重组冠状病毒核衣壳蛋白血清抗体检测

目的 SARS冠状病毒的核衣壳(Nucleocapsid)蛋白(N蛋白)是病毒的主要结构抗原，重组N蛋白可用作抗原检测患者血清中相应抗体。方法 以纯化的目的蛋白N-1，N-2分别包被96孔板，检测正常人群及患者血清中抗SAKS病毒抗体。结果 检测SAKS感染患者血清，N-1阳性检出率为55．68％，N-2阳性检出率为56．82％，与华大基因试剂盒相比符合率分别为90．12％和87．65％。结论 重组核衣壳蛋白可做为检测SARS抗体的抗原蛋白。     

SARS病毒N蛋白的表达与DNA疫苗的构建

目的：在大肠杆菌中表达SARS冠状病毒核衣壳N蛋白，并构建其DNA疫苗。方法：构建含N基因的原核表达载体pQEN，并在大肠杆菌M15中表达N蛋白。采用NP亲和层析法纯化目的蛋白。将N基因克隆入真核表达载体pSecTagB中，构建真核重组质粒pSecN。以其免疫小鼠制备抗血清，并用ELISA法检测其与大肠杆菌中表达的重组N蛋白及天然全病毒N蛋白的反应性。结果：重组N蛋白能与DNA疫苗免疫的小鼠血清以及SARS患者血清发生特异性反应；SARS—CoV病毒颗粒也可与DNA疫苗免疫的小鼠血清发生特异性反应。结论：重组N蛋白保留了病毒的一些特异性抗原表位，可作为用ELISA法检测SARS—CoV的抗原。构建的DNA疫苗可在小鼠体内产生高效价的抗SARS病毒N蛋白的特异性抗体，从而为该疫苗的开发奠定了基础。     

抗SARS-CoV病毒N蛋白的单链抗体(scFv)筛选

目的筛选出抗SARS-CoV病毒N蛋白的单链抗体。方法利用原核表达所获得的SARS病毒N蛋白,筛选人源单链抗体噬菌体展示库,经特异性的检测,以期得到抗SARS-CoV病毒N蛋白的特异单链抗体。结果获得了8个抗SARS病毒N蛋白的候选克隆。经测序,获得了编码抗体可变区的基因序列,并进行了原核表达。结论筛选得到的抗SARS-CoV病毒N蛋白单链抗体具有高度的特异性,可以用作临床实验或研究SARS病毒过程中快速检测SARSN蛋白或SARS病毒粒子的候选抗体。     

SARS冠状病毒N蛋白基因的表达及其在SARS诊断中的应用

目的 获得重组SARS冠状病毒（SARS-CoV）N蛋白抗原，建立特异性诊断SAILS病毒感染的免疫学方法。方法 大肠埃希菌中表达SARS病毒N蛋白基因，用金属螯合层析纯化N蛋白，建立检测SARS抗体的EUSA方法。结果 大肠埃希菌中表达了SARS病毒全长N蛋白抗原，经包涵体洗涤和金属螯和纯化后得到纯度较高的重组蛋白。用重组抗原EUSA检测30名SARS患者抗体全部为阳性，30名正常人血清为阴性，30名发热非SARS患者血清为阴性。结论 SARS表达核蛋白可以在大肠埃希菌中得到高效表达，纯化的重组N蛋白具有良好抗原性，可用于检测SARS抗体。     

一株变异SARS冠状病毒N蛋白的原核表达及活性测定

目的 :克隆编码严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS CoV)N蛋白的DNA ,构建原核表达质粒pGEX 2T/N ,并诱导表达。方法 :采用RT PCR方法从病毒培养液中获得N基因片段 ,并克隆入T EASY载体中。经PCR、双酶切鉴定后 ,测序。将N蛋白基因序列定向插入原核表达载体pGEX 2T中 ,表达融合蛋白。用表达产物与抗SARS CoV抗体阳性血清做Westernblot。结果 :N蛋白DNA测序的结果与GenBank比对缺失 2 0个bp。GST N融合蛋白以可溶形式表达。Westernblot检测表明 ,其与抗SARS CoV抗体阳性血清的反应呈阳性。结论 :成功地构建原核表达质粒pGEX 2T/N ,并表达GST N融合蛋白 ,为下一步的研究奠定了基础。     

