超低温冻存对人羊水间充质干细胞生物学特性的影响

目的 观察超低温冻存对人羊水间充质干细胞(AF-MSC)生物学特性的影响.方法 通过羊膜腔穿刺取得人孕16～23周羊水.分离培养出人AF-MSC.将第4代人AF-MSC经短期超低温冻存、复苏后,通过细胞活性率测定、形态学比较、细胞增殖功能测定、细胞周期分析及细胞表面抗原检测,观察超低温冻存对人AF-MSC生物学特性的影响.结果 第4代人AF-MSC冻存、复苏前后的两组细胞无论在细胞活性率、细胞形态、细胞增殖能力、细胞周期、细胞表面抗原的表达等方面均无显著性差异(P＞0.05).结论 短期的超低温冻存对人AF-MSC的生物活性无明显影响.     

冻存骨髓基质细胞体外成骨潜能的实验研究

目的 观察冻存骨髓基质细胞（BMSC）的体外生长特点及诱导与非诱导条件下的成骨能力。方法 取冻存11个月犬BMSC复苏后进行体外扩增培养，传代培养中加入10^-8mol／L地塞米松、50mg／L Vit C和10mmol／L β-甘油磷酸钠进行诱导分化，观察细胞形态、细胞诱导前后增殖情况、细胞碱性磷酸酶（ALP）含量以及形成矿化结节能力的改变。结果 冻存BMSC复苏后呈成纤维样表现，增殖力强。在诱导液的作用下冻存BMSC增殖性能降低，ALP活性增加，诱导5d后可见矿化结节。结论 冻存BMSC增殖能力强，经诱导后表现出明显的成骨活性，可作为骨组织工程的种子细胞。     

短期冻存对大鼠骨髓基质干细胞的影响

目的 探讨不同冻存条件对大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）复苏后存活、增殖及向肝细胞分化能力的影响。方法比较用含不同浓度血清的冻存液冻存不同时间的BMSC8复苏后的存活率与贴壁率、增殖、向肝细胞分化能力。结果用血清浓度为90％的冻存液经不同时间冻存后的BMSCs复苏后的存活率、贴壁率最高，且其增殖及向肝细胞分化能力与正常对照组相比差异无统计学意义；而血清浓度为50％及20％时BMSCS复苏后的存活率、贴壁率较低，增殖及向肝细胞分化能力下降，与正常对照组相比差异有统计学意义。结论高浓度血清冻存液短期冻存对BMSCs的存活、增殖、分化能力影响较小，细胞复苏后可用于进一步研究。     

改良hela细胞冻存与复苏方法的实验研究

目的:建立一种改良的hela细胞冻存和复苏的方法.方法:取生长状态良好的HELA细胞分别进行传统和改良方法冻存,于冻存后1年分别行传统和改良的复苏方法.用MTT法测细胞生长曲线,应用两因素析因分析统计方法评定不同冻存方法、不同复苏方法单独和/或组合对细胞复苏率的影响.结果:HELA体外生长良好.电镜观察细胞超微结构没有明显改变.细胞的复苏率均受不同冻存方法和复苏方法单、双因素影响.冻存复苏后生长曲线良好.结论:改良后的HELA冻存和复苏方法可使细胞保持最佳生物学特性,细胞的复苏率高,适合用于体外实验研究.     

大体系冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞免疫表型及细胞杀伤活性的影响

目的探讨大体系(50 mL)冻存对细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞免疫表型及细胞杀伤活性的影响。方法采集6例健康志愿者的外周血,采用Ficoll法分离得到单个核细胞,用细胞因子诱导培养CIK细胞。收集冻存1个月后复苏的CIK细胞,采用流式细胞术检测其冻存前后的细胞活率和免疫表型;通过与乳腺癌细胞共培养(效靶比10∶1和40∶1)的方法测定其杀伤活性,与新鲜未冻存的细胞杀伤活性进行比较,同时并对不同效靶比冻存前后的细胞杀伤活性进行比较。结果 CIK细胞大体系冻存前平均细胞活率(97.79±1.92)%,显著高于复苏后的(83.61±3.42)%(P<0.05)。复苏后CIK细胞中CD3~+、CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+、CD3~+CD56~+表型CIK细胞所占比例虽较冻存前稍有降低,但差异均无统计学意义(P>0.05)。效靶比10∶1、40∶1时冻存前细胞和复苏后细胞杀伤率比较差异均无统计学意义(P>0.05);效靶比40∶1时冻存前细胞和复苏后细胞杀伤率均显著高于效靶比10∶1时(P<0.05)。结论大体系(50 mL)冻存对于CIK细胞活率虽有影响,但对免疫表型和细胞活性均未影响。     

