BCR-ABL SH3-T79Y突变体重组腺病毒载体的构建及促进白血病K562/G01细胞凋亡

目的探讨构建BCR-ABL SH3-T79Y突变体(简称SH3-T79Y突变体)的重组腺病毒载体及其对白血病耐药细胞株K562/G01细胞凋亡的影响。方法以p Mig210质粒为模板,用重叠延伸PCR扩增SH3-T79Y突变体片段,将其克隆入重组腺病毒载体,通过鉴定、包装、扩增后得到含SH3-T79Y突变体的重组腺病毒。将重组腺病毒感染白血病K562/G01细胞株,测定其感染效率,瑞氏染色检查细胞形态学,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测BCR-ABL、Crk L磷酸化及总蛋白水平。结果重组腺病毒载体构建成功。SH3-T79Y突变体转染K562/G01细胞株72 h效率大于80%,可见明显的凋亡小体、核聚集等凋亡现象,凋亡率为32.46%,较对照组显著增加(P0.05);明显抑制BCR-ABL和Crk L的磷酸化水平,降低BCR-ABL总蛋白表达(P0.05)。结论成功构建SH3-T79Y突变体重组腺病毒载体,并证实其通过抑制BCR-ABL及底物Crk L磷酸化水平促进K562/G01细胞凋亡。     

微小RNA miR-181a促进慢性粒细胞白血病K562细胞分化

目的探讨微小RNA miR-181a对慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞的作用。方法构建了miR-181a过表达的慢病毒载体,采用实时定量PCR方法检测CD235a和γ球蛋白的表达,评价K562细胞向红系分化的程度,检测CD61和CD41的表达,评价K562细胞向巨核系分化的程度,采用CCK实验检测细胞增殖情况。结果氯高铁血红素佛及波酯诱导后,miR-181a在K562细胞中过表达能够增强CD235a、γ球蛋白、CD61和CD41的表达水平(P0.05);miR-181a过表达能够明显抑制K562细胞的增殖(P0.05)。结论 miR-181a过表达促进K562细胞的分化并抑制其细胞的增殖。     

模拟微重力对K562细胞增殖的影响

目的:研究微重力环境"航天贫血症"发生的相关机制.方法:采用美国国家航空航天局提供的旋转式细胞培养系统(RCCS-1)模拟微重力环境,培养人白血病K562细胞.用牛巴氏计数板计数细胞,用流式细胞术检测细胞周期,用Western-bloting方法检测细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)蛋白表达及其磷酸化水平.结果:...     

抗钙调素抗体对K562细胞增殖的抑制作用

钙调素 (ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ,ＣａＭ )是普遍存在于真核细胞内的Ｃａ2 受体蛋白 ,是细胞内信号传导系统的重要成分 ,可缩短细胞周期 ,促进细胞增殖。近年来发现ＣａＭ也存在于细胞外 ,细胞外ＣａＭ能促进Ｋ5 6 2细胞、Ｂｕｒｋｉｔｔ细胞的增殖[1,2 ] 。本课题用抗ＣａＭ抗体 (ＲＡＣａＭ )及纯化的重组人钙调素 (ｒｈＣａＭ )进行的研究结果初步表明 ,抗ＣａＭ抗体可抑制Ｋ5 6 2细胞增殖。1　材料和方法1 1　细胞及试剂　Ｋ5 6 2细胞 (本中心保存 ) ;ＭＴＴ (Ｓｉｇｍａ ) ;Ｎ 羟基琥珀酰亚胺基 3 (2 吡啶二硫 ) 丙酸酯 (ＳＰＤＰ ,…     

