稳定过表达Cdx2基因胃癌细胞株的建立

目的 建立稳定过表达Cdx2基因的胃癌细胞株.方法 使用阳离子脂质体分别将真核表达载体pCMV-Cdx2-HA或空载体pCMV-HA转染至人胃癌细胞MGC-803中,G418筛选出阳性克隆后扩大培养.RT-PCR和Western Blot技术检测各组胃癌细胞中Cdx2基因mRNA和蛋白的表达情况,将挑选出的稳定株命名为...     

转录因子E2F-1过表达抑制胃癌细胞MGC-803的增殖

目的 了解E2F-1过表达对胃癌细胞MGC-803增殖、生长和细胞周期的影响。方法 PCR扩增E2F-1基因片段;然后经限制性内切酶 EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后将E2F-1定向克隆到真核表达载体pCMV-HA2中转化筛选。用脂质体Lipofectamine2000将该载体转染MGC-803胃癌细胞,然后用含G418的培养基筛选获得具Genectin抗性的过表达E2F-1的胃癌细胞株。RT-PCR和Western blotting技术检测MGC-803/E2F-1细胞内E2F-1表达情况。对稳定转染E2F-1的胃癌MGC-803/E2F-1细胞(实验组)、转染空载体的MGC-803/EV(阴性对照组)及未转染的MGC-803细胞进行MTT法检测,绘制生长曲线和计算细胞增殖率;流式细胞仪检测各组细胞周期分布。结果 RT-PCR和Western blotting 实验证实重组载体pCMV-E2F-1-HA2成功转入胃癌细胞内,并稳定过表达E2F-1。MTT法检测发现,与MGC-803/EV细胞组和MGC-803细胞组相比,胃癌MGC-803/E2F-1细胞的生长受到明显抑制,增殖率下降(26.61±5.19)% vs （93.4±10.29）%、（100±0.00）%,均P <0.01);细胞周期分析显示MGC-803/E2F-1组的细胞在G0/G1期所占比例为70.63%,高于MGC-803/EV组（60.03%,P<0.01）和MGC-803细胞组（60.43%,P<0.01）;MGC-803/E2F-1组的细胞在S期所占比例为(11.27%),明显低于MGC-803/EV组（28.70%,P<0.01）和MGC-803细胞组（29.70,P<0.01）。结论 E2F-1基因过表达抑制胃癌细胞的增殖和生长,细胞周期停滞在G0/G1期。     

人胃癌细胞株MGC-803 FHIT基因转染对阿霉素敏感性的影响

目的：将FHIT基因导入该基因表达缺失的人胃癌细胞株MGC-803,探讨胃癌中FHIT基因表达对阿霉素（ADM）敏感性的影响。方法：将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pRcCMV-FHIT用脂质体介导转入FHIT蛋白表达缺失的胃癌细胞株MGC-803,筛选阳性克隆,同时以空载体pRcCMV转染的胃癌细胞及未转染的胃癌细胞株作为对照,以ADM作用于三组细胞,用MTT法测定细胞的生长抑制率,用流式细胞仪检测ADM处理前后各组胃癌细胞的凋亡率及细胞周期的变化。结果：经ADM处理后,转染FHIT基因的MGC-803细胞的凋亡水平（40.66%）与空质粒转染组（13.94%）及胃癌细胞株组（15.81%）相比明显增高（P＜0.01）,并且FHIT基因与ADM有轻度的协同促进凋亡作用（P＜0.05）;同时ADM处理前后实验组胃癌细胞的生长周期较对照组均出现了明显的G0/G1期阻滞（74.43% vs 56.30%,99.27% vs 95.10%）,且细胞的生长抑制率存在浓度和时间依赖性。结论：外源性FHIT基因表达与ADM协同促进MGC-803细胞凋亡及细胞周期阻滞,FHIT基因可增加胃癌细胞对ADM的敏感性。     