HL60细胞冻存复苏生物学特性对比分析

目的探讨不同冻存复苏条件对白血病细胞株HL60生物学特性的影响,并优化培养方法与条件。方法对比不同浓度DMSO冻存条件、不同复苏方法对复苏后细胞生物学特性的影响,并确定培养液血清最佳浓度。结果采用5%DMSO冻存防护效果好于其他组,改良后细胞的复苏存活率明显高于传统复苏方法。结论以5%DMSO作为HL60细胞冻存保护剂并采用改良复苏方法,可使细胞保持最佳生物学特性,12%血清为HL60细胞常规培养的最适浓度。     

骨髓基质细胞体外培养及成骨特性研究

目的 建立兔骨髓基质细胞(BMSC)向成骨细胞转化的体外培养方法，并观察其体外的成骨特性。方法 利用静置贴壁原理进行BMSC的体外培养，汇合后传代，部分细胞改用条件培养液继续培养。对培养的细胞进行形态学观察和组织学检测，并观察条件培养液对BMSC的功能影响。结果 条件培养液组细胞碱性磷酸酶(ALP)染色阳性，细胞重叠生长形成多层结构，伴有散在的矿化结节形成。条件培养液组细胞ALP染色率及活性较完全培养液组高，但增殖率相对降低。结论 培养的BMSC经诱导具有体外成骨能力。地塞米松、β甘油磷酸钠和维生素C可促使BMSC转化为成骨细胞，但抑制BMSC的增殖速度。     

分离人肝细胞的超低温保存

目的　探索一种肝细胞超低温冻存的方法。方法　将分离的肝细胞洗涤 (5 0×g ,3min)后 ,用自制配方的肝细胞保存液制成悬浮液 ,置于 -80℃超低温冰箱内冻存 ,两周后取冻存的肝细胞常规方法复苏 ,台盼蓝染色、计数 ,普通方法接种培养观察 ,以同期分离的细胞接种培养为对照。结果　冻存的肝细胞解冻后存活率较高 ,经台盼蓝染色其活率为 95 %± 1% ,接种培养的细胞贴壁率为 80 %± 2 % ,其白蛋白的合成功能与对照组的白蛋白合成功能差异无显著性 ,细胞生长良好。结论　人肝细胞可在 -80℃超低温条件下保存 ,这可望成为贮存肝细胞的有效办法之一。     

成年大鼠神经干细胞的冷冻复苏及生物学特性观察

目的 建立成年大鼠神经干细胞冷冻复苏方法，观察冻存复苏后神经干细胞的活力及生物学特性。方法 采用10％BSA 8％DMSO做冷冻保护剂，于液氮中冻存；采用细胞培养和免疫细胞化学方法观察冻存复苏后细胞的活力、形态、分化能力及特异性抗原表达。结果 不同的冻存时间、细胞代数对冻存后细胞的存活率没有明显影响；冻存复苏的神经干细胞不仅有较高的存活率，而且仍保持其原有的生物学特性。结论 成年大鼠神经干细胞的冻存并不影响其活力及原有的生物学特性。     

大鼠脂肪干细胞冷冻复苏后的生物学特性及成骨细胞分化潜能的研究

目的 研究冻存复苏后大鼠脂肪干细胞（ADSCs）的生物学特性及其体外诱导成骨细胞分化的潜能。方法 冷冻保存6 个月的大鼠ADSCs 复苏后传代培养,显微镜下观察细胞形态;CCK8 检测细胞增殖,流式细胞仪检测CD44,CD105。第3 代细胞诱导成骨培养2 ～ 3 周后碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色,观察成骨情况。结果 复苏后ADSCs 形态类似成纤维细胞,增殖迅速。成骨诱导培养后表现出成骨细胞特性,ALP 染色活性增加,茜素红染色出现矿化结节。结论 冷冻保存复苏后的ADSCs 细胞生物性能稳定,定向诱导后可分化为 成骨细胞,可作为骨组织工程的种子细胞。     

兔骨髓基质细胞的体外培养

目的 :比较用全骨髓法和离心法培养兔原代骨髓基质细胞 (BMSC)的差异 ,同时观察BMSC在体外培养时的生长特征及体外诱导为成骨细胞的可能性。方法 :抽取新西兰大白兔骨髓 ,分别用全骨髓法和密度梯度离心法进行原代培养 ,比较第 12d收获细胞的数量。传代后观察 1～ 6代细胞的生长特征 ,绘制生长曲线 ,测定分裂指数和贴壁率 ;同时将部分第 3代细胞进行诱导培养 ,第 16d计算碱性磷酸酶 (ALP)阳性细胞率。结果 :全骨髓法较离心法收获细胞数量少 (P <0 .0 5 ) ,1～ 6代细胞的生长特征相似 ,增殖能力强。第 3代细胞被成功地诱导为成骨细胞 ,第 16dALP阳性细胞率为 80 %。结论 :离心法较全骨髓法培养BMSC可得到较多的细胞 ,两种方法得到的细胞前 6代细胞均有较强的增殖能力 ,并可以诱导为成骨细胞 ,可作为骨组织工程用的种子细胞     

