可溶性抗原联合超抗原诱导的CTL抗瘤作用的实验研究

目的：探讨肿瘤可溶性抗原联合超抗原SEC诱导的细胞毒性T细胞（CTLs）对肿瘤细胞杀伤机理。方法：外周血淋巴细胞经肿瘤可溶性抗原、超抗原SEC联合作用,进行体外培养。对其增殖、细胞因子分泌、杀瘤活性和形态学变化进行观察和测定。结果：经肿瘤可溶性抗原、超抗原SEC联合刺激的淋巴细胞组增殖活性最强,诱导的CTLs对靶细胞杀伤活性显著高于单纯淋巴细胞组（P〈0．05）,对TSA来源的肺癌细胞具有选择性杀伤作用,能够诱导肿瘤细胞出现凋亡的形态学变化。结论：肿瘤可溶性抗原与超抗原SEC联合应用能诱导效应细胞明显增殖、活化、并产生高效特异性的抗肿瘤效果。     

可溶性抗原联合超抗原诱导的 CTL 抗瘤作用的实验研究

目的:探讨肿瘤可溶性抗原联合超抗原SEC诱导的细胞毒性T细胞(CTLs)对肿瘤细胞杀伤机理.方法:外周血淋巴细胞经肿瘤可溶性抗原、超抗原SEC联合作用,进行体外培养.对其增殖、细胞因子分泌、杀瘤活性和形态学变化进行观察和测定.结果:经肿瘤可溶性抗原、超抗原SEC联合刺激的淋巴细胞组增殖活性最强,诱导的CTLs对靶细胞杀伤活性显著高于单纯淋巴细胞组(P＜0.05),对TSA来源的肺癌细胞具有选择性杀伤作用,能够诱导肿瘤细胞出现凋亡的形态学变化.结论:肿瘤可溶性抗原与超抗原SEC联合应用能诱导效应细胞明显增殖、活化、并产生高效特异性的抗肿瘤效果.     

胶质瘤抗原联合超抗原SEC诱导杀瘤性免疫细胞的实验研究

目的:使用胶质瘤可溶性抗原(GSA)联合超抗原SEC刺激外周血淋巴细胞,诱导产生杀瘤性免疫细胞,对胶质瘤细胞进行杀伤,探讨肿瘤免疫治疗新方法.方法:提取健康人外周血淋巴细胞,体外培养,并经GSA、超抗原SEC联合处理.流式细胞术(FCM)和细胞毒试验测定效应细胞表型和杀伤活性.结果:经GSA、超抗原SEC联合刺激的淋巴细胞组增殖活性最强,于72h达到高峰,并且上调CD8+T细胞群,联合刺激诱导的效应细胞对靶细胞杀伤活性显著高于单纯淋巴细胞组(P＜0.05).结论:GSA与SEC联合应用诱导的效应细胞增殖快,细胞毒活性高,对抗原来源肿瘤细胞具有选择性杀伤作用.该实验研究为肿瘤免疫治疗提供了新的思路.     

树突状细胞的体外培养及其抗癌作用

背景与目的恶性肿瘤患者免疫力低下,缺乏强有力的抗肿瘤免疫应答,其原因是肿瘤细胞的抗原性较弱,而且抗原提呈细胞的功能低下,使肿瘤抗原不能有效地提呈给淋巴细胞。因此如何能有效地诱导出抗肿瘤免疫效应是一个非常关键的问题。本研究通过建立体外培养树突状细胞(dendritic cells,DC)的方法并观察其诱导的抗肺癌作用的研究,为以DC为基础的肺癌免疫瘤苗的临床应用提供实验依据。方法3mol/L氯化钾法提取人肺腺癌细胞GLC-82的可溶性抗原多肽;从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中用GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导扩增DC,用流式细胞仪FCM及免疫染色法分析鉴定DC;肺癌肿瘤可溶性抗原(tumor soluble antigen,TSA)和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)联合修饰致敏DC;以联合抗原修饰后的DC、单纯肺癌抗原TSA致敏的DC、单纯超抗原SEA修饰的DC和未经抗原修饰的DC分别与外周血T淋巴细胞共同孵育,刺激T淋巴细胞活化增殖,诱导产生具有识别肺癌抗原的特异性CTL(作为效应细胞分别称为TSA-SEA-DCL、TSA-DCL、SEA-DCL、DCL);采用MTT法检测各效应细胞对靶细胞GLC-82、肺癌CALU-6和人红白血病K562细胞的抗癌活性;镜下观察DC、效应细胞形态及对靶细胞的杀伤过程。结果诱导出高表达CD1a、HLA-DR、CD80具有典型树突状细胞特性的DC;TSA-SEA-DCL对靶细胞GLC-82的杀伤率明显高于TSA-DCL、SEA-DCL及DCL,亦明显高于对K562细胞的杀伤率;与靶细胞共育时镜下发现效应细胞CTL靠近并聚集在肿瘤细胞周围,致使肿瘤细胞发生变性坏死及凋亡。结论本实验方法能成功诱导出具有典型特征的成熟DC,肺癌TSA联合超抗原SEA诱导的DC疫苗对肺癌细胞有高效特异杀伤作用。     

