超低温冻存对人羊水间充质干细胞生物学特性的影响

目的 观察超低温冻存对人羊水间充质干细胞(AF-MSC)生物学特性的影响.方法 通过羊膜腔穿刺取得人孕16～23周羊水.分离培养出人AF-MSC.将第4代人AF-MSC经短期超低温冻存、复苏后,通过细胞活性率测定、形态学比较、细胞增殖功能测定、细胞周期分析及细胞表面抗原检测,观察超低温冻存对人AF-MSC生物学特性的影响.结果 第4代人AF-MSC冻存、复苏前后的两组细胞无论在细胞活性率、细胞形态、细胞增殖能力、细胞周期、细胞表面抗原的表达等方面均无显著性差异(P＞0.05).结论 短期的超低温冻存对人AF-MSC的生物活性无明显影响.     

短期冻存对大鼠骨髓基质干细胞的影响

目的 探讨不同冻存条件对大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）复苏后存活、增殖及向肝细胞分化能力的影响。方法比较用含不同浓度血清的冻存液冻存不同时间的BMSC8复苏后的存活率与贴壁率、增殖、向肝细胞分化能力。结果用血清浓度为90％的冻存液经不同时间冻存后的BMSCs复苏后的存活率、贴壁率最高，且其增殖及向肝细胞分化能力与正常对照组相比差异无统计学意义；而血清浓度为50％及20％时BMSCS复苏后的存活率、贴壁率较低，增殖及向肝细胞分化能力下降，与正常对照组相比差异有统计学意义。结论高浓度血清冻存液短期冻存对BMSCs的存活、增殖、分化能力影响较小，细胞复苏后可用于进一步研究。     

超低温冻存对大鼠骨髓细胞膜完整性及功能的影响

目的：研究超低温冻存后的大鼠骨髓细胞的细胞膜表面形态和功能的完整性。方法：采用超低温保存技术对大鼠骨髓细胞进行慢速、快速冻存比较。结果：以VS1作为快速冻存液，快速冻存骨髓细胞，不但快速简便，而且快速冻存较短时间的大鼠骨髓细胞的荧光强度以及膜表面形态与新鲜对照组及慢速冻存组相比差异无显性。结论：快速冻存法冻存骨髓细胞是可行的，本研究为快速冻存骨髓细胞的实际应用提供了一定的科学依据。     

人骨髓基质干细胞体外培养和生物学特性鉴定

目的 体外分离、纯化培养人骨髓基质干细胞(hBMSCs),对其表面标志物、多向分化特性进行鉴定,为骨组织工程提供理想的种子细胞来源.方法 抽取健康成人骨髓,采用全骨髓培养法,多次消化以纯化hBMSCs;应用流式细胞仪对细胞表面标志物进行检测;采用成骨、成软骨和成脂培养基进行三向诱导分化.结果 培养的第3代细胞表面抗原检测显示:表达CD106、CD166和CD29,不表达造血和内皮标志CD34、CD45和CD145在体外分别诱导出其向成骨、成软骨和成脂肪细胞分化.结论 hMSCs体外经分离传代培养后细胞成分较为单一,具有多向分化潜能,符合间充质干细胞的基本功能特征.     

人卵巢组织两种超低温冻存方法的研究

【目的】探索两种人卵巢组织冷冻方案用于生殖细胞保存的效果。【方法】活检卵巢组织来自15名经知情同意的手术患者。组织被随机分配到新鲜组、玻璃化冷冻组和慢速冷冻组。观察和比较各组卵巢组织冻融后的原始卵泡形态完整率，并通过体外培养系统测定培养液中的雌二醇和孕酮水平，观察和比较冻融后卵巢组织内分泌功能。【结果】本研究中新鲜组、慢速冻融组和玻璃化冻融组的原始卵泡形态完整率分别是97．6％、72．6％和80.3％。两冻融组与新鲜组相比明显下降俨〈0．001），而在两冻融组间差异并无统计学意义（P=0．237）。在体外组织培养期间，两种冻融卵巢组织都能持续分泌雌二醇和孕酮，两组间差异无统计学意义（P〉0．05）。【结论】本研究中两种人类卵巢组织超低温冷存的方法是可行的，可适应不同需要。     

