BRCA2基因启动子的克隆和分析

目的构建BRCA2基因启动子的荧光素酶报告质粒,为BRCA2基因调控研究提供基础。方法采用高保真Taq聚合酶,从正常人外周血中扩增出BRCA2启动子并将其插入质粒中。通过基于PCR的定点突变方法在多态性位点rs3092989(-254A/G)获得含-254G等位基因的序列。亚克隆BRCA2启动子片段至pGL3-basic报告基因载体中,构建含BRCA2启动子的重组报告质粒。转染HeLa细胞,评价启动子活性以及-254A/G多态性位点对活性的影响。结果酶切和直接测序法证实所构建质粒含有pGL3-basic及BRCA2基因启动子序列,扩增的含-254A和-254G的BRCA2启动子序列正确。构建的报告基因具有启动子活性,与pGL3-basic质粒相比较,BRCA2启动子的相对荧光单位增加了413倍。rs3092989(-254A/G)多态位点未明显影响启动子活性。结论 BRCA2转录起始位点上游序列具有较强的启动子活性。成功克隆BRCA2启动子并引入相关突变,可为后续的基因转录调控研究奠定基础。     

一例ABO血型系统B抗原减弱表达的分子机制

目的 研究1例B抗原减弱献血者的血清学特性和抗原减弱的分子机制.方法 应用单克隆抗体检测献血者红细胞ABO血型抗原,标准A、B、O红细胞检测其血清中的ABO抗体,并检测其血清转移酶活性.采用聚合酶链反应技术扩增ABO基因全部外显子序列和5′端非编码区序列并进行测序分析,应用逆转录-PCR和克隆测序技术分析献血者ABO cDNA转录剪接情况,采用重亚硫酸盐转化直接测序法分析ABO基因启动子区CpG岛甲基化水平.结果 献血者血清学表现为B抗原明显减弱,血清中无抗-B抗体,B转移酶活性降低.基因型为B101/O01,全部外显子序列和拼接接受位点碱基无任何突变.5′端非编码区序列多态性符合B101/O01的特征,启动子、增强子、负调控序列和微卫星重复序列未发现异常.献血者存在ABO基因全长cDNA转录本,未发现新的转录剪接体.与正常对照标本比较,在启动子区CpG岛内发现启动子附近有多个特异性半甲基化位点.结论 启动子区CpG岛中的甲基化位点可能是引起B抗原弱表达的原因.     

真核生物RNA聚合酶Ⅱ启动子的计算机预测

启动子是基因组序列中靠近基因转录起始位点的区域,是影响基因表达的重要功能单位之 一。除实验方法发现或验证序列的启动子外,现已经有多种启动子序列的计算机预测方法,如位点比重 阵列(PWM)、隐马尔柯夫模型(HMM)、神经网络、低聚复合物和CpG岛等。本文综述了现有真核生物基 因启动子序列的生物信息研究技术。     

组织特异性转录调控序列及在肿瘤基因治疗研究中的应用

肿瘤特征性蛋白“持家基因”转录调控序列是肿瘤细胞内特异活化的基因调控离列，可使外源基因在肿瘤细胞中特征性地表达。本文综述了普通启动子及组织特异性启动子的基本结构与洋调控因子对启动子的调节以及目前在肿瘤基因治疗研究领域中的应用价值的人酪氨酸酶（Ｔｙｒ）启动了，甲胎蛋白（ＡＦＰ）启动子，癌胚抗原（ＣＥＡ）启动子等的研究进展。     

干扰素刺激反应元件Ⅰ/Ⅱ在维甲酸诱导基因G表达调控中的作用

目的 深入研究维甲酸诱导基因G(retinoic acid-induced gene G,RIG-G)启动子上所含的干扰素刺激反应元件(interferon-stimulated response elements,ISRE)对RIG-G基因表达的调控作用.方法 根据RIG-G基因启动子所包含的ISRE序列,利用定点突变技术分别构建野生型和位点突变型的报告基因质粒,然后采用报告基因转染实验检测RIG-G基因启动子中ISRE序列的功能活性.结果 研究发现单独突变RIG-G基因启动子上的ISRE Ⅱ元件不影响报告基因的表达,而单独突变ISRE Ⅰ则会对报告基因的表达产生明显的抑制作用;同时突变ISRE Ⅰ和ISRE Ⅱ元件则会使报告基因完全失去对转录因子的反应性.结论 RIG-G基因启动子所包含的ISRE Ⅰ和ISRE Ⅱ元件是诱导该基因表达的转录因子复合物的作用位点,是该基因表达的分子基础,且ISRE Ⅰ元件的作用要优先于ISRE Ⅱ.     