rhHSP70联合冻融抗原修饰树突状细胞诱导的抗乳腺癌作用

  目的   利用rhHSP70联合树突状细胞递呈肿瘤抗原的特性提高细胞毒T淋巴细胞（CTLs）对乳腺癌细胞的杀伤活性。   方法   外周血单个核细胞体外经GM-CSF和IL-4诱导产生树突状细胞,负载冻融抗原肽的同时加入新型热休克蛋白（rhHSP70）,不同分组分别诱导自体CTLs产生。ELISA测定CTLs杀伤活性和细胞因子的分泌。   结果   冻融抗原肽致敏的DCs促进CTLs增殖,上调CTLs中CD3+和CD8+T细胞群及Th1型细胞因子的分泌;体外实验中具有对人乳腺癌细胞MCF-7的杀伤活性,在加入rhHSP70后效果更加明显,并能显著增强CTLs对肿瘤细胞的杀伤率。   结论   hHSP70联合肝癌冻融抗原修饰DCs,能够促进DCs的成熟,增强DCs刺激淋巴细胞增殖的能力,诱导的CTLs在体外对乳腺癌细胞能产生高效杀伤力。rhHSP70增强DCs抗肿瘤能力的机制可能与其促进DCs成熟有关。       

肺癌可溶性抗原联合超抗原修饰致敏ＤＣ诱导抗瘤免疫的研究

目的　观察经肺癌肿瘤可溶性抗原（ＴＳＡ）和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素Ａ（ＳＥＡ）联合修饰致敏树突状细胞（ＤＣ）体外诱导抗肺癌的免疫效应。方法　３ｍｏｌ／Ｌ氯化钾提取法获得人肺癌细胞ＧＬＣ ８２的可溶性抗原;从人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中诱导扩增ＤＣ,并用流式细胞仪（ＦＣＭ）检测表型;以肺癌ＴＳＡ和ＳＥＡ联合修饰致敏的ＤＣ、单纯肺癌抗原致敏的ＤＣ和未经抗原修饰的ＤＣ分别与同种异体外周血Ｔ淋巴细胞共同孵育,刺激Ｔ淋巴细胞活化增殖（作为效应细胞分别称为ＴＳＡ-ＳＥＡ-ＤＣＬ、ＴＳＡ-ＤＣＬ、ＤＣＬ）,直接活细胞计数法观察增殖倍数;ＭＴＴ法检测不同ＤＣ∶Ｔ淋巴细胞比例的效应细胞对靶细胞ＧＬＣ-８２的体外杀伤效应。结果　诱导出高表达ＣＤ１ａ、ＣＤ８０、ＨＬＡ-ＤＲ的ＤＣ,光镜下具有典型的ＤＣ特性;联合抗原修饰后的ＤＣ具有较强的免疫刺激活性,少量致敏ＤＣ即可强烈激发Ｔ细胞的增殖;ＴＳＡ-ＳＥＡ-ＤＣＬ对靶细胞ＧＬＣ-８２的杀伤率明显高于ＴＳＡ-ＤＣＬ及ＤＣＬ;联合抗原修饰的ＤＣ以１∶１００与Ｔ淋巴细胞共孵后的杀伤肿瘤细胞效应最强。结论　经肺癌ＴＳＡ和ＳＥＡ联合修饰致敏的ＤＣ可强烈激发同种异体Ｔ淋巴细胞活化增殖;肺癌ＴＳＡ联合超抗原ＳＥＡ诱导的ＤＣ疫苗对肺癌细胞有高效杀伤作用,经肺癌ＴＳＡ与超抗原ＳＥＡ联合修饰ＤＣ的活性明显强于单用肺癌ＴＳＡ。     