人卵巢组织两种超低温冻存方法的研究

【目的】探索两种人卵巢组织冷冻方案用于生殖细胞保存的效果。【方法】活检卵巢组织来自15名经知情同意的手术患者。组织被随机分配到新鲜组、玻璃化冷冻组和慢速冷冻组。观察和比较各组卵巢组织冻融后的原始卵泡形态完整率,并通过体外培养系统测定培养液中的雌二醇和孕酮水平,观察和比较冻融后卵巢组织内分泌功能。【结果】本研究中新鲜组、慢速冻融组和玻璃化冻融组的原始卵泡形态完整率分别是97.6%、72.6%和80.3%。两冻融组与新鲜组相比明显下降(P<0.001),而在两冻融组间差异并无统计学意义(P=0.237)。在体外组织培养期间,两种冻融卵巢组织都能持续分泌雌二醇和孕酮,两组间差异无统计学意义(P>0.05)。【结论】本研究中两种人类卵巢组织超低温冷存的方法是可行的,可适应不同需要。     

低温冻存对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

目的比较人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)冻存前与复苏后的生物学特性,为规模化储备UC-MSCs提供试验支持。方法采用胶原酶消化法从脐带中分离UC-MSCs,贴壁培养传代,将第3代UC-MSCs利用程控降温仪冷冻,置于-196℃液氮中冻存6个月后复苏,比较冻存前和复苏后UC-MSCs的细胞形态、生长曲线、免疫表型及多向分化潜能等生物学特性。结果复苏后UC-MSCs仍呈成纤维样形态生长,生长曲线与冻存前相似;免疫表型仍高表达CD73、CD90、CD105,不表达CD34、CD45、CD40、CD80、CD86、CD154、HLA-DR;在特定的体外诱导条件下,仍可以向骨、脂肪、软骨分化。结论冻存复苏后UC-MSCs的生物学特性仍保持稳定。     

低温冻存对人脂肪间充质干细胞生物学特性的影响

目的: 比较人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)冻存前和复苏后的生物学特性,为今后建立低温干细胞库提供实验支持。方法： 采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化法从腹部大网膜脂肪组织中分离hADSCs,体外培养扩增,将处于均一稳定生长状态的第3代hADSCs置于液氮中分别冻存1、3和6个月,复苏后台盼蓝染色检测细胞存活率,采用MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面抗原,成脂成骨诱导后鉴定多向分化能力,RT PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2(peroxisome proliferator activated receptorγ-2,PPARγ-2)和成骨特异性基因骨钙素(osteocalcin,OC)的表达情况。结果： 随冻存时间的延长细胞存活率略有下降,但差异无统计学意义(P＞0.05)。MTT结果显示冻存前后细胞增殖能力均很强。流式细胞检测结果显示冻存前后细胞均高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166,低表达CD45和HLA-DR。冻存前后hADSCs均具有向脂肪细胞和骨细胞分化潜能,且RT-PCR结果显示,PPARγ-2和骨钙素mRNA的表达冻存前后差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论： 经液氮冻存后的hADSCs具有高存活率,生物学特性保持稳定且仍具有多向分化潜能。     

兔骨髓基质干细胞体外培养的生物学特性

目的：分离培养兔骨髓基质干细胞并探讨其体外生物学特性。方法：通过梯度密度离心法分离兔骨髓基质干细胞，体外培养、扩增，观察细胞的大体形态和超微结构；通过绘制细胞生长曲线、MTT实验来研究细胞的增殖能力争代谢活性。结果：兔骨髓基质干细胞呈梭形。胞质内有丰富的粗面内质网和线粒体，具有很强的增殖能力和代谢活性。结论：本实验方法取材方便，能较容易地获得大量的兔骨髓基质干细胞。     

