霍乱弧菌和大肠杆菌O157:H7检测芯片的制备

目的设计和制备快速检测霍乱弧菌和大肠杆菌O157：H7基因芯片。方法选择霍乱弧菌特异的编码外膜蛋白的ompW基因和毒素ctxA基因以及大肠杆菌O157：H7特异的编码菌体抗原rfbE、鞭毛抗原fliC和毒素SLT1、SLT2基因。设计引物和探针，并制备检测芯片，通过两次PCR扩增，制备荧光标记的靶序列，并与芯片进行杂交，检测霍乱弧菌和大肠杆菌O157：H7。结果所有霍乱弧菌和大肠杆菌O157：H7菌株在采用单一和多重PCR两种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交，均在芯片相应探针处出现阳性信号。非霍乱弧菌和非O157：H7菌株杂交结果均为阴性。结论基因芯片可以快速检测霍乱弧菌的O157：H7。     

基因芯片检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7

目的设计和制备快速、特异、灵敏的检测大肠埃希菌O157∶H7基因芯片。方法选择O157∶H7特异的rfbE、fliC、SLT1和SLT2基因,设计引物和探针,并制备检测芯片,通过两次聚合酶链反应(PCR)扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测O157∶H7菌株和非O157病原体。结果O157∶H7菌株在采用单一和多重PCR两种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交,均在芯片相应探针处出现阳性信号,非O157杂交结果均为阴性;芯片检测灵敏度比PCR检测高。结论基因芯片可以快速、灵敏、特异地检测O157∶H7,为建立快速灵敏的检测细菌病原体和鉴别诊断的自动分析系统提供了新方法。     

霍乱弧菌和大肠杆菌O157∶H7检测芯片的制备

目的设计和制备快速检测霍乱弧菌和大肠杆菌O157∶H7基因芯片。方法选择霍乱弧菌特异的编码外膜蛋白的ompW基因和毒素ctxA基因以及大肠杆菌O157∶H7特异的编码菌体抗原rfbE、鞭毛抗原fliC和毒素SLT1、SLT2基因,设计引物和探针,并制备检测芯片,通过两次PCR扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测霍乱弧菌和大肠杆菌O157∶H7。结果所有霍乱弧菌和大肠杆菌O157:H7菌株在采用单一和多重PCR两种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交,均在芯片相应探针处出现阳性信号,非霍乱弧菌和非O157:H7菌株杂交结果均为阴性。结论基因芯片可以快速检测霍乱弧菌的O157∶H7。     

实时PCR在大肠杆菌O157:H7快速检测中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的大肠杆菌O157：H7的定量检测方法。方法根据GenBank公布的O157：H7大肠杆菌rfbE基因序列，应用分子生物学软件进行序列比对，在该基因的保守区设计引物和TaqMan探针，对荧光定量PCR反应条件进行优化，建立实时荧光定量PCR检测大肠杆菌O157：H7的反应体系，并对该法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。结果所有大肠杆菌O157：H7菌株的检测结果均为阳性。而所有其它菌株检测结果均为阴性；该方法检测的灵敏度可达1cfu／μL。重复性检测的变异系数均小于5％。在模拟污染牛奶中，可检出l×10^2 cfu／μL的细菌。从细菌核酸提取至完成检测约需3h。结论本研究建立的基于Taqman探针技术的实时PCR检测体系具有快速、灵敏度高、特异性强等优点，可用于大肠杆菌O157：H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

实时PCR在大肠杆菌O157∶H7快速检测中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的大肠杆菌O157∶H7的定量检测方法。方法根据GenBank公布的O157∶H7大肠杆菌rfbE基因序列,应用分子生物学软件进行序列比对,在该基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对荧光定量PCR反应条件进行优化,建立实时荧光定量PCR检测大肠杆菌O157∶H7的反应体系,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。结果所有大肠杆菌O157∶H7菌株的检测结果均为阳性,而所有其它菌株检测结果均为阴性;该方法检测的灵敏度可达1cfu/μL,重复性检测的变异系数均小于5%。在模拟污染牛奶中,可检出1×102cfu/μL的细菌。从细菌核酸提取至完成检测约需3h。结论本研究建立的基于Taqman探针技术的实时PCR检测体系具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,可用于大肠杆菌O157∶H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