负载肺癌抗原DC疫苗抗肿瘤免疫实验

 目的探讨负载人肺癌细胞株A549冻融抗原DC疫苗体外抗肿瘤免疫效应。方法自脐血分离单核细胞，经rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α诱导树突状细胞（DC），负载人肺癌细胞株A549冻融抗原、LPS诱导成熟，利用免疫磁珠分选获得功能性肺癌DC疫苗（UbDC／AgL），ELISA测定UbDC／AgL培养上清中细胞因子浓度、LDH法测定特异性细胞杀伤（CTL）活性及MTT法检测自身混合淋巴细胞反应（AMLR）。结果UbDC／AgL细胞组IL-1、IL-12、IL-6和IFN-β含量明显高于UbDC／Ag和UbDC组（P〈0．01）；UbDC／AgL疫苗细胞能有效诱导肿瘤特异性CTL活性，对A549细胞有特异性杀伤作用（P〈0．01），并能有效促进淋巴细胞增殖。结论负载肿瘤冻融抗原DC疫苗，能有效激活T淋巴细胞进而诱导肿瘤特异性杀伤效应。     

食管癌疫苗临床应用分析

  目的  对食管癌疫苗在临床应用效果进行分析，以期为临床应用提供参考。  方法  从食管癌术后肿瘤组织标本中提取其可溶性抗原成分和超抗原SEC构建成肿瘤疫苗，对食管癌术后328例患者进行临床应用(观察组)，并以常规治疗326例患者作为对照组，观察并分析临床应用效果和5年随访结果。  结果  观察组5年生存率为49.71%(173/328)，对照组5年生存率为20.55% (67/326)，经统计学处理有显著性差异(P < 0.05)；女性生存率为51.22% (84/164)，男性生存率为45.12% (74/164)，女性生存率显著高于男性(P < 0.05)。观察组中低分化患者的生存率(61.90%)显著高于高分化患者的生存率(41.61%)，差异具有统计学意义(P < 0.05)；而对照组低分化患者生存率(10.75%)显著低于高分化患者的生存率(31.34%)，差异具有统计学意义(P < 0.05)。  结论  该疫苗能有效防止食管癌术后患者的复发和肿瘤转移，提高生存率，特别是对女性患者和恶性程度高的患者效果更佳。      

肺癌可溶性抗原联合超抗原诱导的DC疫苗对肺癌细胞杀伤作用的研究

背景与目的 通过经肺癌肿瘤可溶性抗原(TSA)和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)联合修饰致敏树突状细胞(DC)体外诱导对肺癌细胞杀伤作用的研究,为以DC为基础的肺癌免疫瘤苗的临床应用提供一定的实验依据.方法 3M KCI法提取人肺癌可溶性抗原;从人外周血单个核细胞(PBMC)中诱导扩增DC并鉴定;肺癌TSA和不同质量浓度的SEA联合修饰致敏DC;以联合抗原修饰后的DC、单纯肺癌抗原致敏的DC和未经抗原修饰的DC分别与同种异体T淋巴细胞共同孵育,MTT法测定混合淋巴细胞反应中DC的免疫刺激活性,诱导产生具有识别肺癌抗原的特异性CTL(作为效应细胞分别称为TSA-SEA-DCL、TSA-DCL、DCL);用流式细胞仪FCS及免疫染色法分析鉴定DC和效应细胞表型;M1T法检测各效应细胞对靶细胞体外杀伤效应.结果 诱导出表达CD1a,CD80,HLA-DR分子的DC;经肺癌TSA和SEA联合修饰致敏后,上述分子表达上调;联合修饰后的DC具有较强的免疫刺激活性,DC/T比例1:10可能为最适比例;TSA-SEA-DCL中CD3+CD8+细胞的比例大幅度增加;TSA-SEA-DCL对靶细胞GLC-82的杀伤率明显高于TSA-DCL及DCL,亦明显高于对肺癌CALU-6和人红白血病K562细胞的杀伤率.结论 经肺癌TsA和sE^联合修饰致敏的DC可诱导同种异体T淋巴细胞活化增殖产生CD8+表达增加的CTL;联合抗原诱导的DC疫苗对肺癌细胞有高效特异性的杀伤作用,肺癌TSA和超抗原SEA联合修饰的DC的活性明显强于单用肺癌TSA修饰.     

