A型流感病毒HA(H1N1)基因真核表达载体的构建及序列分析

[目的]构建A型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因真核表达载体,研究其作为DNA疫苗的免疫效果。[方法]从流感病人体内分离流感病毒(A/Guangdong/376/2001/H1N1),提取RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增HA基因,先将其克隆到pMD18-T Vector,进行序列测定和分析;然后将HA基因亚克隆到真核表达载体(pCI-neo),进行鉴定。[结果]获得一个核苷酸长度为1698bp的基因,编码565个氨基酸;同源性比较结果表明:和A/Hong Kong/1131/98(GenBank/NCBI:AF386775)有98％同源,序列分析表明有10个氨基酸出现变异;酶切和序列测定表明HA基因正确插入pCI-neo载体(HA-pCIN)。[结论]HA基因真核表达载体的成功构建,可以进一步研究其免疫功能。     

流感病毒A HA(H3N2)基因真核表达载体的构建及序列分析

目的：获得血凝素基因（HA）基因，将其克隆到真核表达载体，为研究流感DNA疫苗奠定基础。方法：从当年流感病人体内分离病毒（A／Guangdong/448/2001)，鉴定型别（H3N2）后，提取RNA，用特异引物进行RT－PCR,扩增HA，并将其克隆到pMD18-T Vector，进行序列测定和分析；然后将HA基因亚克隆到真核表达载体（pCI-neo)，进行鉴定。结果：获得一个核苷酸长度为1698bp的基因，编码565个氨基酸；与A／Beijing/32/92(Genbank/NCBI:U26830)基因序列有98％同源，有15个碱基和／或10个氨基酸出现变异，且在212缺失一个氨基酸V；酶切和序列测定表明HA基因正确插入pCI-neo载体（HA－pCIN)。结论：成功构建了HA基因真核表达载体，可以进一步研究其免疫功能。     

A型流感病毒M基因DNA疫苗载体构建及免疫性研究

目的构建A型流感病毒M基因DNA疫苗质粒载体并对免疫后小鼠体内免疫应答反应进行分析和评价。方法将H3N2亚型流感病毒M基因通过RT-PCR扩增后克隆构建DNA疫苗载体pBudCE4．1-M,并将pBudCE4．1-M质粒体外瞬时转染COS7细胞并通过Western blot鉴定M1蛋白的表达,然后将pBudCE4．1-M质粒免疫小鼠。通过EUSA对小鼠体内生成的M1蛋白IgG抗体进行鉴定。结果M基因被成功克隆到质粒载体pBudCE4．1上,并在体外COS7细胞中表达出28kD的M1蛋白。疫苗质粒免疫小鼠后4周,在小鼠血清中检测到M1蛋白kG抗体的吸光度有明显升高。结论成功构建了一种A型流感病毒M基因DNA疫苗载体,将其免疫小鼠后成功诱导小鼠体内产生了特异性的IgG抗体。     

甲型流感病毒DNA疫苗双表达载体的构建及表达

目的： 构建含有甲型流感病毒M2基因与GM-CSF基因的DNA疫苗双表达载体,为研究甲型通用流感疫苗奠定基础。方法： 将甲型流感病毒（H1N1）接种鸡胚后收获尿囊液,提取流感病毒总RNA,RT-PCR法扩增M2基因;将微小病毒内部核糖体进入位点（IRES）基因插入到质粒pVAXⅠ多克隆位点,再将M2基因和GM-CSF基因依次克隆到IRES的上、下游多克隆位点,构建出甲型流感病毒双表达载体pMIG,酶切鉴定后测序;脂质体法转染COS7细胞并检测目的蛋白的表达。结果： 成功扩增出M2基因（约300 bp）、IRES基因(约580 bp)和GM-CSF基因(约400 bp),酶切鉴定结果表明构建出甲型流感病毒双表达载体pMIG,Western blotting检测证明流感病毒M2蛋白的表达。结论：成功构建出流感病毒DNA疫苗双表达载体pMIG。     