生长抑素对人红白血病K562细胞的抑制作用

目的　研究生长抑素对人红白血病K5 6 2细胞的抑制作用。　方法　采用 8肽生长抑素———奥曲肽(octreotide ,SMSZOL 1995 ,SMS)在体外作用于K5 6 2细胞 ,经光镜、电镜观察、3H TdR掺入法和TdT缺口末端标记(TUNEL)技术检测K5 6 2细胞增殖、凋亡的变化。　结果　光镜下观察到 ,加SMS组培养 72h与空白对照组比较 ,细胞碎片增多 ;电镜下可见 ,SMS处理组中部分细胞核染色质靠核膜边集 ,呈块状或新月形 ,部分细胞胞浆中见核碎裂团块与空泡 ,线粒体基质深染、空泡样变和髓样变 ;3H TdR掺入法显示 ,SMS呈浓度依赖性地抑制K5 6 2细胞增殖 ,抑制范围为 2 0 %～ 5 0 % ,以 10 - 6 mol L最有效。在 10 - 1 0 ～ 10 - 6 mol L范围内 ,与对照组比较有显著性差异 (P <0 0 1) ;TUNEL检测见核深染的阳性细胞 ,10 - 6 mol L组与对照组比较 ,凋亡细胞明显增多 (P <0 0 1)。　结论　生长抑素可抑制K5 6 2细胞增殖 ,诱导凋亡。     

温热处理对K562细胞系bcr／abl融合基因mRNA转录和Caspase-3表达的影响

目的观察不同温度刺激对K562细胞bcr／abl融合基因mRNA转录和Caspase-3蛋白表达的影响。方法将培养获得的K562细胞分别进行40℃、43℃、46℃恒温刺激30min,以37％作为对照;RT-PCR技术检测bcr／abl融合基因mRNA的转录,Westernbloting技术检测Caspase-3的表达。结果K562细胞热刺激30min后,bcr／abl融合基因mRNA的转录随温度升高而下调,Caspase-3的表达随温度升高而上调。结论温热刺激可降低K562细胞内bcr／abl融合基因mRNA的转录,提高Caspase-3的表达。     

P53基因对K562细胞增殖的影响

目的 观察恢复K562细胞的p53蛋白功能后该细胞的生物学行为的改变，探索用野生型p53基因治疗白血病的可能性。方法 以K562细胞为研究对象，电穿孔法转导野生型p53基因，RT-PCR和免疫细胞化学方法检测p53基因的表达，^3H-TdR掺入法检测细胞增殖，用流式细胞仪分别以TUNEL、annexin-V、细胞周期检测细胞的凋亡情况和细胞周期分布情况。结果 转染p53基因的K562细胞，出现明显细胞周期G1期停滞，增殖抑制率为24．17％，但用TUNEL、annexin-V和亚二倍体峰检测未发现与未转染p53基因组有凋亡细胞比例差异。结论 P53基因对K562细胞有一定的治疗效应，但不能诱导其发生凋亡。     

蜂胶抑制白血病K562细胞增殖机制的初步研究

目的: 探讨蜂胶对K562细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法: 体外培养K562细胞,将不同浓度的蜂胶掺入细胞,采用MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,RT-PCR检测细胞中Nup98 mRNA表达水平。Western blotting检测细胞中Nup98蛋白表达水平。结果: 2 mg/L、20 mg/L和200 mg/L组蜂胶K562细胞的增殖抑制率和凋亡率明显高于对照组,并具有一定的时间和剂量依赖性。高浓度蜂胶作用后,Nup98 mRNA及蛋白表达均明显低于对照组。结论: 蜂胶可抑制K562细胞的增殖,诱导其凋亡,其机制可能与下调Nup98的表达有关。     

白血病bcr/abl融合基因的定量检测及临床意义

目的探讨慢性粒细胞性白血病(ehron ic myeloid leukem ia CML)ber/ab l融合基因检测及意义。方法采用荧光定量PCR(FQ-PCR)检测56例慢性粒细胞性白血病中ber/ab l融合基因的表达。结果对照组bcr/ab l基因表达均为阴性。56例慢性粒细胞性白血病病人bcr/ab l基因表达阳性率为87.5%(49/56),表达值范围3.0×107-7.9×107基因拷贝/L;33例CML患者Ph染色体分析结果中25例为Ph( )/bcr(十),2例为Ph(-)/bcr( ),4例Ph( )/bcr(-),1例Ph(-)/bcr(-);8例CML患者治疗前ber/ab l基因表达均值为(2.60±0.9)×107基因拷贝/L,治疗后为(1.78±0.6)×107基因拷贝/L,两者具有显著性差异(P<0.05=。结论bcr/ab l融合基因表达水平的定量检测及动态观察,对CML的临床诊断、疗效观察和预后具有重要意义。     