广东省SARS流行株M基因序列分析

目的：测定广东省不同流行时期13份SARS病毒(SARS CoV)标本的M基因序列，通过分析该基因序列的变异情况，初步了解广东省SARS病毒在流行过程中是否发生了变异。方法：提取病毒RNA，用M基因特异引物进行RT-PCR，将产物纯化后直接测定核苷酸序列。结果：13份标本M基因核苷酸序列同源性很高，为99．7％～100％，M基因核苷酸序列只在2个位点(80和203位)发生变异，1株80位点的变化引起编码的氨基酸从苯丙氨酸(F)变为半胱氨酸(C)，3株203位变化为无义突变。结论：M基因核苷酸序列变异不大，初期和后期M基因核苷酸序列与流行高峰期的毒株相差1个碱基，但氨基酸序列相同；从香港感染病人分离的1株病毒M基因与广东本地感染分离株存在1个氨基酸的差异。     

新基因功能预测的理论及方法

随着生命科学的发展,人类基因组计划的完成,有关核酸、蛋白质的序列和结构数据呈指数增长。面对巨大而复杂的数据,生物信息学得到蓬勃发展,使得利用生物信息学和电子技术(互联网技术)寻找并克隆新的未知功能的基因成为可能。着重于技术和操作层面,利用生物信息学对新基因进行电子克隆,及克隆该新基因的序列后对其进行简单的功能分析,如基因的编码区、启动子区、内含子/外显子、翻译启始位点和翻译终止信号预测,基因的同源比对,编码的氨基酸辨识蛋白质,蛋白质的物理性质,蛋白质的二级/三级结构、特殊局部结构以及功能预测等。     

SLC2A4基因启动子区rs5418位点变异对基因表达的影响

目的: 研究葡萄糖转运蛋白4(SLC2A4)基因启动子区rs5418多态位点G→A变异对基因表达的影响。方法: PCR法扩增SLC2A4基因核心启动子区序列。采用基因重组、定点突变等技术,构建rs5418位点含有不同等位基因的SLC2A4基因启动子重组表达载体。脂质体转染法将重组质粒转入HEK293T细胞,采用双萤光素酶报告系统,观察携带不同等位基因的重组质粒中下游报告基因的表达活性。结果: PCR扩增获得长度为716 bp的SLC2A4基因核心启动子序列,成功构建pGL3-SLC2A4-prom(A)和pGL3-SLC2A4-prom(G)重组表达载体。双萤光素酶报告基因活性检测结果显示,携带A等位基因的载体启动下游报告基因表达的相对活性(19.49±4.41)比携带G等位基因的载体(13.04±4.45)强,两者存在显著差异(P<0.05)。结论: SLC2A4基因启动子区rs5418位点的G→A突变能显著增强启动子活性,从而影响SLC2A4基因表达活性。     

利用同源序列确定人GIPC2核心启动子和寻找可能的顺式作用元件

目的利用同源序列确定人GIPC2核心启动子区和寻找可能存在的基因调控区域。方法 1)利用Vista比对不同物种GIPC2基因编码区和非编码区序列,得到GIPC2同源序列;2)分别构建插入人和大鼠GIPC2翻译起始位点ATG上游不同长度截短片段的重组质粒,转染人HEK293T细胞和大鼠PC12细胞;3)根据报告基因荧光强度推断人和大鼠GIPC2的核心启动子区;4)将人GIPC2内含子区同源序列置于核心启动子前面,构建重组质粒,转染HEK293T,HT-29和PC12细胞,检测启动子活性。结果人GIPC2核心启动子区确定为+32至+190序列区域;人和大鼠GIPC2 ATG上游一段同源序列有抑制GIPC2启动子活性的功能;人和大鼠GIPC2第一个内含子内的同源序列有促进启动子活性的功能。结论利用同源序列方法确定了人GIPC2基因的核心启动子区,并且找到能抑制和促进GIPC2启动子活性的可能的顺式作用元件。     