细胞外基质对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的观察细胞外基质对MSCs贴壁、增殖和分化的影响，以期为MSCs建立一种更为理想的培养体系。方法用贴壁法分离纯化大鼠骨髓MSCs，所用培养皿预先用细胞外基质(明胶)处理过夜，以普通培养皿做对照，镜下观察细胞的生物学形态，计数细胞贴壁数目并描绘细胞生长曲线，观察细胞外基质对MCSs生长的影响。结果用细胞外基质处理过的培养皿MSCs，细胞的贴壁、增殖和分化速度都较普通组快，且细胞形态、活力和长势较普通组活跃。结论细胞外基质能明显促进MSCs的分离纯化，使体外扩增培养Mscs更为简单高效。     

体外诱导骨髓基质细胞向神经细胞分化的形态学观察

目的:探讨骨髓源性神经干细胞分化为神经细胞的可行性,为中枢神经组织损伤修复寻找种子细胞的理想来源.方法:无菌取成大鼠长骨骨髓,密度梯度离心分离后获得骨髓基质细胞(BMSC),在神经干细胞培养液及细胞因子等条件下诱导其分化为神经元样细胞.结果:增殖培养24～72h见细胞分裂像和克隆单位;继续增殖培养仍可见细胞克隆(干细胞特性);诱导培养第10日有成熟神经细胞形成.说明BMSC在体外培养条件下,经过多种因子的"程序性"作用,可以向神经干细胞、成熟神经元及胶质细胞方向分化.结论:在适宜培养条件及诱导因子联合作用下,BMSC可成功诱导出神经元样细胞.     

去势大鼠骨髓基质干细胞分离培养鉴定及增殖特性的变化

目的:对去势大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)进行分离培养鉴定,研究去势后大鼠BMSCs增殖特性的变化.方法:以去势大鼠作为绝经后骨质疏松症模型,分为去势组和假手术组.密度梯度离心分离骨质疏松大鼠的BMSCs,利用BMSCs的多向分化培养及流式细胞仪分析对去势大鼠BMSCs进行鉴定,倒置相差显微镜观察细胞增殖情况,MTT法测量两组BMSCs增殖能力.结果:去势组大鼠体质量、雌二醇及整体股骨骨矿物质密度(BMD)与假手术组比较差异有显著性(P＜0.01),诱导培养后两组大鼠BMSCs油红O染色和Von Kossa's染色实验阳性,流式细胞仪显示骨髓间充质细胞具有的表面抗原CD29和CD44阳性而造血干细胞具有的表面抗原CD45和CDl33为阴性.MTT法测定在7 d内,去势组细胞的增殖速率要高于假手术组.结论:成功建立了大鼠骨质疏松模型.采用成骨诱导和成脂诱导也进一步证实了所分离的细胞为具有多向分化潜能的BMSCs.去势后3mo大鼠BMSCs增殖能力增强.     

羟乙基呱嗪乙硫磺酸对人骨髓间充质干细胞纯化培养的影响

目的：探讨羟乙基呱嗪乙硫磺酸对人骨髓间充质干细胞(hMSC)纯化培养的影响。方法：采用全髓直接接种法分离培养13～18周胎龄水囊引产新鲜胎儿股骨骨髓，贴壁细胞达90％以上融合时消化传代。传代细胞分别接种于含100ml／L胎牛血清的L-DMEM培养基(常规培养基)和加入15mmol／L羟乙基呱嗪乙硫磺酸(Hepes)的常规培养基(改良培养基)中，观察细胞生长情况，用酸度计监测培养基pH值变化情况，流式细胞仪鉴定细胞纯度及CD抗原表达情况。并诱导改良培养基培养的hMSC向成骨细胞分化，酶细胞化学法和全自动生化仪检测碱性磷酸酶(ALP)活性，鉴定hMSC的成骨分化能力。结果：2种培养基培养的hMSC在细胞形态、生长特性、CD抗原表达等方面相似，但改良培养基由于pH值较恒定而能提高hMSC纯度及细胞增殖速度，且诱骨分化后可形成矿化结节，ALP染色阳性。结论：Hepes能提高全髓直接接种法培养的hMSC纯度及细胞增殖速度，简化骨髓细胞分离程序，减少细胞损伤及受污染机会，利于hMSC培养的推广应用。     