miR-320调节人慢性髓系白血病细胞系K562的增殖

目的探讨miR-320对人慢性髓系白血病细胞系K562增殖和细胞周期的影响。方法采用正常人及初诊的慢性髓系白血病患者外周血病单个核细胞,用实时定量PCR检测miR-320和β-catenin mRNA的表达;用miR-320模拟物转染K562细胞,CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞计量术检测细胞周期;双荧光报告基因试验和Western blot检测β-catenin mRNA表达;实时定量PCR检测miR-320模拟物对Wnt/β-catenin信号通路下游基因的转录。结果 miR-320在慢性髓系白血病患者中的表达水平显著低于正常人,而β-catenin表达水平显著高于正常人(P0.05);过表达miR-320可以抑制K562细胞的增殖(P0.05)和细胞周期的运行;miR-320可抑制靶基因β-catenin的表达,进而抑制Wnt/β-catenin信号通路下游基因c-Myc、cyclin D、VEGF和Cox-2 mRNA的表达(P0.05)。结论 miR-320通过调节β-catenin的表达,在慢性髓系白血病中发挥抑癌功能。     

芬苯达唑对慢性髓系白血病K562细胞的增殖抑制作用

目的:探讨抗寄生虫药芬苯达唑对慢性髓系白血病细胞K562的作用及机制。方法:采用CCK-8法检测芬苯达唑对K562和正常人外周血单个核细胞(PBMC)生长的影响;台盼蓝拒染实验检测芬苯达唑对K562细胞活力的影响;瑞氏染色观察芬苯达唑对K562细胞形态的影响;流式细胞术检测芬苯达唑对K562细胞周期分布的影响;Western blot检测芬苯达唑对K562细胞周期相关蛋白表达的影响;免疫荧光观察芬苯达唑对K562细胞核的改变。结果:芬苯达唑能够显著抑制K562细胞的生长,而对PBMC生长无明显影响;进一步的研究发现,芬苯达唑显著抑制K562细胞增殖并诱导细胞发生G_2/M期阻滞;芬苯达唑处理K562细胞后,细胞分裂周期蛋白25C(Cdc25C)磷酸化、周期素依赖性激酶1(Cdk1)-Tyr15去磷酸化以及cyclin B1磷酸化增加;免疫荧光结果证实芬苯达唑诱导K562多核细胞增多(P0.01),发生有丝分裂灾难。结论:芬苯达唑通过调控周期相关蛋白诱导K562细胞发生G_2/M期阻滞。     

RNA干扰同源盒A10表达对K562细胞增殖及凋亡的影响

目的 通过构建靶向同源盒A10(HOXA10)的真核表达载体,探讨利用RNA干扰沉默HOXA10基因对人慢性髓系白血病细胞株K562增殖和凋亡的影响.方法 根据筛选的针对HOXA10的特异性有效小干扰RNA(siRNA)序列设计合成短发夹RNA(shRNA)寡核苷酸链,构建pGPHI-GFP-Neo-HOXA10真核表达载体并测序,应用阳离子脂质体转染K562细胞.实验分为细胞对照组(仅加等量细胞及培养基),阴性对照组(脂质体转染阴性对照质粒)、实验组(脂质体转染pGPHI-GFP-Neo-HOXA10).转染载体24 h后利用RT-PCR检测各组HOXA10 mRNA表达;转染载体24、48、72 h后应用MTT法检测各组细胞增殖并计算细胞抑制率;转染载体48 h后应用流式细胞术检测各组细胞凋亡.结果 成功构建pGPHI-GFP-Neo-HOXA10载体并转染K562细胞.与细胞对照组和阴性对照组比较,实验组转染载体能有效降低HOXA10 mRNA的表达水平[(38.86±4.49)％比(88.52±9.24)％、(86.75±7.38)％,P＜0.05],而阴性对照组与细胞对照组比较差异则无统计学意义(P＞0.05).与阴性对照组比较,实验组载体作用于K562细胞24、48、72 h后,细胞增殖能力均明显下降,细胞抑制率明显升高[(39.92±0.74)％比(7.98±5.52)％;(55.62±1.18)％比(8.27±3.45)％;(66.30±1.26)％比(8.63±3.58)％;均P＜0.05].实验组细胞凋亡率较细胞对照组、阴性对照组也显著升高[(22.29±1.67)％比(9.82±0.69)％、(10.14±0.96)％,P＜0.05],而阴性对照组与细胞对照组比较差异则没有统计学意义(P＞0.05).结论 构建的真核表达载体pGPHI-GFP-Neo-HOXA10可有效沉默K562细胞中HOXA10基因的表达,能明显抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡.     