外源性FHIT基因对人胃癌细胞株MGC-803增殖与凋亡的影响

目的：研究三联脆性组氨酸基因（fragile histidine triad,FHIT）对胃癌细胞株MGC 803增殖与凋亡作用的影响,并探讨FHIT基因的抑癌机制。方法：通过脂质体介导把质粒pRC/CMV-FHIT及pRC/CMV转染到有FHIT基因表达缺失的胃癌细胞株MGC-803,用G418对转染后细胞进行筛选,用Western blot对获得G418抗性的细胞进行FHIT基因表达的鉴定。用MTT法、克隆形成试验及流式细胞术观察转染前后细胞生长特性的变化。 结果：转染FHIT基因的MGC-803细胞有外源性FHIT基因的表达,其增殖活性减弱、克隆形成能力降低、凋亡率增加、生长周期出现明显的G₀/G₁期阻滞,且与对照组差异均有统计学意义。结论：向胃癌细胞中导入外源性FHIT基因可以抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡并引起细胞生长周期阻滞。     

RNA干扰介导的Cdx2沉默对人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤生长的影响

目的 建立人胃癌裸鼠移植瘤模型,探讨Cdx2基因RNA干扰(RNAi)的重组慢病毒载体(pLL-Cdx2-siRNA)对人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤Cdx2基因表达和肿瘤生长的影响.方法 建立人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤模型,随机分为实验组(pLL-Cdx2-siRNA组),空载体组(pLL3.7组)和生理盐水组.隔天向各组动物肿瘤内分别注射Cdx2基因沉默的重组慢病毒载体pLL-Cdx2-siRNA、空载体pLL3.7或生理盐水0.2 mL,共6次,测量各组肿瘤体积的大小;11d后处死裸鼠,应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测移植瘤中Cdx2基因的表达,脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)技术检测肿瘤细胞的凋亡.结果与生理盐水组和空载体组相比,实验组的肿瘤生长速度明显减慢(P＜0.05),肿瘤细胞Cdx2 mRNA和蛋白表达明显下降(P＜0.05);实验组肿瘤细胞的凋亡指数(16.7±5.6)％明显高于空载体组( 10.5±4.1)％和生理盐水组(11.2±4.3)％(P＜0.05).结论慢病毒载体pLL-Cdx2-siRNA瘤内注射可抑制人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤的生长.     

半乳糖凝集素3表达抑制对人胃癌MGC-803细胞中Bcl-2和Bax表达的影响及其促凋亡作用

目的：探讨抑制半乳糖凝集素3（galectin-3）的表达对人胃癌MGC-803细胞凋亡的影响,为基因靶向治疗提供潜在靶点。方法：人胃癌MGC-803细胞分为siRNA干扰组、空白对照组和阴性对照组,siRNA干扰组MGC-803细胞转染靶向galectin-3的siRNA,空白对照组MGC-803细胞只加转染试剂,阴性对照组MGC-803细胞转染阴性对照的siRNA。采用流式细胞术和碘化丙啶（PI）染色法检测各组细胞凋亡率和细胞凋亡情况,Western blotting法检测各组细胞中galectin-3、Bcl-2和Bax蛋白表达情况。结果：与阴性对照组和空白对照组比较,siRNA干扰组细胞中galectin-3蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。PI染色,siRNA干扰组凋亡细胞数量明显增加,凋亡细胞出现细胞核固缩、染色质浓集、新月形和凋亡小体等细胞凋亡特征,阴性对照组仅有少量散在的凋亡细胞。流式细胞术和Western blotting法检测,与阴性对照组和空白对照组比较,siRNA干扰组细胞凋亡率明显升高（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,Bax蛋白表达水平未发生明显变化（P>0.05）。结论：抑制galectin-3表达可促进MGC-803细胞的凋亡,提示galectin-3对胃癌细胞发挥癌基因作用,具有成为靶向治疗靶点的可能性。     