2004-2005年宁夏A(H1N1)亚型流感病毒基因特性研究

目的了解宁夏流行的A(H1N1)亚型流感病毒血凝素基因变异情况。方法对分离的A(H1N1)亚型毒株随机选取5株进行血凝素基因HA1区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后进行基因进化特性分析。结果HA1区核苷酸序列和氨基酸序列分析表明,宁夏2004年分离到的A(H1N1)亚型流感病毒株有以下位点发生变异,35 D>N、152 G>R、182 P>S、221 D>G,其中152、221位氨基酸位于抗原决定簇;2005年分离到的A(H1N1)亚型流感病毒株有以下位点发生变异,82 T>K、94 Y>H、119 K>N、145 R>K、165 V>A、208 R>K、251W>R、266 T>N,其中165位氨基酸位于抗原决定簇。结论宁夏2004-2005年分离的A(H lN1)亚型流感毒株基因特性和抗原性已开始发生变异。     

2004年宁波大学流感爆发病毒株的血凝素基因分析

目的了解宁波地区流行性感冒(流感)病毒株的变异情况。方法采集2004年5月宁波大学流感爆发期间病人的含漱液进行病毒分离、鉴定，并对其中1株病毒的血凝素重链区进行了核苷酸和氨基酸序列分析。结果在9份样品中共分离到流感病毒3株，经血清学试验鉴定为甲3型。与2002年宁波市流感病毒流行株的核苷酸同源性为98．2％-98．3％，氨基酸同源性为96．7％-97．3％；与2003年流行株的核苷酸同源性为98．7％，氨基酸同源性为97．6％；与参考株A／Sydney／05／1997的核苷酸同源性为95．9％，氨基酸同源性为92．7％；与参考株A／Wuhan／359／1995的核苷酸同源性为94．6％，氨基酸同源性为91．2％。结论2004年宁波大学流感爆发的病毒为甲3型。其HA1区序列更接近2003年流行毒株，与A／Sydney／05／1997毒株的同源性要高于A／Wuhan／359／1995。该爆发流行的毒株可能是在宁波以前流行毒株的基础上进化而来的。     

福州2009-2014年甲型H1N1流感病毒株HA基因进化分析

目的:分析福州地区2009-2014年甲型H1N1流感病毒株的HA基因序列和遗传特征。方法:采集流感样病例的咽拭子标本,用MDCK细胞培养法和Real-time RT-PCR法对6株分别来自2009-2014年的病毒株进行病毒分离、鉴定,HA基因片段通过RT-PCR法进行扩增后克隆到p MD18-T载体上,并测定6株病毒株的HA基因序列。通过生物软件Bio Edit对该分离株和Gen Bank中相关毒株的序列进行基因进化树分析。结果:6株分离株的HA基因推导氨基酸序列与参考株A/California/04/2009相比,2009-2014年HA1区氨基酸发生了突变,主要是位于136、145、188、189、192和193位点。结论:近几年,福州地区H1N1流感的HA基因序列与世界流行的病毒参考株具有高度同源性,并多处氨基酸发生替换而产生抗原性漂移。     

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达

目的:构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体。体外转染真核细胞株HEK293细胞并检测目的蛋白的表达。方法:从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到HEK293细胞中,通过免疫荧光技术鉴定其表达。结果:经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。免疫荧光技术证实流感病毒M2基因的表达。结论:甲型流感病毒M2蛋白是一种具有高保守性,可形成离子通道并影响流感病毒表面蛋白血凝素(HA)天然构象的形成,被认为是具有交叉免疫保护性的结构蛋白。甲型流感病毒M2基因真核表达质粒的构建及成功表达将为甲型流感病毒基因工程疫苗,通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。     

Victoria系乙型流感病毒HA1基因变异特征分析

目的阐明2012年邯郸市分离的Victoria系乙型流感毒株HA1抗原性和基因变异特征。方法对2012-2013年分离的流感病毒采用RT-PCR方法特异性扩增HA1基因,扩增产物进行核苷酸序列测定,用DNAStar中Megalign软件进行比对分析,构建系统进化树。结果邯郸市2012年分离的Victoria系乙型流感病毒与WHO推荐的2009-2012年北半球代表株相比,核苷酸同源性为98.1%-99.2%,氨基酸同源性为98.2%-99.4%。HA1区未发生氨基酸丢失和插入,与B/Brisbane/60/2008相比2个位点氨基酸替换具有共性（146I〉V和197D〉N）,而这2个位点与2006-2008年疫苗株B/Malaysia/2506/04相同。与B/Brisbane/60/2008相比7个毒株中有2个毒株发生了另外4个位点（58L〉P、129N〉S、171N〉D和174G〉E）的替换。结论 2012年邯郸市分离的Victoria系乙型流感病毒血凝素蛋白未发生明显的抗原性改变,与WHO推荐的2011-2012年的流感疫苗株B/Brisbane/60/2008匹配,不属于Victoria系乙型流感病毒新变种。     