SARS冠状病毒N蛋白的克隆与表达

目的　克隆和表达SARS冠状病毒N蛋白 ,并分析其免疫学活性。方法　采用RT PCR从SARS冠状病毒RNA中扩增出编码N蛋白的基因 ;经克隆和测序分析后 ,亚克隆至表达载体pGEX 4T 2 ,转化大肠杆菌JM10 9,PCR和双酶切鉴定 ;阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS PAGE分析 ;大量诱导表达N蛋白 ,亲和层析予以纯化 ;免疫印迹分析纯化蛋白对SARS的诊断效果 ;用纯化的融合蛋白免疫小鼠观察其诱导的抗体应答。结果　RT PCR扩增出N蛋白基因的特异片段 ,获得的阳性克隆序列与Gen Bank中登录的SARS冠状病毒的N蛋白基因序列同源性为 99.8% ;N蛋白基因被亚克隆到表达载体pGEX 4T 2 ,在JM10 9中表达了N蛋白 ,表达的蛋白经亲和层析获得纯化 ;纯化蛋白能被SARS病人血清识别 ;免疫小鼠诱导产生了高滴度的抗体。结论　成功构建了SARS冠状病毒N蛋白的重组表达质粒 ,在大肠杆菌中表达的N蛋白融合蛋白具有良好的免疫学活性。     

九种冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及纯化

目的 探索SARS冠状病毒（SARS-CoV）、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1等5种人类冠状病毒以及牛冠状病毒（BCoV）、鼠肝炎病毒（MHV）、猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）和禽传染性支气管炎病毒（IBV）4种动物冠状病毒核衣壳（N）蛋白在大肠杆菌中克隆表达及纯化条件。方法 利用原核表达载体pET30a（+）经IPTG诱导表达重组蛋白，并采用离子交换及镍离子螯合亲和层析法对重组蛋白进行纯化，用SDS-PAGE及Western blot对重组蛋白进行鉴定。结果 成功表达、纯化出9种冠状病毒N蛋白，纯度达90%以上。结论 在原核系统中表达得到了高纯度的9种冠状病毒N蛋白，为相关功能性研究奠定了基础。     

SARS病毒N蛋白特异性单链抗体的筛选

目的 利用大容量人源性SARS单链抗体库筛选N蛋白的特异性单链抗体。方法利用RT-PCR的方法克隆了SARS病毒的N蛋白基因，克隆入原核表达载体pBV220，在大肠杆菌DH5a中进行表达并经离子交换色谱纯化后得到了纯度达95％以上的N蛋白，然后以此蛋白包被25cm^2组织培养瓶，对SARS单链抗体库进行先松弛，后严谨的筛选、富集，进行4轮筛选后对所筛的抗体进行ELISA鉴定。结果经过4轮的筛选、富集，得到了1株高亲和力的N蛋白单链抗体N18。结论在对SAILS疾病的早期检测或筛查、SARS病毒的生活周期及发病机理的研究中N18将起到重要的作用。     

SARS-CoV核衣壳蛋白抗原性鉴定和基因免疫研究

目的　了解SARS冠状病毒 (SARS CoV)核衣壳蛋白 (N蛋白 )的抗原性及其基因疫苗的免疫原性。方法　用大肠杆菌表达SARS CoV的N蛋白 ,用SARS患者恢复期血清对其进行抗原性鉴定。再构建N蛋白基因疫苗 ,肌肉注射接种小鼠 ,检测小鼠血清中的抗N蛋白IgG抗体、脾细胞增殖和迟发型超敏反应。结果　大肠杆菌重组表达的SARS CoVN蛋白具有强抗原性 ,其基因疫苗能在小鼠有效诱导N蛋白特异性抗体和CD4 、CD8 T淋巴细胞免疫应答。结论　SARS CoV的N蛋白可作为重要的SARS血清学诊断抗原 ,并对于SARS的特异性预防和治疗有潜在的应用价值。     