胃复春胶囊提取物对人胃癌细胞系MGC-803细胞凋亡及Bcl-2/Bax表达的影响*

目的研究胃复春胶囊提取物对人胃癌细胞系MGC-803细胞的凋亡作用及其作用机理。方法 MGC-803细胞分别用不同浓度的胃复春胶囊提取物处理。CCK-8法检测细胞活力;Hoechst 33258染色观察形态学改变;流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期;Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的表达。结果 胃复春胶囊提取物（浓度为0～100 μg·mL-1）可以浓度和时间依赖性地降低MGC-803细胞的活力。Hoechst 33258染色显示胃复春胶囊提取物处理后的MGC-803细胞膜通透性增高。流式细胞检测结果显示胃复春胶囊提取物作用于MGC-803细胞后可以诱导细胞凋亡,细胞凋亡率分别为（20.4 ± 2.7）%（25 μg·mL-1）、（41.3 ± 6.2）%（50 μg·mL-1）、（68.8 ± 5.8）%（100 μg·mL-1）,明显高于对照组凋亡率（3.8 ± 1.6）%（0 μg·mL-1）（P<0.05）。MGC-803细胞经过不同浓度胃复春胶囊提取物处理24 h后,处于G0/G1期细胞比例升高,而G2/M期和S期细胞比例下降;免疫印迹实验结果表明胃复春胶囊提取物（浓度为25,50,100 μg·mL-1）处理组 MGC-803 细胞中cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9和Bax表达量升高,而Bcl-2表达量降低,且呈剂量依赖性。结论 胃复春胶囊提取物能抑制MGC-803细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用机制与下调Bcl-2基因的表达,上调Bax基因的表达以及增加Caspases活性有关。     

Cdx2基因过表达对胃癌细胞免疫相关基因表达的影响

目的 利用基因表达谱芯片技术筛选过表达Cdx2的胃癌MGC-803细胞与对照组间差异表达的免疫相关基因. 探讨Cdx2对胃癌细胞免疫相关基因表达的影响。 方法 分别抽取Cdx2转染组和对照组的细胞总RNA,分离纯化mRNA并逆转录合成荧光分子(Cy3/ Cy5)标记cDNA 探针,与含有21522条人类22k基因表达谱芯片进行杂交。采用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪扫描芯片上两种信号,应用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行处理和分析。 结果 在21522条基因中,胃癌细胞间差异性表达基因为有551条,其中302条上调,249条下调。其中与免疫相关的基因共有7个,分别为HLA-E、RRAS、ULBP2、HLA-G、HLA-C、CTSB、CTSL,均表达上调。结论 Cdx2过表达上调了胃癌MGC803细胞免疫相关基因的表达,这可能与胃癌细胞生物学行为的改变有关。     

沉默β-catenin表达对胃癌MGC-803细胞生物学行为的影响与作用机制研究

目的探讨β-链蛋白（β-catenin）表达下调对胃癌MGC-803细胞生物学行为的影响,并分析其作用机制。方法将RNA干扰慢病毒（β-catenin-RNAi慢病毒）及空载体慢病毒（β-catenin-Neg）分别感染MGC-803细胞,分为实验组（MGC-803-RNAi细胞）、阴性对照组（MGC-803-Neg细胞）、空白对照组（未处理的MGC-803细胞）。Westernblot检测验证转染效率;双染流式细胞术检测细胞凋亡率,单染流失细胞术分析细胞周期,Transwell法检测细胞侵袭能力;Westernblot检测细胞Bax、Bcl-2、cyclinD1及基质金属蛋白酶（MMP）-7蛋白表达水平。结果MGC-803-RNAi、MGC-803-Neg细胞中显示绿色荧光的细胞约占80%,MGC-803细胞不显示荧光;与MGC-803-Neg、MGC-803细胞相比,MGC-803-RNAi细胞β-catenin表达水平明显下调(P＜0.05),细胞凋亡率升高(P＜0.05),出现G1/S期阻滞现象(P＜0.05),侵袭能力明显减弱(P＜0.05),Bcl-2、cyclinD1及MMP-7蛋白表达水平下调(均P＜0.05）,而Bax蛋白表达水平上调(P＜0.05)。结论沉默β-catenin表达可促进胃癌MGC-803细胞凋亡,阻滞其细胞周期进程,减弱其侵袭转移力,其作用机制可能与影响Wnt/β-catenin信号通路下游靶蛋白表达有关。     

新型去甲万古霉素-纤维蛋白胶磷酸钙人工骨研究

目的 利用基因表达谱芯片技术筛选过表达Cdx2的胃癌MGC-803细胞与对照组间差异表达的免疫相关基因,探讨Cdx2对胃癌细胞免疫相关基因表达的影响。 方法 分别抽取Cdx2转染组和对照组的细胞总RNA,分离纯化mRNA并逆转录合成荧光分子(Cy3/ Cy5)标记cDNA 探针,与含有21522条人类22k基因表达谱芯片进行杂交。采用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪扫描芯片上两种信号,应用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行处理和分析。 结果 在21522条基因中,胃癌细胞间差异性表达基因为有551条,其中302条上调,249条下调。其中与免疫相关的基因共有7个,分别为HLA-E、RRAS、ULBP2、HLA-G、HLA-C、CTSB、CTSL,均表达上调。结论 Cdx2过表达上调了胃癌MGC803细胞免疫相关基因的表达,这可能与胃癌细胞生物学行为的改变有关。 【关键词】 胃癌;Cdx2;免疫相关基因;差异表达基因     