bHLH家族基因对hTERT启动子转录活性的调节研究

目的：研究bHLH家族基因中c-myc和mad1对人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子的转录调节。 方法： 采用脂质体DOTAP转染法将装载有虫荧光素酶基因的野生型hTERT启动子(Tw)和突变型hTERT启动子(Td)质粒，与含c-myc或mad1基因的质粒，以不同方式组合分别转染至膀胱癌T24细胞、EJ细胞、猴肾母COS-7细胞和人成纤维细胞，培养48 h后检测各组虫荧光素酶活性。 结果： 在膀胱癌T24和EJ细胞中，Tw组转录活性显著高于对照组，亦高于Td组。在T24和EJ细胞中, c-myc可呈剂量依赖地上调Tw的转录活性，但负性调节Td转录; 而mad1负性调节Tw转录，但上调Td的转录活性。c-myc和mad1联合可下调膀胱癌细胞Tw的转录。 结论： c-myc和mad1可对hTERT启动子进行转录调节，并且高度依赖于bHLH家族基因的接合位点E-box的序列保守性。     

SLE模型小鼠高IgG血症易感基因-Fcgr2b基因突变及对其表达的影响

目的:测定系统性红斑狼疮(SLE)小鼠模型 (NZB×NZW)F1双亲NZB ,NZW小鼠Fcgr2b基因启动子区核酸序列及其表达的改变,明确Fcgr2b基因的突变性质、对该基因表达的影响及与高IgG血症的关系。方法:采用核酸序列分析测定NZB ,NZW小鼠Fcgr2b基因启动子区突变性质;RT PCR检测Fcgr2b基因表达的改变;ELISA法测定比较(NZB×NZW)F1,NZB和NZW小鼠及(NZB×NZW)F1×NZW回交小鼠Fcgr2b基因B/W型与W /W型组间血清总IgG水平。结果:NZB小鼠Fcgr2b基因启动子区与正常鼠BALB/c相比存在2个部位碱基缺失,分别为13bp及3bp。NZW小鼠除有3个碱基置换外,与BALB/c鼠该基因启动子区序列相同;NZB小鼠Fcgr2b基因mRNA的表达较正常鼠BALB/c降低;NZB小鼠血清总IgG水平明显高于NZW小鼠(P <0 0 5 ) ,回交小鼠Fcgr2b基因B/W型组血清总IgG水平明显高于W/W型组(P <0 0 0 0 1)。结论:NZB小鼠Fcgr2b基因启动子区存在碱基缺失,且该缺失突变可引起其表达的降低而导致高IgG血症     

湖北汉族人群白细胞介素18基因启动子区多态性研究

目的 :研究白细胞介素 18(IL 18)基因启动子区 - 137G/C、- 6 0 7C/A位点多态性在湖北汉族健康人群中的分布。方法 :随机选择 187例湖北地区无血缘关系的汉族健康人 ,用序列特异性引物聚合酶链反应技术检测IL 18基因启动子区 - 137G/C、- 6 0 7C/A位点单核苷酸多态性 (SNP) ,并进行不同种族间比较。结果 :湖北地区汉族健康人群IL 18基因启动子区 - 137位点基因型以GG型 ( 6 7% )多见 ,其次为GC型 ( 30 % )和CC型 ( 3% ) ;其等位基因以G型 ( 82 % )最为常见。而 - 6 0 7位点基因型以CA型 ( 6 0 % )多见 ,其次为CC型 ( 2 1% )和AA型 ( 19% ) ;其等位基因以C型 ( 51% )多见。与瑞典、波兰、澳大利亚等人群相比 ,该位点多态性分布差异存在显著性 (P <0 .0 5) ,而 - 137G/C位点基因型分布与亚洲日本人群相接近 (P >0 .0 5)。结论 :湖北地区汉族人群IL 18基因启动子区 - 137G/C、- 6 0 7C/A位点存在多态性 ,其在不同种族间的分布可能存在显著性差异。     