肠出血性大肠埃希菌(O157:H7)的基因同源性的分析

目的 对江苏省徐州地区O157：H7的病原学进行分析。方法 采用聚合酶链反应对O157：H7菌株毒力基因谱进行检测，同时用脉冲凝胶电泳(PFGE)和随机扩增多态性DNA(RAPD)方法对O157：H7菌株的同源性分析比较。结果 流行地区分离的O157：H7菌株，100％携带Hly、eaeA基因，95．35％携带SLT2基因，11．63％携带SLT1基因。脉冲凝胶电泳图谱表明流行地区分离的O157：H7菌株与日本分离的O157：H7菌株有明显差异，为不相关菌株；与国内标准菌株882364为近似型(相似，但不相同)。流行地区患者分离菌株与外环境家畜家禽粪便及昆虫肠道分离菌株的脉冲凝胶电泳图谱完全相同。结论 携带O157：H7菌株的家畜家禽可能是导致疫情发生的传染源。脉冲凝胶电泳方法用于O157：H7病原学分析，对流行病学研究有重要意义。随机扩增多态性DNA方法用于O157：H7病原学分析，技术简便、省时。     

动物源性肠出血性大肠杆菌O157︰H7及其三个毒力基因的多重PCR快速检测研究

目的 建立快速、特异的分离鉴定大肠杆菌O157︰H7及其三个主要毒力基因（hylA、eaeA和stx2基因）的多重PCR方法。方法 根据GenBank公布的大肠杆菌O157︰H7菌体抗原rfbE基因、鞭毛抗原fliC基因、溶血素（hlyA） 基因、紧密黏附素（eaeA）基因和志贺样毒素2 （stx2） 基因为靶基因,设计5对特异性引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了临床样品的检测。结果 该方法扩增目的基因片段分别为327 bp、247 bp、494 bp、384 bp和779 bp,特异性和灵敏度均高,细菌纯培养物的检测灵敏度为104 cfu/mL。结论 初步建立了快速、灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157︰H7及其三个毒力基因的多重PCR方法,可用于临床动物携带大肠杆菌O157︰H7的分子流行病学调查及食品微生物检测。     

应用多重PCR方法检测大肠埃希菌O157：H8的初步研究

目的 研究一种快速、特异的检测大肠埃希菌（以下称大肠杆菌）O157：H7的复合PCR方法。方法 选用针对大肠杆菌O157：H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ）和溶血素（Hly)基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157：H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果 除质粒缺失株（933）外,其余11株O157：H7大肠杆菌均在361bp处有溶血素基因产物出现;而12株O157：H8大肠杆菌扩增后的两条志贺样毒素基因产物存在差异,其中6株在210bp、484bp处出现两条相应产物,3株仅有210bp一条SLT－Ⅰ基因产物,另3株仅有484bp的SLT－Ⅱ基因产物。其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌的扩增结果均为阴性。结论 本复合PCR方法具有较高的特异性,可迅速、有效地将O157：H7大肠杆菌与其它常见致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌相鉴别,通过进一步研究有望应用于临床大肠杆菌O157：H7感染的辅助诊断。     

应用免疫磁珠分离法及荧光定量PCR技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157：H7

目的建立免疫磁珠分离法（immunomagnetic separation,IMS）联合荧光定量PCR（real-time PCR）技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的方法。方法根据肠出血性大肠埃希菌O157∶H7抗原特异性基因rfbEO157设计引物和荧光探针,建立real-time PCR检测体系,并检测其特异性及敏感性;用O157免疫磁珠特异性捕获标本菌液中的O157∶H7大肠埃希菌,结合real-time PCR对磁珠捕获菌细胞的DNA进行检测分析。结果 Real-time PCR检测结果显示,O157∶H7大肠埃希菌可产生荧光信号,而其他常见致病菌均未见明显荧光信号;采用IMS-real-time PCR方法检测标本,菌液含菌量为3.3×102CFU/mL时即可被检出,检测全过程需时约4h。结论 IMS-real-time PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、快速易操作等特点,该检测方法能提高O157∶H7大肠埃希菌的检出率和准确性,可用于标本的快速诊断、疾病监测和暴发疫情的病原学调查。     

衢州市带毒力因子肠出血性大肠埃希菌O157：H7的检测

目的了解衢州市家禽、家畜肠出血性大肠埃希菌O157:H7带菌情况和菌型分布特征,以制定相应的防治对策。方法6月份肠道传染病高发季节,采集动物粪便标本,对O157:H7菌株进行分离培养,并用PCR方法检测其毒力基因。结果共采集动物粪便标本300份,检出O157:H7菌16株,总带菌率为5.33%,其中牛、羊、猪带菌率较高,分别为20.83%、12.70%和3.61%。经PCR检测,检出的所有菌株均携带SLT2毒力因子,而SLT1与hly阴性。结论衢州市分离到带有毒力基因的肠出血性大肠埃希菌O157:H7,对人群健康构成了威胁,应加强O157:H7的综合监测。