TGF-β对胎兔颅骨成骨样细胞增殖和分化影响的实验研究

目的：研究TGF-β对成骨细胞增殖和分化的影响。方法：利用已建立的胎兔颅骨成骨样细胞体外模型，采用MTT法、流式细胞仪检测、骨钙素、胶原和钙含量测定来分析不同浓度的TGF-β对成骨样细胞增殖和分化的影响。结果：低浓度TGF-β（0.010.1ng/ml）促进成骨样细胞增殖，使S期细胞增加，但高浓度TGF-β（110ng/ml）抑制成骨样细胞的增殖。在TGF-β0.01-1ng/ml范围内，与对照组相比，TGF-β各治疗组的骨钙素、胶原和钙含量明显增加，并随TGF-β浓度增加而增加，到TGF-β10ng/ml时，增加不再明显。结论：TGF-β对成骨细胞的增殖表现为双相作用，低浓度促进，高浓度时抑制，可明显促进成骨细胞的分化，并呈一定的量效关系，其有效剂量为0.011ng/ml。     

人骨膜细胞体外成骨分化的基因表达和功能检测

目的 探讨并鉴定骨膜细胞经骨形成蛋白7(BMP7)诱导分化为成骨细胞的基因表达和细胞功能.方法 成人胫骨骨膜常规体外细胞培养法,分实验组和对照组,分别加入BMP7加成骨辅助剂和单纯成骨辅助剂进行体外培养.CCK-8法检测细胞增殖活性,第5、10、15和20天分别采用Real Time-PCR检测骨钙素基因表达,ELISA法检测上清液碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的水平,甲苯胺蓝染色检测糖胺聚糖(GAG),Real Time-PCR检测Ⅱ型胶原基因,比色法检测细胞ALP活性,ALP染色法检测ALP,Yon Kossa染色法检测钙结节.结果 两组骨钙素基因表达及上清液ALP、骨钙素、骨桥蛋白的含量均增高,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).两组细胞的ALP和钙结节染色阳性率增高,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).甲苯胺蓝染色阳性率及Ⅱ型胶原基因表达表现为先高后低,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 骨膜细胞在BMP7诱导下体外大量增殖和分化成骨,表达出明显的成骨特异基因,并具有合成分泌成骨特异蛋白的功能;成骨化过程中,除直接分化成骨外,还存在部分细胞先经软骨形成再钙化成骨的现象;经骨膜细胞-BMP7途径在体外获取大量成骨细胞可用于组织工程的体外构骨及临床应用.     

高铁培养环境对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化的影响

目的 观察高铁培养环境下小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1增殖、分化指标的变化趋势,探讨铁离子对 成骨细胞增殖、分化的影响。方法 小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1在37℃条件下体外培养,在10mmol/Lβ-甘 油磷酸和50μg /mL抗坏血酸的诱导分化的作用下,分化为成骨细胞,同时用不同浓度(50、100、 200μmol/L)枸橼酸铁铵(FAC)干预,用MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR法检测成骨细胞分化基因成骨 相关转录因子(Runx2) 、锌指结构转录因子(Osterix) 、骨唾液酸蛋白(BSP)和骨钙素(OC)的表达,碱性 磷酸酶(ALP)活性试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性。结果 MC3T3-E1细胞的增殖活性、成骨分化相关基因的 表达以及ALP水平随FAC干预浓度的增加呈剂量依赖性降低(P<0.05)。结论 高铁培养环境可明显抑制小鼠 前成骨样细胞MC3T3-E1的增殖和分化。     

睾酮对离体胎鼠头盖骨成骨细胞影响的研究

目的 探讨雄激素对成骨细胞代谢的影响。方法 胎鼠头盖骨成骨细胞培养于含不同浓度睾酮的培养基中．观察细胞胸腺嘧啶核苷掺入、碱性磷酸薛(ALP)活性、骨钙素基因表达及骨钙素合成等细胞增殖及分化等指标的变化情况。结果 胎鼠头盖骨成骨细胞的增殖不受睾酮影响,但ALP活性、骨钙素基因表达及其合成在不同程度上受睾酮的调节。结论 雄激素对成骨细胞的分化具有促进作用,但对其增殖无影响。     