中国湖北地区汉族人群P-选择素基因-2123C/G多态性分布的研究

目的:探讨P-选择素(P-selectin)基因启动子-2123位点多态性在中国湖北地区汉族正常人群中的分布特点。方法:采用聚合酶链反应(PCR)及限制性片断长度多态性(RFLP)方法检测中国湖北地区170名汉族人群P-选择素基因启动子-2123位点多态性,探讨其基因型及等位基因分布特点。结果:中国湖北地区人群P-选择素基因启动子-2123位点各基因型频率CC型8.20%,CG型37.60%,GG型54.10%。等位基因频率C为27.10%,G为72.90%。与欧洲国家人群相比,该位点多态性存在显著差异(P<0.01)。结论:P-选择素基因启动子-2123位点多态性有明显的种族差异。     

IL-10基因启动子多态性与皖南地区汉族人群支气管哮喘的相关性研究

目的:探讨IL-10基因启动子-1082G/A(rs1800896)、-819C/T(rs1800871)、-592C/A(rs1800872)位点多态性与安徽皖南地区汉族人群支气管哮喘的相关性。方法:采用病例-对照方法,用聚合酶链反应及直接基因测序法比较183例支气管哮喘组与151例正常人对照组之间基因型、等位基因频率的差异。结果:哮喘组IL-10基因启动子-1082G/A、-592C/A位点基因型与对照组相比有差异(P<0.05),其等位基因型频率在哮喘组和对照组间亦有差异(P<0.05)。而-819C/T位点基因型及等位基因型频率在哮喘组和对照组间均无差异(P>0.05)。结论:IL-10基因启动子rs1800896(-1082G/A)位点和rs1800872(-592C/A)位点的多态性可能与安徽皖南地区汉族哮喘相关;而rs1800871(-819C/T)位点的多态性可能与安徽皖南地区汉族哮喘无相关。     

PLAGL2对SP—C基因表达调控的作用靶点研究

目的 研究PLAGL2对SP—c基因表达调控的作用靶点。方法 定点诱变技术分别突变掉SP—C基因启动子上PLAGL2的结合位点以及PLAGL2的第6、7位锌指结构域序列并获得相应的突变体；凝胶电泳迁移实验研究PLAGL2及其突变体分别与SP—C基因启动子及其突变体之间的相互结合作用。结果 PLAGL2能与同位素标记的SP—C基因启动子片段相结合形成蛋白-DNA复合物，而两者的突变体却不能与相应的蛋白或DNA片段发生相互作用。结论 PLAGL2通过其第6、7位锌指结构与SP—C基因启动子上PLAGL2的核心和簇结合位点序列相互结合从而实现对SP—C基因的表达调控。     

Interleukin-18基因启动子区单核苷酸多态性与肝细胞癌遗传易感性关系的研究

目的探讨白细胞介素18(IL-18)基因启动子区-607C/A(rs1946518)和-137G/C(rs187238)单核苷酸多态性(SNP)与肝细胞癌(肝癌)遗传易感性的关系。方法应用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)技术,检测228例肝癌患者和300例健康对照者IL-18基因启动子-607C/A(rs1946518)、-137G/C(rs187238)单核苷酸多态性位点基因型,分析肝癌患者和对照组基因型频率和等位基因频率分布。结果肝癌组SNP位点rs187238 G等位基因的频率明显高于对照组(OR=1.1891,95%CI=1.0106-1.5633,P=0.026)。携带rs187238 GG基因型的肝癌患者较多(OR=1.5168,95%CI=1.1490-1.8322,P=0.010)。分层分析发现,rs1946518位点上AA基因型与肝癌发病的关联在饮酒的肝癌患者中更加显著(P=0.024),而且rs187238位点上GC/CC基因型与肝癌发病的关联在出现肝癌复发的患者中更加显著(P=0.005)。结论 IL-18基因启动子区-137G/C(rs187238)GG基因型与肝癌遗传易感性有关联。而rs1946518位点AA基因型和rs187238位点GC/CC基因型分别与肝癌患者饮酒和肝癌复发有关联。     