抗原致敏及白细胞介素27基因修饰的树突状细胞诱导抗食管癌免疫的体外研究

目的:探讨食管癌细胞抗原致敏、白细胞介素27(interleukin27,IL-27)基因修饰的树突状细胞(dendritic cells,DCs)疫苗的特异性抗食管癌免疫反应。方法:采用重组逆转录病毒介导IL-27基因修饰食管癌患者外周血DCs;反复冻融法提取食管癌细胞裂解产物,致敏经IL-27基因转染的DCs;ELISA法检测各组DCs和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)上清液中IL-27、IL-12和干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的分泌水平;FCM法分析各组DCs表面分子CD1a、CD83、CD80和CD86的表达水平;MTT法检测DCs刺激T细胞增殖的活性和DCs诱导CTLs杀伤食管癌细胞的效能。结果:经IL-27基因修饰和抗原致敏后的DCs高表达CD83、CD80和CD86分子,其表达量分别为(82.67±7.92)%、(78.33±7.31)%和(85.33±4.32)%;DCs上清液中IL-12、IL-27及IFN-γ分泌量明显提高,分别为(107.85±7.20)ng/L、(430.39±10.12)ng/L及(411.97±17.80)ng/L;并且,DCs明显刺激同源T细胞增殖,增强了CTLs上清液中IFN-γ水平[(751.50±31.30)ng/L]。诱导产生的CTLs对食管癌细胞有强大的杀伤作用,显著高于其他组(P<0.01)。结论:IL-27基因修饰增强了DCs在体外诱导自体T淋巴细胞产生特异性抗食管癌免疫的能力。其机制可能与IL-27基因修饰和抗原致敏活化了DCs抗原提呈第二信号,促进了DCs高分泌IL-27和IL-12因子,活化了T淋巴细胞,并致使CTLs分泌IFN-γ的能力增强等密切相关。     

自体宫颈癌-树突细胞疫苗激活的CTL杀伤效应

背景与目的:树突细胞(dendriticcells,DC)是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞(antigen-presentingcell,APC),它可以在体内、外向T淋巴细胞递呈抗原,并诱发细胞毒T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)反应。本研究旨在探讨负载自体宫颈癌抗原的DC体外激发的CTL对自体宫颈癌细胞的杀伤效应。方法:先冻融宫颈癌细胞制备抗原,然后以GM-CSF、IL-4诱导自体外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)获得DC并负载抗原,刺激自体T淋巴细胞制备宫颈癌抗原特异性CTL,观察CTL对宫颈癌细胞的杀伤活性。结果:负载自体宫颈癌抗原DC诱导的特异性CTL对自体宫颈癌细胞的体外杀伤率高达79.32%～89.27%,显著高于淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activatedkillingcells,LAK)的杀伤率(t≥2.89,P<0.05);且对宫颈癌HeLa细胞株具有一定杀伤效应(40.35%～58.09%),但低于自体癌细胞组(t≥2.97,P<0.05);特异性CTL对HepG2、MCF7、A549、MGC803细胞无明显杀伤效应。结论:自体宫颈癌-树突细胞疫苗体外诱导的CTL具有高效而特异的抗自体宫颈癌细胞免疫活性,可望成为宫颈癌生物治疗的一个有力手段。     

小鼠肺癌B7疫苗细胞FLB2C诱导的抗肿瘤免疫应答

目的：研究小鼠肺癌细胞与活化B淋巴细胞融合的疫苗细胞FLB2c诱导细胞免疫反应情况。方法：用母本细胞LA795作对照，采用体外混合淋巴细胞培养，观察FLB2c细胞刺激T细胞增殖情况，通过CTLL细胞MTT法测定FLB2c刺激T细胞产生分泌IL－2的作用，用FLB2c免疫小鼠，观察疫苗体内诱导小鼠CTL活性的能力。结果：FLB2c细胞在体外刺激T细胞增殖的作用明显比LA795强；FLB2c能刺激T细胞分泌IL－2，而LA795则不能；FLB2c细胞在体内能诱导CTL活性，其诱导CTL在体外对FLB2c细胞和LA795的杀伤率分别为34％－25．3％，而LA795诱导的CTL对FLB2c和LA795杀伤率分别为10．5％和12．25％，两者的杀伤率有显著性差异。结论：FLB2c细胞在体内外均能刺激T细胞免疫应答，其以能力明显强于未融合的LA795小鼠肺癌细胞，将其作为疫苗细胞将有可能通过提高机体免疫应答而达到治疗肺癌的效果。本研究为进一步探讨该疫苗的应用价值奠定了免疫学基础。     