骨碎补含药血清对成骨细胞增殖、成骨的影响

目的研究骨碎补含药血清对成骨细胞的增殖、成骨的影响。方法取乳鼠颅骨,利用二型胶原酶反复消化,离心,提取成骨细胞。利用骨碎补含药血清干预,分别测定细胞增殖率、ALP活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量等,研究骨碎补含药血清对成骨细胞的增殖、成骨分化及其抗氧化性的影响;结果用含药血清干预,测定增殖率、ALP活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量、钙化结节量均高于空白对照组。结论骨碎补含药血清可以促进成骨细胞的增殖、成骨分化及其增强其抗氧化性。     

皮质骨和其他不同来源兔成骨细胞的体外培养和生物学特性比较

目的通过比较皮质骨和其他不同来源兔成骨细胞的体外培养和部分成骨功能,鉴定并探讨不同来源成骨细胞的增殖、成骨能力及其培养方法。方法取材于3个月龄新西兰大白兔,分别用组织块法和酶消化法分离培养尺骨皮质、髂骨、胫骨骨膜来源的细胞,取髂骨骨髓用密度梯度离心法分离提取干细胞,将细胞分为皮质骨组、骨膜组、松质骨组、干细胞诱导组和干细胞常规组。取第3代细胞进行实验,倒置相差显微镜下观察和结晶紫染色比较细胞形态、MTT法测定细胞增殖曲线、对硝基酚法测碱性磷酸酶(ALP)活性、酶免法测定骨钙素(BGP)活性等。结果普通显微镜下不同来源细胞在形态学上无显著差异;增殖和成骨能力:骨膜组和干细胞常规组增殖最快,皮质骨组和松质骨组居中,干细胞诱导组增殖最慢;干细胞常规组无明显ALP、BGP表达,不同来源细胞的ALP、BGP表达情况大致呈如下关系:骨膜组皮质骨组松质骨组干细胞诱导组。结论皮质骨、骨膜、松质骨、骨髓干细胞均可以培养出成骨细胞,皮质骨来源的成骨细胞成分相对单纯,生命力较旺盛;骨膜细胞在增殖和成骨能力方面有一定优势,但细胞成分相对不纯。     

云克对骨质疏松症患者成骨功能影响的研究

目的 观察云克对骨质疏松症患者成骨功能的影响.方法 取骨质疏松症患者骨组织,酶消化法培养成骨细胞,给予不同浓度云克予以干预,CCK-8法检测细胞增殖功能、流式细胞仪检测细胞周期、对硝基苯磷酸盐法检测碱性磷酸酶(ALP)活性、茜素红染色计数矿化结节的变化、Real-time RT-PCR检测骨钙素和骨形成蛋白(BMP)-...     

孕激素调节人成骨细胞转化生长因子-β1、β2的表达

目的研究孕激素对正常成人成骨细胞转化生长因子(TGF)-β1、TGF-β2表达的调节作用,探讨孕激素治疗绝经后骨质疏松症(OP)的作用机制.方法鉴定成人成骨细胞(hOB),测定碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素分泌,Van Gieson氏苦味酸酸性复红染色法进行Ⅰ型胶原染色.hOB用孕酮干预.Northern杂交、ELISA分别检测hOB TGF-β1、TGF-β2 mRNA和蛋白质分泌.结果观察到hOB分泌的ALP活性为(74.3±4.7)mU/mg蛋白,培养上清液骨钙素含量为(3.84±0.39)ng/ml蛋白,Ⅰ型胶原染色呈红色.观察到孕酮增强hOB TGF-β1、TGF-β2 mRNA表达呈剂量依赖性(P＜0.001);10-9mol/L孕酮诱导12～24 h促进TGF-β1、TGF-β2 mRNA表达,呈时间依从性.孕酮促进hOB TGF-β1、TGF-β2蛋白质分泌呈剂量依赖性(P＜0.001);10-9mol/L孕酮诱导12～24 h促进TGF-β1、TGF-β2蛋白质分泌,呈时间依从性.结论孕激素可能通过诱导成骨细胞TGF-β1、TGF-β2表达,促进成骨细胞增殖与分化,增强成骨功能及骨基质合成,促进骨形成.     