SARS-CoV核衣壳蛋白单克隆抗体识别抗原位点的分析

SARS CoV主要的结构蛋白包括刺突糖蛋白(spikeglycoprotein ,S)、包膜小蛋白 (smallenvelope ,E)、膜蛋白 (membrane ,M)和核衣壳蛋白 (nucleocap sidprotein ,N)。研究发现 ,N蛋白诱导机体产生很强的免疫应答〔1〕,我们用SARS CoV全病毒免疫小鼠制备的单克隆抗体 ,发现有 80 %是针对N蛋白的抗体 ,证明N蛋白具有很强的免疫原性 ,这与以往对动物冠状病毒N蛋白研究结果是一致的〔2〕。本研究通过对SARS CoVN蛋白单克隆抗体结合抗原位点分析 ,以及用SARS CoV抗体阳性血清与单抗对N蛋白进行竞争抑制试验 ,分析自然状态下机体对N蛋…     

SARS-CoV、229E和OC43的抗原相关性研究

目的：分析SARS冠状病毒（SARS—CoV）和人冠状病毒（229E和OCA3）的抗原相关性。方法：制备三株冠状病毒的免疫兔血清及其重组核衣壳（N）蛋白的免疫小鼠血清，分别采用SARS法、Western blot和免疫荧光法对免疫血清进行检测以分析三株冠状病毒的抗原相关性。结果：Westem blot结果显示重组N蛋白免疫小鼠血清仅与各自的冠状病毒或重组N蛋白有特异性反应，相互间无交叉反应，而SARS结果显示OC43重组N蛋白免疫小鼠血清与SARS—CoV、229E N蛋白出现了构象抗体的交叉反应。同时，免疫荧光结果显示SARS—CoV和OCA3免疫兔血清与229E感染细胞存在较明显的交叉反应，但在SARS、Westem blot结果中全病毒免疫兔血清均仅与各自N蛋白特异性反应，相互间无交叉反应。结论：SARS—CoV、229E和OCA3N蛋白抗原性在免疫动物血清中不存在交叉反应，而SARS—CoV、OC43全病毒免疫血清均和229E出现明显的交叉反应。另外，基因重组的OCA3 N蛋白与另外二种N蛋白出现重组构形表位的交叉反应，提示以基因重组的蛋白作为诊断试剂，可能会因为蛋白的空间构象发生改变而产生非特异性反应。     

SARS冠状病毒S蛋白C端片段基因的克隆及其DNA疫苗的免疫学研究

目的：构建抗原基因为SARS冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoY）S蛋白C端片段基因的DNA疫苗，采用肌注和滴鼻的方法接种小鼠后观察肌肉注射途径和黏膜途径免疫使机体产生免疫应答的情况。方法：将S蛋白C端片段克隆至真核表达载体pcDNA3．1（-），随之将重组质粒进行小鼠肌肉和黏膜免疫，定期检测外周血中抗SARS-CoV的病毒特异性抗体水平，流式细胞仪观察其淋巴细胞表型变化，免疫组化检测抗原表达分布，脾细胞增殖实验评价CTL效果。结果：疫苗注射后15天就能在血清中检测出病毒特异性抗体。随着时问的延续，抗体水平逐步升高，至30天后达到稳定，以CTL为主的CD8^＋T淋巴细胞的百分比含量增加极显著，引起强大的体液免疫和细胞免疫；疫苗滴鼻后45天可在鼻黏膜检测到抗原表达；而空载体质粒对照组未检测出明显的特异性免疫应答。结论：以S蛋白C端片段基因为抗原基因的DNA疫苗通过肌注和滴鼻能诱导小鼠针对SARS病毒强大的免疫应答。     