Cytotoxic T Lymphocytes Elicited by Dendritic Cell-Targeted Delivery of Human Papillomavirus Type-16 E6/E7 Fusion Gene Exert Lethal Effects on CaSki Cells

Human papillomavirus (HPV) is the primary etiologic agent of cervical cancer. Consideration of safety andnon human leukocyte antigen restriction, protein vaccine has become the most likely form of HPV therapeuticvaccine, although none have so far been reported as effective. Since tumor cells consistently express the twoproteins E6 and E7, most therapeutic vaccines target one or both of them. In this study, we fabricated DCvaccines by transducing replication-defective recombinant adenoviruses expressing E6/E7 fusion gene ofHPV-16, to investigate the lethal effects of specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) against CaSki cells in vitro.Mouse immature dendritic cells (DC) were generated from bone marrow, and transfected with pAd-E6/E7 toprepare a DC vaccine and to induce specific CTL. The surface expression of CD40, CD68, MHC II and CD11cwas assessed by flow cytometry (FCM), and the lethal effects of CTL against CaSki cells were determined byDAPI, FCM and CCK-8 methods. Immature mouse DC was successfully transfected by pAd-E6/E7 in vitro,and the transfecting efficiency was 40%-50%. A DC vaccine was successfully prepared and was used to inducespecific CTL. Experimental results showed that the percentage of apoptosis and killing rate of CaSki cells weresignificantly increased by coculturing with the specific CTL (p <0.05). These results illustrated that a DC vaccinemodified by HPV-16 E6/E7 gene can induce apoptosis of CaSki cells by inducing CTL, which may be used as anew strategy for biological treatment of cervical cancer.     

靶向NSCLC EGFR exon20插入突变的新抗原疫苗筛选和功能研究

目的:筛选具有免疫源性HLA-A*02限制性表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)exon20插入突变编码的优势表位肽,为携带EGFR exon20插入突变的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)提供新的免疫治疗手段。方法:通过IEDB、NetMHC 4.0和SYFPEITHI软件,筛选EGFR exon20插入突变编码的HLA-A*02限制性表位,针对细胞毒性T淋巴细胞表位集中区域设计多肽疫苗,通过体外实验验证其免疫活性。结果:V769_D770insASV为EGFR exon20插入突变最高频突变位点(19.35%),经软件预测其编码的多肽YVMASVASV与HLA-A*02具有较强的结合力。围绕核心序列设计两条优势表位多肽E-ASV-10和E-ASV-19,体外可诱导HLA-A~*02限制性T细胞的扩增和活化,上调4-1BB^+CD25^+细胞比例,促进CD4^+、CD8^+T细胞IFN-γ的合成和释放。多肽E-ASV-10可刺激C57BL/6小鼠的T细胞分泌IFN-γ,对携带V769_D770insASV的小鼠NSCLC细胞LLCasv具有杀伤活性。结论:E-ASV-10和E-ASV-19多肽不仅可以在体外诱导人HLA-A*02限制性T细胞的扩增和活化,而且在C57BL/6小鼠中诱导特异性靶向携带V769_D770insASV突变的小鼠肺腺癌(lewis lung cancer,LLC)的杀伤性T细胞,提示其作为一种新的肿瘤疫苗或可用于治疗携带相应EGFR exon20插入突变的NSCLC,具有潜在临床应用前景。     

树突细胞对肿瘤浸润淋巴细胞抗乳腺癌免疫活性影响的研究

背景与目的:树突细胞(dendriticcell,DC)又称树突状细胞,是目前已知的功能最强的抗原呈递细胞,它可以在体内、外向T淋巴细胞呈递抗原,并诱发细胞毒T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)反应。本研究旨在探讨DC激活的肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocytes,TIL)体外对乳腺癌细胞的杀伤活性。方法:从乳腺癌患者外周血获取DC,应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)和肿瘤抗原激活DC,然后用DC激活TIL,观察TIL在体外对自体乳腺癌细胞和Bcap-37乳腺癌细胞的杀伤活性。结果:DC激活的TIL对自体乳腺癌细胞具有很强的杀伤活性,杀伤率为(85.76±2.93)%,明显高于未经DC激活的TIL、DC激活的T淋巴细胞和未经DC激活的T淋巴细胞对自体乳腺癌细胞的杀伤率犤分别为(52.11±1.48)%、(51.35±1.46)%和(3.59±0.25)%犦。而它们对Bcap-37乳腺癌细胞的杀伤活性则相对较低犤分别为(40.03±1.29)%、(22.09±0.87)%、(21.66±0.85)%和(1.76±0.14)%犦。结论:乳腺癌患者外周血DC能诱导TIL产生高效而特异的抗乳腺癌免疫活性。     

