；单层细胞中多量，散在分布的增殖细胞核抗原阳性细胞，并且部分细胞表达64KD角蛋白，结论 角膜缘干细胞体外培养后分化为角膜上皮，不表达HLA-DR抗原，介仍保持较强的分裂增殖能力，可能是临床移植治疗干细胞缺乏眼表疾病患者的一种有效手段。     

角膜干细胞和角膜缘缺陷症

本文总结了近年来国内外有关角膜干细胞的概念，组织学鉴定、细胞生物学特征、增殖调节以及由于角膜缘功能障碍导致角膜干细胞丧失后引起的角膜缘缺陷症及其临床表现，对认识干细胞在角膜疾病中的重要作用具有一定意义。     

角膜缘干细胞标志物

角膜缘干细胞是角膜上皮再生的源泉,属成体干细胞,有其独特的生物学特性.角膜缘干细胞标志物的确立,对于建立规范的角膜缘干细胞分离纯化和培养方法、进一步研究其生物学特性起着决定性的作用.通过查阅国内外文献资料,对角膜缘干细胞标志物的最新研究进展作一综述.     

角膜缘干细胞不同载体培养的研究进展

角膜缘干细胞缺乏所致眼表疾病已成为重要的致盲角膜病之一,而体外培养的角膜缘干细胞移植是治疗眼表疾病的重要途径。其中载体的选择是成功的关键。本文将从不同载体的生物特性,用于培养干细胞的可行性及优缺点等方面,阐述选择合适的载体培养角膜缘干细胞的研究进展。     

角膜缘干细胞培养后移植的研究进展

眼表的许多疾病都是由于角膜缘干细胞功能障碍引起，角膜缘干细胞培养后移植是治疗角膜缘干细胞功能障碍的有效手段。本文将对培养的角膜缘干细胞移植的材料，角膜缘干细胞培养后自体和异体移植以及移植术后的处理等方面的研究作一简要综述。     

角膜缘干细胞缺乏的临床诊疗

许多严重的眼表疾病与角膜缘干细胞缺乏相关:先天性无虹膜症、眼表烧伤、接触镜相关眼病、眼表多次手术、长期局部滴眼剂损伤和各种眼表自身免疫性疾病等都将因角膜缘干细胞缺乏导致角膜结膜化或血管化而致盲。本文对角膜缘干细胞缺乏的诊疗原则作一系统介绍,着重讨论角膜缘干细胞移植术的多种术式和术后处理。     

供体因素对人角膜缘干细胞培养影响的研究

目的观察供体年龄及角膜新鲜程度对人角膜缘干细胞体外培养的影响。方法168例人角膜，按年龄分为A、B、C三组：按供体死亡至被培养的时间分为新鲜组和陈旧组。采用组织块培养法进行细胞培养，观察各组细胞开始生长时间及培养生长率。结果细胞开始生长时间及培养生长率在不同年龄组之间差异无显著性意义；但在较新鲜组与陈旧组之间差异有显著性意义；组织越新鲜，细胞生长越快，生长率越高。结论选取较新鲜的供体(≤8天)进行培养可获得好的培养效果，而不需过多考虑年龄因素。     

角膜缘干细胞克隆化培养影响因素的研究

目的探讨丝裂霉素C处理Swiss3T3成纤维细胞作为饲细胞的条件,了解兔角膜缘干细胞克隆化培养的增殖状况。设计对照实验研究。研究对象兔角膜缘干细胞单纯培养组,兔角膜缘干细胞与Swiss3T3成纤维细胞作为饲细胞的混合培养组。方法采用DMEM/F12培养基进行细胞培养,观察4.0μg/ml丝裂霉素C作用不同时间后3T3细胞数量的变化。DispaseⅡ酶消化兔角膜缘上皮细胞,与饲细胞混合接种,观察干细胞克隆形成情况,比较各代、各组的细胞克隆形成率(CFE)。用EDTA去除饲细胞,间接免疫荧光染色检测角膜缘干细胞克隆团表达增殖细胞核抗原(PCNA)情况。主要指标细胞数/毫升,细胞克隆形成率。结果4.0μg/ml丝裂霉素C处理2.5小时的Swiss3T3细胞,培养期间(约12日)细胞数量无明显变化,可作为饲细胞。与饲细胞共同培养的兔角膜缘干细胞形成细胞克隆团,细胞的平均CFE比较:有饲细胞组角膜缘干细胞明显高于无饲细胞组(t=2.982,P<0.01)。兔角膜缘干细胞冻存复苏后平均CFE比较,有饲细胞组明显高于无饲细胞组(t=3.007,P<0.01)。兔角膜缘干细胞克隆团中细胞PCNA染色为阳性。结论角膜缘干细胞与作为饲细胞的Swiss3T3成纤维细胞共同培养形成细胞克隆,其中含有干细胞,且具有高增殖力。     