中药露蜂房醇提取物对人红白血病K562细胞的生长抑制及凋亡诱导作用

目的：研究中药露蜂房(Nidus Vespae,NV)醇提取物对K562细胞的作用及其机制。方法：利用^3H-TdR掺入、透射电镜、原位末端标记(TUNEL)技术、免疫组织化学和图象分析等方法。结果：不同浓度NV醇提取物对。K562细胞生长具有明显抑制作用(27％～56％)。NV醇提取物组K562细胞呈典型的凋亡形态学改变,其Bcl-2蛋白表达显著减弱、Bax蛋白表达显著增强。结论：中药NV醇提取物可明显抑制K562细胞增殖,其作用机制可能是通过Bcl-2、Bax的表达,从而诱导白血病细胞凋亡。     

人参皂苷CompoundK对慢性粒细胞白血病K562细胞周期影响的研究

目的探讨人参皂苷CompoundK（CK）对慢性粒细胞白血病K562细胞周期的影响及机制。方法应用MTr法检测CK对K562细胞增殖的影响．用流式细胞仪分析细胞周期,用RT．PCR分析CyclinBl、cdc2、Survivin基因mRNA变化,用Western．blot法分析CyclinBl、p34砌、Survivin蛋白变化。结果人参皂苷cK能显著抑制K562细胞的增殖,呈浓度依赖性,细胞阻滞于G2／M期,cdc2基因mRNA表达下调,CyclinBl、p34出、Survivin蛋白质表达均下调。结论人参皂苷CK能使K562细胞阻滞于GJM期,该效应可能与CK抑制CyclinBl、cdc2基因表达有关,Survivin蛋白表达下调可能是CK抑制K562细胞周期的关键性分子。     

舟山眼镜蛇细胞毒素1对K562细胞的抑制作用

目的: 研究舟山眼镜蛇细胞毒素1(CTX1)对人慢性粒细胞白血病细胞系K562的抑制作用。方法: 应用MTS方法和细胞计数法分别检测不同浓度CTX1作用K562后的细胞相对活力和细胞数;PI染色后用倒置荧光显微镜观察活细胞培养体系中K562细胞死亡情况;流式细胞术检测Annexin V-FITC和PI双染色后细胞凋亡情况。结果: 不同浓度的CTX1(2、5、10 mg/L)作用于K562细胞24 h,细胞相对活力分别为(90.50±3.07)%、(58.33±3.08)%和(27.43±1.99)%(与阴性对照组相比,下同,P<0.05),作用24 h时CTX1对K562细胞的半数抑制浓度为5.77 mg/L。CTX1(8 mg/L)作用于K562 6 h、12 h、24 h,细胞数分别占对照组的(85.01±3.54)%、(56.65±3.59)%和(43.24±4.15)%,P<0.05。随CTX1浓度增加和作用时间延长,荧光显微镜下观察到被PI染色的细胞数逐渐增多。CTX1(8 mg/L)作用于K562细胞6 h、12 h、24 h,细胞坏死率分别为(0.73±0.06)%、(13.90±0.46)%和(23.33±0.86)%;晚期凋亡率分别为(16.27±0.21)%、(26.90±1.23)%和(18.77±0.81)%。结论: CTX1对K562细胞有明显抑制作用,主要引起K562细胞晚期凋亡和坏死。     