外源性FHIT基因表达对胃癌细胞株MGC-803凋亡作用的影响

目的 :探讨外源性 FHIT基因的表达对胃癌细胞株凋亡作用的影响。方法 :将载有人外源性 FHIT基因的真核表达质粒 p Rc CMV- FHIT用脂质体介导转入胃癌细胞株 MGC- 80 3,用流式细胞仪、普通光镜、透射电镜观察 FHIT基因的表达对 MGC- 80 3细胞凋亡的影响。结果 :转染 FHIT基因的 MGC- 80 3细胞的凋亡水平 (32 % )与空质粒转染组 (12 .15 % )相比明显增高 ,且存在显著性差异 (P<0 .0 1) ,同时细胞的生长周期出现了明显的 G0 /G1期阻滞 (6 4.375 % vs 4 9.5 % )。结论 :外源性 FHIT基因能诱导胃癌细胞株 MGC- 80 3凋亡 ,细胞生长周期阻滞。     

大蒜油和白藜芦醇联合应用对胃癌细胞抑制作用及其机制

探讨大蒜油和白藜芦醇联合用药对人胃癌MGC-803细胞的抑制作用及其机制。通过MTT法检测大蒜油和白藜芦醇联合用药对胃癌细胞的抑制作用;流式细胞术检测药物作用后细胞周期改变;RT-PCR方法检测联合用药后Bcl-2、c-myc和hTERT基因mRNA表达水平。结果表明药物作用24 h和48 h后,联合用药对胃癌细胞的抑制率高于单药组,并表现明显的协同作用,可使胃癌细胞阻滞于细胞周期的G0/G1期;联合用药24 h和48 h后胃癌细胞Bcl-2、c-myc和hTERT基因mRNA表达水平比对照组明显下降。说明大蒜油和白藜芦醇联合用药能明显抑制胃癌细胞增殖并有协同作用,其机制可能与抑制胃癌细胞Bcl-2、c-myc和hTERT基因表达有关。     

血管生成素-1在体外对人胃癌细胞生物学作用的研究

目的:探讨人血管生成素-1(Ang1)及其与血管内皮生长因子165(VEGF165)共同作用对人胃癌细胞的生物学作用,研究其在肿瘤发生中的作用机制。方法:应用复制缺陷型腺病毒(Ad)-绿色荧光蛋白(GFP)、Ad-Ang1、Ad-VEGF165和Ad-Ang1 Ad-VEGF165/2转染人胃癌细胞株MGC-803,使用MTT比色法分析它们对胃癌细胞增殖的影响;通过流式细胞仪分析血浆饥饿时其对凋亡的影响;使用免疫细胞化学法检测Ki-67的表达;应用RT-PCR方法半定量检测bcl-2 mRNA、bax mRNA的表达情况。结果:MTT结果显示24、48和72 h Ad-Ang1转染组、Ad-VEGF165转染组和Ad-Ang1 Ad-VEGF165/2转染组吸光度均明显高于Ad-GFP组及对照组(P<0.05);Ad-GFP组与对照组相比无显著差异(P>0.05);Ad-Ang1 Ad-VEGF165/2转染组吸光度明显高于Ad-Ang1转染组和Ad-VEGF165转染组(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示Ad-Ang1、Ad-VEGF165及Ad-Ang1 Ad-VEGF165/2处理组与对照组及空转染组相比均能够显著抑制细胞凋亡(P<0.01)。免疫细胞化学法显示各转染组Ki-67表达强度均显著高于对照组和Ad-GFP组(P<0.01)。RT-PCR结果显示bcl-2 mRNA在各转染组中的表达要明显高于对照组(P<0.05);bax mRNA在各转染组中的表达要明显低于对照组(P<0.05)。结论:Ang1、VEGF165和Ang1 VEGF165/2能够明显促进人胃癌细胞MGC-803增殖,抑制血浆饥饿时的凋亡,Ang1 VEGF165/2组的作用要显著强于Ang1组和VEGF165组。     