锶盐对高浓度地塞米松作用下大鼠成骨细胞的影响

目的 探讨雷奈酸锶(Sr)对高浓度地塞米松(Dex)作用下大鼠成骨细胞（OB)的影响。方法 采用大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)来源的成骨细胞,运用MTT试剂盒和AKP试剂盒分别测定Sr对细胞增殖和分化的影响,定量PCR方法测定Sr对高浓度地塞米松作用下成骨钙素（OC)和转化生长因子-β(TGF-β)表达的影响。结果 Sr浓度在10-5、10-4 mol/L时,能够促进OB增殖和分化(P < 0. 01); Sr浓度为10-4mmol/L能够有效拮抗高浓度Dex( 10-5 mol/L)对成骨细胞分化抑制作用（P <0.01),并能逆转Dex对成骨相关基因OC和TGF-β的抑制作用(P <0. 05,P <0. 01)。结论 Sr能够对大鼠BMSCs来源的成骨细胞的增殖、分化有促进作用,同时10-4 mol/L Sr可以拮抗Dex( 10-5 mol/L)对ALP和成骨相关基因的抑制作用。为Sr防治糖皮质激素性骨质疏松提供了细胞学依据。     

BMP-2重组质粒转染人骨髓基质干细胞及表达蛋白的诱导活性观察

目的 构建骨形态发生蛋白-2(BMP-2)真核表达质粒，使其在人骨髓基质干细胞(hBMSCs)中表达，并观察表达产物的诱导成骨活性。方法在脂质体介导下将BMP-2基因导入hBMSCs，流式细胞仪、ALP检测和VEGF探针原位杂交分析其对细胞增殖、ALP活性和VEGF表达的影响。并利用转染后的培养液上清诱导小鼠成纤维细胞(L929)，检测其骨钙素、Ⅱ型胶原表达。结果 转染后细胞稳定表达BMIP-2基因，S期细胞比例增多，ALP活性和VEGF的表达明显增加。且诱导L929细胞骨钙素、Ⅱ型胶原阳性表达。结论 BMP-2重组质粒转染hBMSCs后表达目的蛋白，促进自身增殖、分化和上调VEGF的表达，并诱导成纤维细胞向成骨细胞转化，为BMP-2基因治疗奠定了实验基础。     

BMP—2基因转染的人骨髓基质干细胞复合PLA／PCL支架体外构建组织工程骨

目的 用人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体(Ad—BMP—2)转染的人骨髓基质干细胞(hBMSC)，复合PLA／PCL(聚乳酸／聚己内酯)生物降解支架体外构建组织工程骨。方法 用Ad—BMP—2转染体外培养的成人BMSC，免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹方法检测细胞BMP—2的表达，并通过流式细胞仪和ALP活性检测分析其对细胞增殖、分化的影响。然后将转染后细胞接种到PLA／PCL支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 转染后，hBMP—2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达；S期细胞比例和ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论 Ad—BMP—2可高效转染hBMSC，且促进细胞增殖及成骨转化。转染后细胞在PLA／PCL上生长良好，BMP—2基因治疗的组织工程骨构建成功。     

转化生长因子-β基因转染骨髓基质干细胞在多肽修饰的聚乳酸-羟基乙酸上生长情况的研究

目的 探讨转转化生长因子-β(TGF-β)基因的骨髓基质干细胞(BMSCs)在RGD多肽表面修饰的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)材料上的增殖、黏附、分化情况,以研究TGF-β基因和RGD多肽在调控种子细胞生物学行为方面的作用. 方法将GRGDSPC多肽共价结合到改性PLGA支架材料上,把TGF-β基因转入BMSCs,以单纯PLGA支架材料、单纯BMSCs作为对照,分别将单纯BMSCs和转TGF-β基因BMSCs两组细胞种植于两种材料上,培养1、2、3 d后,计数细胞密度以反映细胞增殖情况:接种后4、12 h,沉淀法定量检测黏附的细胞数;培养24 h后用FITC连接的鬼笔环肽对细胞骨架染色,观察细胞骨架的组织情况;用成骨性培养基培养7、14、21 d,检测细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性来了解BMSCs分化情况. 结果转TGF-β基因细胞密度显著增大,且在各时间点有较高的ALP活性.RGD多肽修饰的PLGA材料上细胞黏附率高,并有较高的荧光素密度及较粗大的细胞骨架,且在第14天时表现出高的ALP活性.结论 TGF-β基因和RGD多肽同时应用有利于BMSCs黏附到支架材料上,并能促进其增殖和向成骨细胞方向分化.     