双重复合糖基转移酶的ABO基因启动子CpG岛甲基化

背景：在ABO血型抗原的研究中,绝大多数样本是相同的ABO基因表达出正常的相同的ABH抗原。但有一定数量的样本表现出具有相同分子遗传背景但表达出来的抗原强度却随着家系\个体不同而有所差异,说明了ABO血型中复杂的表达调控机制。分析一类罕见的双重复合型标本的ABO血型血清学与基因背景情况,深入表观遗传学的研究,有利于部分揭示ABO基因表达机制。 目的：探讨双重复合型ABO糖基转移酶表达相关的ABO基因启动子CpG岛甲基化水平与ABH抗原表达的关系。 方法：6例经血型血清学定为CisAB或B(A)型的标本,进行ABO基因编码区全长序列和启动子序列的测定,采用重亚硫酸盐处理法检测ABO基因启动子CpG岛甲基化程度。 结果与结论：6例双重复合AB型的标本中,在B101等位基因基础上存在nt803C > G突变的2个CisAB05/B(A)06等位基因,在ABO启动子CpG岛区域两者在nt-33(30%)、nt+27(50%)、nt+49(50%)具有甲基化差异;在A101等位基因序列的基础上存在nt803C > G突变的2个CisAB01等位基因,在ABO启动子CpG岛区域两者在nt-26(10%)位置有甲基化差异;在B101等位基因基础上存在nt640A > G突变的2个B(A)04等位基因ABO启动子CpG岛,在nt-33(10%)、nt+16(50%)、nt+57(60%)、nt+59(60%)、nt+68(60%)和nt+74(60%)位有甲基化差异。全部的6例标本ABO基因启动子区域DNA序列无任何突变异常。结果提示在相同的ABO遗传基因背景下,ABO基因启动子CpG岛区域某些位点甲基化可能影响ABH抗原在红细胞膜表面的表达。     

人β-防御素-2基因5''-端转录调控序列分析

目的：对在LPS、TNF-α刺激下，人β防御素-2基因5-端转录调控机制进行初步分析。方法：将HBD-2基因5-端上游序列连接入无启动子的pEGFP-1质粒，构建了系列5端缺失的pEGFP-1/HBD-2报告质粒。pEGFP-1/HBD-2质粒转梁细胞后给予LPS、TNF-α刺激，用RT-PCR检测pEGFP的mRNA浓度。结果：显示HBD-2基因上游-241段有较强的启动子活性；LPS、TNF-α刺激后，即使上游序列缩短至-241位点时，报告基因pEGFP的mRNA表达量仍明显增高。说明HBD-2基因上游-241区域含有LPS、TNF-α刺激后激活的转录因子作用位点。计算机分析表明-232/-222区域有一同源性极高的NF-kB结合元件，提示NF-kB结合元件可能调控HBD-2的增强表达。     

5-羟色胺转运蛋白基因多态性与精神分裂症的传递不平衡分析

目的 探讨5—羟色胺转运蛋白基因第2内含子可变数目串联重复序列(Intronic，variable number tandem repeat，Intronic VNTR)位点和启动子区VNTR位点(5—HTTLPR)在精神分裂症发病机理中的作用。方法 应用传递不平衡分析方法对来自上海、西安和吉林的总计314个精神分裂症简单核心家庭进行分析。结果 三地单独及合并样本的传递不平衡分析结果表明，这两个多态位点由杂合子父母传递给患病子女的等位基因频率差异无显著性。结论 5—羟色胺转运蛋白基因上Intronic VNTR和5—HTTLPR多态位点在中国汉族人群精神分裂症发病机理中不起主要作用。     

Dravet综合征患者SCN1A基因启动子区突变位点的检测及分析

目的 对Dravet综合征患者SCN1A基因启动子区突变位点的筛查及分析，预测其致病易感性。方法 收集24例Dravet综合征患者及100例正常人的外周血，抽提基因组DNA，PCR扩增SCN1A基因启动子区序列并测序；用生物信息学方法分析了SCN1A启动子区变异位点邻近序列的保守性及潜在的结合元件，推测其致病易感性。结果 从患者中发现两个突变位点-244 C>T和-662 G>-，都来自父亲，而没有血亲关系的正常人没有发现；-244和-662突变位点在哺乳动物中高度保守（100%）；人与其他哺乳动物之间-244突变位点邻近序列(位点上、下游20个碱基)的平均同源率高达90%，而-662突变位点邻近序列的平均同源率只有60%；含-244位点的序列分别能预测到4种不同的转录因子结合元件，而含-662位点的序列均未能预测到。结论 这两个突变与疾病存在一定程度的相关性，其致病的机理有待于实验证实。