成人骨髓基质细胞体外培养及鉴定

目的 :探讨简易的成人成骨细胞体外培养方法 ,为进一步研究成骨细胞及骨组织工程提供技术平台。方法:手术中抽取健康成人骨髓组织 ,采用全骨髓培养法在体外进行培养 ,细胞汇合后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素 C的条件培养基进行传代培养 ,观察细胞增殖和分化情况 ,并对细胞进行鉴定。结果:培养的成人成骨细胞表现出成骨细胞的形态特征 ,细胞碱性磷酸酶 (AL P)阳性率为 6 8% ,经 Von Kossa's染色证实其能最终形成钙结节。结论:全骨髓培养法所培养的细胞具有成骨细胞的特性 ,可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法。     

血清浓度对小鼠骨髓干细胞生物特征的影响

目的：研究不同血清浓度处理对小鼠骨髓干细胞生物特性的影响。方法小鼠全骨髓培养法培养细胞,原代细胞用10%、15%、20%血清体积分数的培养基,观察细胞形态及增殖情况。结果细胞在血清浓度为10%的培养基中增殖速度快,细胞形态以梭型为主;血清浓度为20%时细胞胞体面积增大,且增殖速度减慢。结论体外培养小鼠骨髓干细胞的最佳血清体积分数为10%。     

骨形态发生蛋白对人骨髓基质细胞的体外成骨分化影响

目的 提取牛骨形态发生蛋白，并观察其对人骨髓基质细胞的体外成骨分化作用，为将骨形态发生蛋白与骨髓基质细胞用于进一步的缺损修复研究提供实验依据。方法 从小牛骨中的提取骨形态发生蛋白，配制条件培养液，并作用于培养状态的人骨髓基质细胞，染色检测细胞碱性磷酸酶，I型胶原表达情况，放免法测定培养液中骨钙素含量。结果 人骨髓基质细胞经衣导培养后，碱性磷酸酶，I型胶原，骨钙素表达明显增加。结论 体外培养时，天然骨形态发生蛋白可促进人骨髓基质细胞的成骨分化。     

髓内脂肪细胞对骨髓基质细胞超微结构的影响

目的 研究来源于骨髓基质细胞的髓内脂肪细胞对其超微结构的影响。方法向骨髓基质细胞的培养板中加入不同浓度(0，10^3，10^4，10^5，10^6／mL)的脂肪细胞悬液，共培养12d，每4d取单层细胞爬片，经固定、脱水、原住包埋，超薄切片后电镜观察骨髓基质细胞细胞超微结构。结果共培养体系中，骨髓基质细胞表面绒毛及伪足减少，线粒体数目增加用轻度肿胀，细胞核浓聚，染色质边集，核型不规整甚至碎裂。结论从形态学上证实了脂肪细胞能改变骨髓基质细胞的超微结构。     

人骨髓基质细胞软骨诱导分化及其与细胞载体体外复合

目的：观察出生后入骨髓基质细胞（hBMSCs）在体外培养条件下增殖与分化的特点，探讨其向成软骨方向分化及机制。研究诱导细胞体外与PDLLA/壳聚糖多孔材料复合。方法：密度梯度离心法进行hBMSCs体外培养。应用传五代细胞，经化学限定培养基诱导细胞，设实验对照组。采用倒置显微镜观察细胞增殖及形态变化，甲苯胺蓝染色观察诱导细胞合成细胞外基质中的蛋白多糖，RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA的表达。将诱导的细胞分别与多孔羟基磷灰石、PDLLA/壳聚糖多孔材料复合，应用扫描电镜观察其在细胞载体表面的生长情况。结果：传五代hBMSCs经化学限定培养基诱导后转化成圆形肥大细胞，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原mRNA表达与对照组比较有统计学意义。扫描电镜发现hBMSCs在PDLLA/壳聚糖多孔材料表面增殖良好并分泌大量细胞基质。结论：体外培养hBMSCs经化学限定培养基诱导后可向成软骨方向分化，可作为软骨组织工程种子细胞。PDLLA/壳聚糖多孔复合材料是组织工程良好的细胞载体，有利于细胞的黏附与增殖。