PTEN基因真核表达载体重组质粒的构建及序列测定

目的 构建编码肿瘤抑制基因PTEN的正义与反义真核表达重组载体并进行其序列测定．方法 新鲜胎盘组织抽提基因组RNA；根据基因库PTEN基因序列分别设计合成三对反义引物及一对正义引物，采用RT-PCR法扩增编码PTEN的基因片段；将PTEN基因定向克隆到pcDNA3．1／Hygro(—)真核表达载体，筛选阳性重组子并鉴定；对重组子进行序列测定。结果RT-PCR所扩增的PTEN基因片段为241，239，227bp(反义)及1209bp(正义)，表明所克隆的基因为编码PTEN的基因片段。结论 成功构建编码肿瘤抑制基因PTEN的pcDNA3．1／Hygro(—)真核表达质较pcDNA3．1／Hygro(—)PTEN。     

2009年成都市流感活动情况及H3N2亚型流感病毒HA1基因特性分析

目的 分析2009年成都市流感流行情况,探讨甲3流感病毒(H3N2)亚型分离毒株的流行及HA1基因变异和进化.方法 MDCK细胞对咽拭子样品进行病毒分离鉴定,提取病毒核酸,用RT-PCR法扩增HA1基因,对H3N2分离株核酸及氨基酸序列进行亲缘关系分析.结果 甲型流感H1N1、H3N2、甲1、B型流感病毒分离率分别为2...     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建

目的：构建HCV NS5A/pCI-neo真核表达载体,转染Huh-7细胞系,为体外高效表达NS5A蛋白奠定基础。方法：用PCR方法从带有丙型肝炎病毒NS5A基因的pC DNA 3.1（+）/HCV NS345质粒中扩增出HCV NS5A基因,然后TA克隆于pGEM-T载体中,转化大肠杆菌JM109。阳性克隆经测序鉴定,再经双酶切消化后插入真核表达载体pCI-neo上,经酶切鉴定与测序证实。结果：用PCR方法扩增出HCV NS5A基因全序列,因其 cDNA的G+C含量高直接测序未成功,后经TA克隆,筛选得到的阳性克隆经测序鉴定,与设计的HCV NS5A基因序列完全一致。经酶切连接并成功插入pCI-neo上。结论：成功构建了高效表达丙型肝炎病毒NS5A基因的pCI-neo真核表达载体。     

甲型流感病毒血凝素基因HA和HA1真核载体的构建及其表达研究

目的构建甲型流感病毒A／PR／8／34（H1N1）血凝素基因HA和HA1真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法利用RT-PCR技术克隆流感病毒株血凝素HA和HA1基因片段并插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。经酶切、PCR和测序鉴定后用PolyFect脂质体转入HEK293细胞,通过免疫荧光技术检测其瞬时表达。结果血凝素基因HA和HA1的真核表达载体构建成功。转染后免疫荧光技术检测显示两者皆可在HEK293细胞中正确表达。结论成功构建的流感病毒HA和HA1真核表达载体为深入研究病毒的作用机制及核酸疫苗的研究莫定了基础。     

插入CpG序列和IL—2基因的HBV重组真核表达载体的构建

目的：构建插入CpG序列和IL-2基因的HBV重组真核表达载体。方法：采用PCR产物直接克隆方法,构建了编码HBsAg基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1^ -HBsAg;并以此为基础通过重组DNA技术分别构建了在不同位置含不同数目的CpG序列的重组质粒pcDNA3.1^ -S/CpG1、pcDNA3.1^ -S/CpG2、pcDNA3.1^ -S/CpG1 CpG2及IL-2和HBsAg融合基因的表达载体pcDNA3.1^ -S/IL-2。通过脂质体基因转移技术导入Cos-7细胞中检测其瞬间表达。结果：通过酶切、PCR及测序证实已分别正确完整地插入IL-2基因和CpG序列,体外转染Cos-7细胞后可见基因的表达和分泌,结论：本实验成功构建了我们所设计的5种重组质粒,拟为今后探索优化基因疫苗的设计及HBV治疗性疫苗的研究奠定基础。     

乙肝病毒抗原基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)相关抗原基因真核表达载体,检测各抗原基因在体外真核细胞中的表达情况.方法:以含有1.3倍的HBV全基因组序列的质粒PcDNA3.1-HBV为模板,PCR扩增HBV的各抗原基因片段,通过连接至中间克隆载体Peasy-T1-Simple,酶切及测序鉴定正确后,...     