SARS冠状病毒刺突蛋白的研究进展

SARS冠状病毒S蛋白是病毒颗粒最大的结构蛋白和最重要的表面抗原。该蛋白在介导病毒颗粒与宿主细胞受体结合、融合的过程中起着关键作用。它是病毒中和性抗体的靶点,在疫苗研究和抗病毒治疗研究中均占有重要地位。本文就SARS流行以来有关S蛋白的研究作一综述。     

SARS-CoV N蛋白的原核表达及其免疫原性研究

为了研究SARS-CoV病毒N蛋白基因的原核表达及其免疫原性,为进一步的研究奠定基础,我们以PCR方法在全病毒基因组文库中获得全长N基因,分别克隆到pcDNA3和pET32a载体中获得重组质粒pcDNA3-N和pET32a-N。以亲和层析方法分离纯化pET32a-N转化的BL21细菌裂解液中的重组N融合蛋白,并以ELISA方法检测pcDNA3-N质粒基因免疫小鼠诱导后血清中的特异性抗体。结果pET32a-N转化BL21细菌后可检测到重组SARS-CoVN融合蛋白表达并分离纯化,pcDNA3-N基因免疫能够诱导产生N特异的体液免疫应答。研究的结果表明,SARS-CoVN蛋白可以在原核细胞中有效表达并有良好免疫原性,可以为进一步的功能研究和血清学诊断提供条件。     

SARS-CoV N蛋白对真核细胞基因谱的影响

N蛋白位于SARS冠状病毒（SARS-CoV）颗粒的核心，是SARS-CoV的主要结构蛋白之一，它可以与病毒基因组RNA结合。目前研究表明N蛋白可以选择性激活AP-1（activator protein 1）信号转导途径；并发现在压力条件下（即缺乏生长因子时），N蛋白可以诱导COS-1细胞凋亡和肌动蛋白重组。本文研究了体外转染N蛋白真核表达载体后细胞基因转录水平的变化。通过长寡核苷酸芯片和SAM统计学处理，得到了瞬时表达N蛋白的真核细胞转录谱。N蛋白对哺乳动物细胞转录的影响可能与SARS-CoV的致病机理相关。     

牛AsiaⅠ型口蹄疫病毒重组蛋白疫苗的构建及功能研究

目的为了取代有安全隐患的牛AsiaⅠ型口蹄疫病毒灭活疫苗,我们构建了基因工程重组蛋白疫苗。方法应用PCR方法合成含有表位的基因片段,经过克隆连接获得重组基因,在大肠杆菌中表达后经镍亲和层析纯化重组蛋白。重组蛋白免疫豚鼠后,分别经ELISA和乳鼠中和实验检测血清中抗FMDV抗体水平。结果构建了牛AsiaⅠ型口蹄疫病毒重组蛋白疫苗的结构基因,并成功表达和纯化了该重组蛋白。功能实验表明,该蛋白在豚鼠体内诱生了高水平的抗牛AsiaⅠ型口蹄疫病毒的中和性抗体。结论该重组蛋白为制备牛AsiaⅠ型口蹄疫病毒新型疫苗提供了有价值的线索。     

呼吸道合胞病毒NS1基因原核表达及其免疫原性分析

目的：原核表达呼吸道合胞病毒（RSV）非结构NSl蛋白,并对其免疫特性进行研究。方法采用PCR技术获得NS1基因,将其插入pET41a（＋）载体上,导人大肠杆菌后诱导表达;利用GST亲和层析柱对诱导表达的NS1蛋白进行纯化,免疫动物制备抗体,Westernblot法鉴定抗体的特异性。结果重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测序完全正确．经IPTG诱导后融合蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中得到高效表达．表达产物经超声破碎和GST亲和层析纯化获得重组蛋白,分子量约42000Mr,以抗NS1蛋白的多克隆抗体为一抗进行Westernblot检测,结果只有RSV感染细胞的样品在15000Mr处有特异性带显示,其他病毒感染的细胞和阴性对照没有相应条带。结论NSl基因得到高效表达,免疫制备得到的抗体与RSV感染细胞有特异性反应,与其他常见呼吸道病毒感染细胞无交叉免疫反应。     