成骨因子BMP7在骨膜细胞体外培养中的作用

目的 探讨成骨因子骨形态发生蛋白(BMP7)在骨膜细胞体外培养中的诱导分化作用.方法取材于成人胫骨骨膜,常规细胞培养法行骨膜细胞体外培养,分为实验组和对照组,分别加入BMP7加成骨细胞培养辅助剂和单纯成骨细胞培养辅助剂,相差显微镜观察骨膜细胞形态特征.每组分别在第5、10、15、20天设3个样本,采用ALP试剂盒法及钙结节Von Kossa染色法分别检测成骨细胞特异性标志物ALP和钙结节的表达情况.结果 骨膜细胞在体外生长良好,实验组和对照组形成的成骨细胞增殖良好,形态一致.细胞早期呈梭形,饱满透明,立体感强;分裂期呈立方形或短柱状;后期由长梭形逐渐变成宽梭和不规则形.由BMP7诱导的骨膜细胞的成骨标志物ALP和钙结节染色阳性率明显高于对照组,有统计学意义(P＜0.01).结论 骨膜细胞具有良好的成骨和再生能力,BMP7在体外培养中具有明显增强骨膜细胞分化为成骨细胞的作用.     

骨形成蛋白联合雷奈酸锶对成骨细胞增殖和分化的影响

目的探索骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)联合雷奈酸锶(strontium ranelate,SR)对成骨细胞增殖和分化的影响,为临床上两者联合使用可行性提供细胞学基础。方法获取SD大鼠成骨细胞,随机分为对照组、SR组、BMP组和BMP-SR组等4组,培养基中分别添加安慰剂、SR、BMP-2和SR联合BMP-2干预,培养12 d后,通过MTT法检测细胞的增殖情况,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及茜素红染色观察细胞的功能状态,蛋白电泳观察骨钙素(osteocalcin,OCN)及Runx2蛋白的表达情况。结果 SR及BMP-2单独作用于成骨细胞时,都可以明显促进成骨细胞的增殖,增加ALP活性及矿化能力,同时明显促进OCN及Runx2蛋白的表达;联合使用效果明显优于单独使用,比较差异有统计学意义(P0.05)。结论 BMP-2及SR都可以明显促进成骨细胞增殖和分化,且联合使用效果更佳。     

TGF-β对胎兔颅骨成骨样细胞体外成骨作用

目的 :探讨TGF β对胎兔颅骨成骨样细胞体外成骨作用。方法 :显微相差动态观察、细胞增殖计数、ALP活性测定及骨结节计数观察TGF β体外成骨作用。结果 :TGF β对该细胞的增殖 ,低剂量有促进作用 ,高剂量有抑制作用。TGF β(在 3～ 7d)对ALP活性有促进作用 ,并呈一定的时效和量效关系。TGF β低剂量对骨结节形成有促进作用 ,高剂量时为强有力的抑制作用 ,与剂量有相关关系。结论 :TGF β对胎兔颅骨成骨样细胞体外成骨表现为双相作用。     

小白菊内酯对地塞米松诱导的成骨细胞增殖和分化的影响

目的 探讨小白菊内酯（parthenolide,PTL）对地塞米松（dexamethasone,Dex）诱导的成骨细胞（MC3T3-E1）成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法 用浓度为2.5~80 μmol/L的小白菊内酯与地塞米松共同处理MC3T3-E1细胞,CCK-8法检测细胞增殖活性;将MC3T3-E1细胞分为对照组（Control组）、地塞米松组（Dex组）、小白菊内酯低、中、高浓度组（PTL-L组、PTL-M组、PTL-H组）、小白菊内酯高浓度+Wnt抑制剂组（PTL-H+DKK1组）,碱性磷酸酶（ALP）染色检测细胞ALP活性,茜素红S染色观察细胞矿化结节形成;Western blot检测细胞Runt相关转录因子2（RUNX2）、骨钙素（OCN）、骨形成蛋白2（BMP2）、细胞周期蛋白Cyclin D1及Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达水平。结果 浓度为2.5~80 μmol/L的小白菊内酯可促进地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞增殖,选择小白菊内酯浓度为5.0、10.0、20.0 μmol/L进行后续实验;与Control组相比,Dex组ALP活性显著降低,矿化结节减少,RUNX2、OCN、BMP2、Cyclin D1、Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平显著降低（P<0.05）;与Dex组比较,PTL-L组、PTL-M组、PTL-H组ALP活性、矿化结节数依次升高,RUNX2、OCN、BMP2、Cyclin D1、Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平依次升高（P<0.05）;与PTL-H组比较,PTL-H+DKK1组ALP活性与矿化结节显著降低,UNX2、OCN、BMP2、Cyclin D1、Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。结论 小白菊内酯通过激活Wnt/β-catenin信号通路,减轻地塞米松对成骨细胞增殖与分化的抑制作用。     