应用流式细胞术检测胃癌患者术中腹腔冲洗液脱落细胞的临床研究

  目的  应用流式细胞技术(flow cvtometry, FCM)对腹腔冲洗液进行DNA倍体分析, 作为胃癌腹腔脱落癌细胞(exfoliat-ed canceF cells, , ECC)检测的辅助手段为临床提供依据。  方法  收集62例胃癌患者术中腹腔冲洗液, 应用FCM进行脱落细胞DNA倍体分析, 同时行腹腔冲洗液细胞学(peritoneal lavage eytologv, PLC)检查, 比较二者的检测敏感度, 并分析FCM与胃癌不同临床病理特征的相关性。  结果  62例胃癌腹腔冲洗液流式细胞术DNA倍体分析检测阳性率为67.74%, 而PLC阳性率仅为33.87%, 两组差异有统计学意义(P < 0.001)肿瘤类型、浸润深度、受侵面积、淋巴结转移、脉管瘤栓、TNM分期与腹腔冲洗液异倍体肿瘤细胞相关(P均 > 0.05)在局限性胃癌、肿瘤浸润深度、浆膜受侵面积 < 10cm2、淋巴结转移、无脉管瘤栓、TNM分期方面腹腔冲洗液FCM检测阳性率优于PLC(P均 > 0.05)。  结论  流式细胞术可作为胃癌患者术中检测ECC的有效辅助诊断手段。      

前列腺癌冷冻消融联合抗CTLA-4抗体增强小鼠肿瘤引流淋巴结免疫反应的实验研究

  目的  评价前列腺癌冷冻消融联合抗细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4, CTLA-4）抗体对小鼠肿瘤引流淋巴结T细胞抗肿瘤免疫反应的影响。  方法  建立前列腺癌小鼠模型并随机分为空白对照（A）组、冷冻消融治疗（B）组、冷冻消融联合抗CTLA-4抗体治疗（C）组、抗CTLA-4抗体治疗（D）组。各组分别于治疗前及治疗后7、14、21天四个时间点取5只小鼠获取肿瘤引流淋巴结标本, 测量各组不同时间点肿瘤大小变化, 流式细胞术检测调节性T细胞（regulator T cell, Treg）和细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）比例变化, 乳酸脱氢酶（LDH）法检测CTL对肿瘤细胞的杀伤活性, 记录各组小鼠总生存期。  结果  治疗后14天与A组的Treg比例相比, B组（9.78%±1.88% vs. 6.02%±0.44%, ）、C组（9.78%±1.88% vs. 6.03%±0.45%）均下调（均P < 0.05）; 与A组的CTL比例相比, B组（27.34%±2.13% vs. 34.23%±1.15%）、C组（27.34%±2.13% vs. 52.21%±2.53%）、D组（27.34%±2.13% vs. 33.99%±1.21%）均上调（P < 0.05、P < 0.001、P < 0.05）; 与A组的CTL杀伤活性相比, B组（13.32%±3.39% vs. 26.36%±2.95%）、C组（13.32%±3.39% vs. 45.25%±3.27%）、D组（13.32%±3.39% vs. 25.31%±3.24%）均升高（P < 0.05、P < 0.001、P < 0.05）。同时小鼠生存分析显示, B组的生存时间（34.20±6.98）天和C组的（43.60±2.88）天较A组（25.60±1.52）天明显延长（P < 0.05和P < 0.001）, C组的生存时间（43.60±2.88）天较B组的（34.20±6.98）天明显延长（P < 0.05）。  结论  冷冻消融联合抗CTLA-4抗体可降低肿瘤引流淋巴结Treg比例, 提高CTL比例及其杀伤活性, 明显延长小鼠生存期, 其具体机制尚需进一步研究。