柯萨奇病毒B组5型非结构蛋白3C表达纯化及多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化柯萨奇病毒(CVB5)非结构蛋白3C,免疫雄性大鼠制备多克隆抗体.方法 通过酶切质粒获取3C基因序列,构建到原核表达系统大肠埃希菌中诱导表达重组的3C蛋白,使用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色法(BSA)对重组蛋白的纯度与浓度进行分析,重组的3C蛋白作为抗原,免疫雄性SPF级大鼠获得多抗血清,用ELISA测定抗体效价并Western印迹检测抗体特异性,用该抗体检测病毒在细胞内的复制.结果 构建了重组表达载体命名为3C-pET-28a,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达重组3C蛋白.ELISA测定制备的多抗血清效价为1:500 000,Western印迹检测在EV71、CVA16中都有交叉反应,并确定病毒感染细胞后24 h开始复制.结论 实验成功地利用原核表达系统表达柯萨奇病毒非结构蛋白3C,为进一步研究柯萨奇病毒的感染机理以及疫苗制备提供了基础.     

SARS冠状病毒spike基因DNA疫苗的初步研究

目的　构建SARS病毒spike基因片段真核表达质粒DNA疫苗;检测spike基因片段的免疫原性;筛选SARS病毒疫苗构建的理想靶抗原。方法　采用RT PCR从SARS冠状病毒北京0 1(BJ0 1)株cDNA获取了spike基因cDNA的全长D12、编码N末端氨基酸的cDNA片段D14和编码C末端氨基酸的cDNA片段D2 3;构建重组真核表达质粒pcDNA3 /D12、pcDNA3 D14、pcDNA3 D2 /3;用3种重组质粒和pcDNA3空质粒载体(对照)DNA皮下注射免疫Wistar大鼠;ELISA检测免疫后大鼠血清S蛋白特异性抗体IgG的产生;同位素51 Cr实验检测特异性CTL应答;ELISPOT检测单细胞水平IFN -γ分泌。结果　pcDNA3 /D2 3疫苗免疫组大鼠血清有S蛋白阳性抗体IgG产生、抗体滴度>10 0 0 ;脾淋巴细胞可诱导特异的CTL应答和IFN γ分泌,pcDNA3 /D2 3疫苗组与其它组之间统计分析P <0 .0 5。结论SARS冠状病毒S蛋白的C末端具有较强的免疫原性,是疫苗构建的理想候选靶抗原,本研究结果为SARS病毒的疫苗研究提供了资料。     

新型冠状病毒重组RBD重复串联三聚体蛋白疫苗作为加强针可在小鼠中诱导较强的免疫应答和交叉中和反应

目的研究新型冠状病毒重组蛋白疫苗作为加强针的效果。方法选择新型冠状病毒受体结合域(receptor binding domain, RBD)进行3次重复拷贝串联作为免疫原(RBD-sc-trimer), 利用昆虫杆状病毒表达系统表达RBD-sc-trimer重组蛋白, 并用His-标签亲和纯化。纯化产物进行Western blot鉴定并在体外验证其与人血管紧张素转化酶2(human angiotensin converting enzyme 2, hACE2)的结合能力。在BALB/c小鼠模型中进行免疫原性检测(结合抗体及中和抗体), 同时与RBD二聚体(RBD-Fc)、RBD单体(RBD)和刺突蛋白三聚体(S trimer)进行比较。结果 RBD-sc-trimer的免疫原性优于RBD-Fc和RBD, 并能达到S trimer的水平。RBD-sc-trimer能诱导产生较强的Th1偏向型抗体应答, 并能交叉中和新型冠状病毒Beta、Delta和Omicron变异株, 其中相较于原始毒株, 针对Omicron的中和抗体水平仅下降9.1倍, 远低于RBD-Fc(68.4倍)和S trim...