丹仙康骨胶囊对培养成骨细胞影响的观察

目的：为了解补肾活血中药丹仙康骨胶囊对体外培养成骨细胞的作用。方法：应用透射电镜、MTT、对硝基苯磷酸盐法(PNPP)及骨钙素(BGP)含量放免测定法，观察丹仙康骨胶囊对成骨细胞超微结构、增殖与分化作用的影响。结果：丹仙康骨胶囊刺激(20mg／ml)的成骨细胞，ALP活性提高及骨钙素含量增多；透射电镜观察其细胞线粒体致密、游离核糖体增多、内质网丰富扩大增粗呈中等电子密度，而糖原溶解与脂肪空泡均较少。结论：丹仙康骨胶囊具有促进成骨细胞的代谢、增殖和分化的作用。     

Wnt3a联合骨形态发生蛋白2对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的 观察经典Wnt/β-catenin以及骨形态发生蛋白(BMP)信号通路对大鼠骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)体外增殖以及向成骨方向分化的影响.方法 应用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞并分4组:对照组、Wnt组、BMP组、Wnt3a和BMP-2联合组,在不同时间点用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞增殖活性,碱性磷酸酶(ALP)活性定量测定、Yon Kossa染色观察细胞向成骨分化和基质矿化程度.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测成骨特异性标志物表达.结果 培养第7天,CCK-8测吸光度值联合组为0.845,Wnt组为0.738,明显高于对照组0.409(P＜0.05).培养第6天和第12天,ALP活性吸光度值联合组为63.8和144.3,BMP-2组为40.8和104.1,均明显高于对照组7.3和18.9(P ＜0.05).培养14 d后,联合组骨钙素mRNA表达量高于对照组,而Runx2及Osterix表达量与其他组比较增高不显著.培养3周后,Yon Kossa染色显示联合组钙结节数量及大小均高于对照组.结论 Wnt3a因子和骨形态发生蛋白-2联合诱导能有效地促进骨髓间充质干细胞增殖及向成骨方向分化.     

成骨生长肽（OGP10-14 )在不同微重力条件下生物学活性的研究

目的 成骨生长肽(osteogenic growth peptide,OGP10-14)在不同重力条件下对成骨细胞增殖、分化的影响.方法 利用MTT实验和alkaline phosphatase(ALP)实验分别测定OGP10-14在不同重力条件下对成骨细胞的增殖、分化效应.结果 在正常条件下,10-12 mol/L及10-8 mol/L OGP10-14能够显著促进成骨细胞的增殖(P<0.05),最大效应浓度是10-12 mol/L,而且10-12 mol/L 的OGP10-14显著促进成骨细胞的ALP活性.在微重力条件下,10-8mol/L OGP10-14诱导48h后,促进细胞增殖作用最强.结论 在不同重力条件下,10-8mol/L OGP10-14对成骨细胞的增殖与分化具有促进作用.在正常条件下,10-12 mol/L 的OGP10-14显著促进成骨细胞的ALP活性.     

Follistatin 表达抑制促进 BMP-2诱导人类骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的探讨Follistatin表达抑制对人类骨髓间充质干细胞（BMSC）细胞活性及骨形态发生蛋白（BMP）‐2诱导人类BMSC成骨分化的影响。方法采用 Follistatin特异性 siRNA 转染人类BMSC ,检测线粒体脱氢酶活性、细胞DNA含量及蛋白含量。采用定量逆转录‐聚合酶链式反应（qRT‐PCR）检测成骨相关基因表达,采用碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色检测 Follistatin对BMP‐2诱导人类BMSC成骨分化的影响。结果转染后3、7 d ,人类BMSC代谢、DNA含量显著升高;转染后14 d ,总蛋白含量增加。Follistatin表达抑制后成骨相关基因如ALP、OCN、OSX、OC、OPN、RUNX2等表达升高,且ALP活性及钙沉积量显著增加。结论抑制Follistatin表达可促进人类BMSC细胞活性和BMP‐2诱导人类BMSC成骨分化能力,Follistatin可抑制人类BMSC成骨分化。