去抗原异种松质骨的生物相容性研究

目的：了解去抗原异种松质骨（antigen—extracted xenogeneic cancellousbone,AEXCB）对骨髓基质细胞增殖的影响,为细胞移植载体的选择提供依据。方法：取新生小牛股骨下端松质骨,经物理化学处理,制成去抗原异种松质骨载体,与兔骨髓基质细胞bone marrow stromalcells,BMSC）体外复合培养,通过扫描电镜、MTF测试法、考马斯亮蓝和碱性磷酸酶（ALP）活性检测法,观察去抗原异种松质骨材料对细胞生长、增殖及功能表达的影响。结果：骨髓基质细胞能在AEXCB材料上粘附、增殖,细胞形态良好。去抗原异种松质骨与BMSC作用后ALP活性的吸光度（OD）值,与对照组比较无显著差异。结论：去抗原异种松质骨材料无细胞毒性作用,具有良好的细胞相容性,可用作骨组织工程的支架材料。     

骨髓基质细胞体外成骨的实验研究

目的 研究骨髓基质细胞体外培养的成骨能力,为细胞移植修复骨缺损提供一条新途径。方法 取新西兰大白兔股骨大转子处骨髓,进行体外培养,纯化,10－14天后进行转代。培养后的细胞经倒置显微镜,透射地镜,钙染色,碱性磷酸酶染色等方法进行观察。结果 培养纯化后的细胞呈梭形,多角形,电镜显示具有分泌功能旺盛的结构,碱性磷酸酶染色强阳性,培养3－4周后,能形成钙结节。细胞在体外能多次传代,维持成骨表型。结论 骨髓基质细胞在体外培养纯化后,骨与成骨细胞相似的形态结构和生物学特性,能形成钙化的骨样组织。     

大鼠骨髓间充质干细胞原代培养及成骨成脂分化能力染色鉴定

目的：实验旨在建立一套简便有效的骨髓间充质干细胞原代培养、诱导分化及染色方法,观测骨髓间充质干细胞生物学特性,及其成骨、成脂分化潜能,为后续进行骨髓间充质干细胞基因修饰实验做好准备。方法本实验通过全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞,并用诱导分化培养液做定向诱导培养,观察骨髓间充质干细胞向成骨及成脂肪细胞分化过程中的细胞形态学变化,进行成骨成脂细胞染色鉴定,以探讨骨髓间充质干细胞的分离培养方法、生长规律及向成骨成脂细胞分化的条件。结果(1)通过全贴壁法成功进行了骨髓间充质干细胞原代及传代培养并绘制出第4代细胞生长曲线;(2)通过茜素红染色验证了骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;(3)通过油红O染色验证骨髓间充质干细胞的成脂分化能力。结论全贴壁法提取的大鼠骨髓间充质干细胞经传代4次左右可达到一定纯度,在一定诱导条件下,经特定染色方法鉴定,可分化为成骨细胞,成脂细胞。     

碱性成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞粘附、增殖和分化的影响

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）对骨髓基质细胞（ＢＭＳＣ）粘附、增殖和分化等生物学效应的影响。方法利用体视学计数、四唑盐（ＭＴＴ）比色法及碱性磷酸酶（ＡＬＰ）试剂盒分别测定不同浓度ｂＦＧＦ诱导一定时间后ＢＭＳＣ的粘附特性、增殖和分化情况的变化。结果１０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ明显促进ＢＭＳＣ的粘附,但是２００ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ反而不利于细胞粘附;在细胞增殖和分化测定中,１００ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ明显促进细胞增殖但细胞碱性磷酸酶含量也最低。结论碱性成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞的生物效应是复杂和多方面的,可以作用于骨髓基质细胞的粘附、增殖和分化等多个环节,这种影响与碱性成纤维细胞生长因子的剂量有关。     