血管生成素-1在体外对人胃癌细胞生物学作用的研究

目的：探讨人血管生成素-1（Ang1）及其与血管内皮生长因子165（VEGF165）共同作用对人胃癌细胞的生物学作用,研究其在肿瘤发生中的作用机制。方法：应用复制缺陷型腺病毒（Ad）．绿色荧光蛋白（GFP）、Ad-Ang1、Ad-VEGF165和Ad-Ang1＋Ad-VEGF165／2转染人胃癌细胞株MGC-803,使用MTT比色法分析它们对胃癌细胞增殖的影响;通过流式细胞仪分析血浆饥饿时其对凋亡的影响;使用免疫细胞化学法检测Ki-67的表达;应用RT-PCR方法半定量检测bcl-2mRNA、bax mRNA的表达情况。结果：MTT结果显示24、48和72h Ad-Ang1转染组、Ad-VEGF165转染组和Ad-Ang1＋Ad-VEGF165／2转染组吸光度均明显高于Ad-GFP组及对照组（P〈0．05）：Ad-GFP组与对照组相比无显著差异（P〉0．05）;Ad-Ang1＋Ad-VEGF165／2转染组吸光度明显高于Ad-Ang1转染组和Ad-VEGF165转染组（P〈0．05）。流式细胞仪检测结果显示Ad-Ang1、Ad-VEGF165及Ad-Ang1＋Ad-VEGF165／2处理组与对照组及空转染组相比均能够显著抑制细胞凋亡（P〈0．01）。免疫细胞化学法显示各转染组Ki-67表达强度均显著高于对照组和Ad-GFP组（P〈0．01）。RT-PCR结果显示bcl-2 mRNA在各转染组中的表达要明显高于对照组（P〈0．05）;bax mRNA在各转染组中的表达要明显低于对照组（P〈0．05）。结论：Ang1、VEGF165和Ang1＋VEGF165／2能够明显促进人胃癌细胞MGC-803增殖,抑制血浆饥饿时的凋亡,Ang1＋VEGF165／2组的作用要显著强于Ang1组和VEGF165组。     

胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803的细胞周期分布及侵袭能力之比较研究

目的体外培养胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803,并比较两种细胞周期分布情况及侵袭能力。方法采用流式细胞术观察两株细胞的周期分布情况;采用涂有Matrigel胶的Transwell小室对胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803进行体外侵袭实验,通过检测穿过小室的相对细胞数量比较两株细胞的侵袭能力。结果SGC-7901在G0/G1期、S期、G2/M期的分布百分比分别为(63.74±3.40)%、(30.23±2.70)%、(6.03±0.70)%;MGC-803在G0/G1期、S期、G2/M期的分布百分比分别为(62.94±6.13)%、(28.67±7.76)%、(8.39±1.69)%,两胃癌细胞株对应的周期时相分布百分比差异无统计学意义(P>0.05);检测SGC-7901和MGC-803穿过涂抹有Matrigel胶的聚碳酸酯膜的细胞数分别为65.67±6.03和94.5±3.68,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 MGC-803细胞的侵袭能力明显强于SGC-7901,而两株细胞在对应的周期时相分布情况则无明显差异。     

AdKDR-CDglyTK融合基因系统对胃癌MGC-803细胞体的外杀伤作用

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子第二受体,亦即酪氨酸激酶受体(kinase domain-containing receptor,KDR) 启动子驱动的CDglyTK融合基因体系对人胃癌细胞株MGC-803的杀伤作用。方法将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK 在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的MGC-803细胞株,并给予不同浓度的前药5-FC和／或更昔洛韦,观察该体系对MGC-803细胞株的杀伤效应及其旁观者效应;并以流式细胞仪检测细胞周期的变化,电镜观察细胞的病变。结果所得病毒滴度为2．0×1012pfu／ml。MGC-803细胞株感染率随腺病毒滴度的递增而增加。融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P<0．001)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应。流式细胞术检测表明该体系抑制MGC-803细胞DNA的合成,表现为G1期细胞比率增多及S期细胞减少(P<0．001)。同时,电镜下可见MGC-803细胞有凋亡和坏死改变。结论腺病毒介导KDR启动子驱动的CDglyTK融合基因体系可以有效地杀伤人胃癌细胞。