低温冷冻对角膜缘干细胞生物学特性的影响

目的 评价低温冷冻保存对体外培养兔角膜缘干细胞生物学特性的影响.设计实验研究.研究对象新西兰白兔.方法 新西兰白兔20只（40眼）,制备2 mm周边角膜和2 mm球结膜的环形浅层角膜缘植片,待形成细胞单层后,将培养的细胞低温冻存1个月,然后复苏培养.将未冻存的细胞和冻存复苏后的细胞采用免疫细胞荧光染色、流式细胞仪检测,鉴定培养细胞的生物学特性,通过倒置显微镜、MTT比色法比较传代培养的角膜缘干细胞低温保存前后的形态结构和特性.主要指标角膜缘干细胞活性及生物学特性.结果 显微镜下观察冻存复苏后的细胞,与未冻存细胞相比,细胞状态差,贴壁时间晚,核浆比变小,形态不规则;免疫荧光细胞染色检测ABCG2单克隆抗体阳性率未冻存细胞为81.7%,低温冻存细胞降至46.9%,差异有统计学意义（P〈0.05）;流式细胞仪检测低温冻存细胞与未冻存细胞角膜缘干细胞占总细胞的比例分别为0.90%和2.43%,差异有统计学意义（P〈0.05）;MTT法检测低温冻存的细胞比未冻存细胞增殖活性降低,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 低温冻存后角膜缘干细胞的活性和生物学特性均受到严重影响,其冻存方法和复苏技术有待进一步改进.     

兔角膜缘干细胞体外壳聚糖共混膜上培养的形态学观察

目的 探讨壳聚糖作为兔角膜缘干细胞体外培养载体的可行性。方法 应用消化培养法在壳聚糖材料上对兔角膜缘细胞进行原代培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，并在电子显微镜下观察壳聚糖的结构以及第7d时细胞的形态。结果 壳聚糖呈现三维多孔结构相互连接成网状，孔径直径大小约90μm，其上有细胞生长，7d左右形成单层次，9d后细胞培养开始出现老化现象。结论 壳聚糖上可成功地对兔角膜缘组织进行原代培养，可用作组织工程角膜的载体材料。     

角膜缘干细胞标志物的研究进展

角膜缘干细胞(LSCs)通过不断地增殖分化维持着角膜上皮的完整性和内稳态,对保护角膜和维持角膜透明性起着重要的作用。角膜缘干细胞缺乏症(LSCD)是目前角膜疾病致盲的主要原因之一,LSCs移植是治疗的热点。移植的有效性主要取决于LSCs占移植细胞总数的比例,因此明确识别LSCs至关重要。虽然LSCs标志物有很多,但它们的特异性备受争议,故LSCs移植的主要挑战之一是缺乏明确的细胞标记物。本文将对LSCs标志物的最新研究进展做一综述。     

Ex vivo expansion of limbal epithelial stem cells: amniotic membrane serving as a stem cell niche

Identification, maintenance, and expansion of stem cells for subsequent transplantation has become a new strategy for treating many diseases in most medical subspecialties. The stem cells of the corneal epithelium are located in the limbal basal layer and are the ultimate source for constant corneal epithelial renewal. Like those in other tissues, limbal stem cells are supported by a unique stromal microenvironment called the stem cell niche, which consists of certain extracellular matrix components, cell membrane-associated molecules, and cytokine dialogues. Destructive loss of limbal stem cells or dysfunction of their stromal environment renders many corneas with a clinical entity called limbal stem cell deficiency, which is characterized by variable extents of conjunctival ingrowth depending on the severity of limbal damage. A new strategy of treating limbal stem cell deficiency is to transplant a bio-engineered graft by expanding limbal epithelial stem cells ex vivo on amniotic membrane. This review summarizes the published literature data collectively explaining how amniotic membrane is an ideal biological substrate that can help maintain and support the expansion of limbal epithelial stem cells.     

角膜缘干细胞和生物羊膜移植治疗翼状胬肉

目的观察角膜缘干细胞移植和生物羊膜移植治疗翼状胬肉的临床疗效。方法将58例（66眼）随机分为2组,分别采用角膜缘干细胞移植32例（36眼）和生物羊膜移植26例（30眼）,术后随访6个月～2年。结果角膜缘干细胞移植组复发1眼,复发率2．78％,生物羊膜移植组复发7眼,复发率23．33％。两组比较差异有统计学意义。角膜创面愈合时间：角膜缘干细胞组1～3d,平均为（1．85±0．95）d,生物羊膜组2～5d,平均为（3．36±1．65）d。结论带角膜缘干细胞移植和生物羊膜移植术治疗翼状胬肉都能取得良好效果,但带角膜缘干细胞移植比生物羊膜移植角膜创面修复快,复发率低。