Wnt-10a在氯高铁血红素诱导K562细胞分化过程中的作用

目的 探讨Wnt-10a在氯高铁血红素（hemin）诱导K562细胞分化过程中的变化及功能。 方法 通过联苯胺染色检测K562细胞被hemin诱导的阳性率,利用Western blotting和免疫细胞化学分析K562细胞诱导分化过程中Wnt-10a表达水平和细胞定位的变化情况,通过半定量PCR与Real-time PCR检测K562细胞诱导分化过程中Wnt信号途径关键因子的表达水平及其变化,通过Wnt信号途径激活剂与构建Wnt-10a高表达K562细胞株的方法探讨Wnt途径改变后对K562细胞诱导分化的影响。 结果 在hemin诱导K562细胞分化过程中,细胞中的Wnt-10a蛋白表达量和mRNA量都出现了短暂下降后回复的趋势,同时Wnt-10a向胞膜迁移,Wnt蛋白所参与的3条信号途径中关键因子的表达水平均有着不同程度的变化。使用Wnt信号通路抑制剂后,诱导分化过程中的细胞增殖活力加强,Wnt-10a高表达的K562细胞被hemin诱导分化的能力开始提高,并且Wnt经典信号途径的关键因子表达水平也有上升。 结论 Wnt-10a与hemin诱导K562细胞红系分化的过程密切相关。     

人p66Shc重组腺病毒抑制Hela细胞增殖的体外研究

目的 探讨人p66Shc重组腺病毒抑制人宫颈癌Hela细胞增殖的作用及机制.方法 Hela细胞分为空白对照组(不感染腺病毒)、阴性对照组(感染Adeno X-LacZ)和实验组(感染AdenoX-p66Shc).通过细胞生长曲线、MTT检测分析观察细胞的生长状态;DHE染色法检测细胞内活性氧生成;流式细胞仪检测细胞周期;Western Blot法检测细胞内相关蛋白的表达.结果 p66Shc重组腺病毒能够抑制Hela细胞增殖,且随着p66Shc重组腺病毒处理时间延长和剂量增加其抑制作用增强.与空白和阴性对照组比较,p66Shc重组腺病毒感染48 h后,G2/M期细胞比例明显升高,其差异具有统计学意义(P＜0.01);同时引起Hela细胞活性氧水平显著上升,p53、CyclinB1蛋白表达显著升高,其差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 p66Shc重组腺病毒能够显著抑制Hela细胞增殖,并诱导其发生G2/M期阻滞.     

siArid2重组腺病毒载体的构建及其对肝癌细胞增殖的影响

 目的:通过RNA干扰技术沉默内源性抑癌基因Arid2(siArid2)的表达,观察其对肝癌细胞生长及细胞周期的影响。方法: 设计3对特异性沉默Arid2基因的shRNA序列,分别克隆到腺病毒骨架载体上形成重组腺病毒质粒。将质粒转染到HEK293细胞中,包装和扩增形成完整高滴度的重组腺病毒AdsiArid2-1~3。用构建好的腺病毒感染人肝癌SMMC-7721细胞,Western blotting方法检测Arid2蛋白的表达,筛选干扰效果最佳的重组腺病毒。MTS技术和流式细胞术观察干扰Arid2基因后肝癌细胞增殖和细胞周期的变化。结果: 成功构建了高滴度的重组腺病毒AdsiArid2-1~3。经Western blotting鉴定,AdsiArid2-3为抑制效果最佳的重组腺病毒。MTS结果显示,AdsiArid2组细胞在72 h、96 h的吸光度值与空细胞组和Adsicontrol组相比增高,细胞增殖速率明显加快。流式细胞术检测结果显示,AdsiArid2组处于G1期、S期的细胞百分比与空细胞组和Adsicontrol组相比,G1期细胞百分比明显减少,S期细胞百分比明显增多。结论: 成功构建干扰Arid2的重组质粒及重组腺病毒。沉默Arid2可以促进肝癌细胞的增殖,促进其由G1期向S期的转换。