非诱导条件下犬骨髓基质细胞的生物学特性

目的 研究体外培养骨髓基质细胞(BMSC)的生长特点和非诱导条件下的成骨特性。方法 采用犬来源BMSC体外扩增培养，观察非诱导条件下BMSC生长变化和成骨分化。结果 形态学观察表明，BMSC贴壁细胞呈集落生长，有成纤维细胞样外观，未加入成骨诱导剂，细胞形态发生变化，钙沉积出现，碱性磷酸酶(ALP)表达。3代内扩增的BMSC有成骨活性，但原代细胞成骨活性优于传代后细胞。结论 体外培养BMSC能大量扩增，具有自然向成骨细胞分化的能力，是骨组织工程理想的种子细胞。本实验所培养的BMSC具有骨祖细胞特性。     

大鼠骨髓基质细胞的体外分离、培养和鉴定的实验研究

目的:观察大鼠骨髓基质细胞在体外培养的条件及生物学特性并加以鉴定.方法:取Wistar大鼠骨髓,分离培养骨髓基质细胞(BMSC),相差显微镜下观察其形态,传代后观察其生长特性,用免疫组化方法加以鉴定.结果:原代培养20d后可分离得到BMSC,在5代以前生长形态相对稳定,典型的BMSC可分为两个类型.结论:BMSC具有贴壁生长特性,较易对其进行分离扩增,增殖速度快,可用于多种疾病的细胞治疗.     

低温对人脐血内皮祖细胞的影响

目的将人脐血中分离培养出的内皮祖细胞进行低温保存和快速复苏,建立EPC细胞系,比较冻存前后细胞形态及生物学功能是否改变。方法采集人脐血,分离出单核细胞,对细胞进行冻存和复苏,测定内皮祖细胞增殖能力及黏附能力。结果内皮祖细胞经冻存和复苏后测得细胞的存活率为（84.17±4.02）%,细胞的形态学未见明显改变;与未冻存的细胞相比,刚复苏后即行增殖和黏附能力的检测,细胞的增殖和黏附能力有显著变化,P〈0.05;细胞复苏后继续培养48h行增殖和黏附能力检测,两者未见明显差异,P〉0.05。结论对低温保存后复苏的EPC,立即行增殖和黏附能力检测其能力均降低,复苏后继续培养48h再次检测未见明显差异。     

重组人甲状旁腺激素1-34促进小鼠间充质干细胞增殖及骨向分化

目的研究重组人甲状旁腺激素1-34[recombinant human parathyroid hormone1-34,rhPTH(1-34)]间断处理对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cell,BMSC)增殖以及骨向分化的影响,进一步探讨rhPTH(1-34)促骨形成的机制。方法无菌条件下分离6～8周的C3H雄性小鼠BMSC,传代培养,10 nmol/L rhPTH(1-34)间断处理或者Vehicle处理,MTT检测细胞增殖;BMSC成骨诱导后,分别在3、6、9 d进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和活性测定;RT-PCR检测成骨细胞功能标志基因核心结合因子α1(core binding factorα1,Cbfα1)、骨桥蛋白(osteopontin,OP)、骨钙素蛋白(osteocalcin,OC)的表达水平;Western blot检测p-Erk1/2,p-P38信号通路。结果 rhPTH(1-34)间断处理促进BMSC增殖;诱导9 d时与对照组比较,显著增加ALP活性[D(405)/D(562):(0.625±0.049)vs(0.543±0.038),(P<0.05)];显著增加成骨功能相关基因Cbfα1(增加186.6%,P<0.01),OC(增加210.5%,P<0.01),OP mRNA(增加5.5%,P<0.05)的表达水平;p-Erk1/2,p-P38水平均增加。结论 rhPTH(1-34)间断处理通过激活下游的p-Erk1/2和p-P38通路,促进BMSC增殖,增强其向成骨细胞分化,使成骨细胞数量和活性增加,从而增加骨形成达到治疗骨质疏松的目的。     

不同浓度碱性成纤维细胞生长因子对兔骨髓基质细胞的影响

目的：观察骨髓基质细胞的培养及不同浓度碱性成纤维生长因子（bFGF）对其生长的影响。方法：采用全麻下抽取兔股骨骨髓，经体外培养的方法并在培养注保加入４种不同浓度的bFGF(0,60,120,240ng/ml)培养后经倒置显微镜观察；并用试剂盒测定细胞碱性磷酸酶的含量。结果：６０、１２０ng/ml的bFGF能明显促进骨髓基质细胞的生长（Ｐ＜0．01），其余两组无明显差异。而4组之间的细胞碱性磷酸酶含量在3天无明显差异，6天时加入bFGF组的细胞碱性磷酸酶含量明显下降。结论：bFGF对骨髓基质细胞的影响是复杂和多方面的；不同剂量浓度对骨髓基质细胞生长的影响亦不一样，并不呈正相关，合适的有效浓度为60－120ng/ml。