MAGE-E1a荧光真核表达载体的构建

目的：构建MAGE-Ela与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体，为研究肿瘤疫苗中树突状细胞的作用奠定基础．方法：应用基因重组技术，将反转录PCR得到的MAGE-Ela基因克隆入荧光真核表达载体pEGFP-N3中，用含卡那霉素LB培养基平板筛选转化菌，阳性重组子经SalⅠ和KpnⅠ双酶切分析、PCR鉴定．结果：MAGE-Ela基因成功地亚克隆至真核表达载体pEGFP-N3中，获得MAGE-E1a／pEGEP-N3重组质粒．结论：MAGE-E1a基因克隆入pEGFP-N3质粒，成功构建MAGE-E1a／pEGFP-N3荧光真核表达载体，解决了MAGE-E1a基因转染的定位问题，为研究肿瘤疫苗奠定了基础。     

1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载体片段经小牛碱性磷酸酶去磷酸化后,用T4 DNA连接酶将tat基因与pSecTag2B载体片段连接过夜并转化感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性克隆质粒进行Hind III酶切鉴定,并利用Nco I酶切鉴定克隆的tat基因反向。最后选取正向tat基因克隆质粒送基因测序。结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上约320bp位置出现条带,与预期的324bp大小一致;经Hind III和Nco I分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源。结论本研究方法可以成功地构建HIV-1 tat基因分泌型真核表达载体。     

登革2型病毒全长NS1基因真核表达载体的构建及序列分析

目的克隆登革2型病毒(DEN2)全长NS1基因，构建NS1基因的真核表达重组质粒。方法用RT—PCR技术扩增DEN2(NGC株)全长的NSl基因序列，并定向克隆入pPICZαB的KpnⅠ／XbalⅠ位点，构建真核表达载体pPICZαB—NS1，转化E.coli DH5a菌。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。结果阳性质粒经PCR及KpnⅠ／XbaⅠ双酶切获得了一个核苷酸长度为1134bp的基因；序列测定证实该基因与DEN2(NGC株AF038403)NS1基因序列有99％同源。结论成功构建了含有DEN2全长NS1基因的真核表达载体DPICZαB—NS1，为NS1的进一步酵母表达奠定了良好的基础。     

人CD154基因绿色荧光真核表达载体的构建

目的构建携人CD154基因的重组真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFPN3-CD154。方法体外PHA激活人外周血单个核细胞，提取总RNA，用RT-PCR技术扩增人CD154cDNA全长开放阅读框序列，T-A克隆至pGEM—TEasy载体，再定向克隆至增强型绿色荧光蛋白载体pEGFP-N3，重组质粒pEGFP-N3-CD154用限制性内切酶酶切鉴定，通用鉴定引物PCR扩增鉴定，并进行DNA序列分析。结果多种鉴定方法证实了重组载体中的CD154基因序列与已知的序列一致。结论成功构建了携带人CD154基因的重组的增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N3-CD154，为进一步研究人CD154基因转染细胞在肿瘤免疫治疗中的生物学意义提供初步的实验基础。     

全球甲型流感病毒H5A1序列的分子进化研究

目的应用生物信息学数据库和工具,对现有的H5亚型甲型流感病毒全球分离株的H5A1抗原序列进化规律进行研究。方法下载NCBI Genbank和美国洛斯阿莫斯国家实验室流感病毒数据库中全部的甲型流感病毒H5A1序列,采用快速极大似然法绘制进化树,并用SRDT模型估计各分枝的进化速度与出现时间。结果H5A1序列的进化树可被分为两个各自独立进化的世系:美洲世系和欧/亚世系,它们在地域分布、序列位点等方面区别明显,且可被进一步细分为几大进化枝,野生禽类分枝和家禽株系分枝的进化速度存在明显差异,所有的人及其他哺乳动物感染株系则均来自于欧/亚世系的亚洲禽/人分枝。结论H5A1序列在野生禽类中已达到相对稳定的状态,其自然变异速度为(1.990~2.535)×10-3/位点/年,而家禽中的高毒力变异株进化速度明显加快。目前威胁人类的主要是1996年之后出现的亚洲变异株,且进化树结构提示该株系出现过多次禽/人跨宿主传播事件,值得对其位点特征进行深入研究。