EB病毒壳抗原在大肠杆菌中的表达与应用

目的;获得足够的ＥＢ病毒壳抗原,建立ＥＬＩＳＡ方法用于鼻咽癌的诊断,方法：将ＢＡＬＦ４基因克隆进入载体ｐＵＲ２９１,在大肠杆菌中表达ＥＢ病毒壳抗原与β－半乳糖苷酶的融合蛋白,并通过ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ离子交换柱层析对融合蛋白进行纯化,将纯化的蛋白用于ＥＬＩＳＡ方法检测人血清中的ＩｇＧ／ＶＣＡ和ＩｇＡ／ＶＣＡ抗体,用带有ｐＵＲ２９１质粒的宿主菌裂解液吸收待血清中的抗β－半     

EB病毒壳抗原在大肠杆菌中的表达及纯化

本文报告对EB病毒壳抗原(VCA)带有抗原决定簇的蛋白质在大肠杆菌中的表达及其纯化。以纯化后的蛋白为抗原检测人血清中VCA/IgA抗体,鼻咽癌病人及某些急性EB病毒感染人群呈抗体阳性.而对照组呈阴性。这一结果提示VCA蛋白在鼻咽癌的普查中有应用价值。     

EB病毒壳抗原抗体定性检测在鼻咽癌筛查中的作用

目的研究EB病毒壳抗原抗体定性检测在鼻咽癌筛查中的作用。方法选取我院2011年1月具有广州市户籍健康查体者血清2107份,采用酶联免疫法定性检测EB病毒壳抗原抗体表达,对于EB病毒壳抗原抗体阳性者行间接鼻咽镜检查,必要时行鼻内镜下鼻咽活检。结果 EB病毒壳抗原抗体阳性血清601份,阳性率为28.5%;其中男性388份,阳性率为30.3%;女性213份,阳性率为25.8%。189人完成间接鼻咽镜检查,2人经活检证实为鼻咽癌。结论定性检测EB病毒壳抗原抗体诊断价值有限,不适合用于鼻咽癌筛查。     

抗EB病毒口服液对EB病毒抗原表达的抑制作用及其细胞毒作用

目的 观察抗EB(Epstein-Barr)病毒口服液对EB病毒抗原表达的影响及对鼻咽癌CNE2细胞的细胞毒作用。方法 用间接荧光法测定抗EB病毒口服液对Raji细胞早期抗原(early antigen，EA)表达及B95-8细胞病毒壳抗原(virus capsid antigen，VCA)表达的影响；用MTT法测定其对鼻咽癌CNE2细胞的细胞毒作用。结果 抗EB病毒口服液在无毒的浓度下，对Raji细胞EB病毒EA抗原表达有较强的抑制作用，其IC50值为0．667mg／mL：对B95-8细胞EB病毒VCA抗原表达有较强的抑制作用。其IC50值为0．89mg／mL；对正丁酸钠激发的B95-8细胞EB病毒VCA抗原表达亦有较强的抑制作用，其IC50为1．1mg/mL。抗EB病毒口服液对人鼻咽癌细胞CNE2的IC50为7．57mg／mL。结论 抗EB病毒口服液能抑制EB病毒抗原的表达,在较高的浓度下对鼻咽癌细胞CNE2具细胞毒作用。     

黄芪抑制EB病毒壳抗原在体外细胞中表达的作用

目的：探讨黄芪抑制EB病毒（EBV）壳抗原在体外细胞中表达的作用。方法：采用间接免疫酶法研究黄芪提取液对B95－8细胞壳抗原表达的抑制作用。结果：无毒性浓度的黄芪提取液对巴豆油。正丁酸联合激发的EB病毒壳抗原表达有明显抑制作用。抑制率随药物浓度增加而提高,结论：黄芪抑制EBV壳抗原表达效果好,有望在鼻咽癌预防方面起一定作用。     

大肠杆菌β-半乳糖苷酶ED和EA的克隆、表达及活性测定

目的：制备大肠杆菌β-半乳糖苷酶（β- galactosidae）酶供体(ED)和酶受体(EA)片段,获得具有全酶活性的β-半乳糖苷酶。方法：以pSV-β- galactosidase control vector为模板设计引物,用PCR方法获得ED和EA片段DNA序列,插入克隆载体pGEM-T-easy中,获得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段分别插入原核表达载体pET20b+,并转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导表达出ED、EA融合蛋白,以亲和层析纯化蛋白,通过ED与EA蛋白形成β-半乳糖苷酶、全酶活性试验来判断ED、EA的功能。结果：获得与pSV-β- galactosidase control vector一致的ED、EA碱基序列,构建了重组表达质粒pET20b-ED及pET20b-EA,并分别转化入大肠杆菌DE3,以IPTG诱导行SDS-PAGE电泳,在相对分子质量为14 000及116 000处分别可见ED蛋白和EA蛋白条带,应用镍凝胶亲和层析纯化获得目的蛋白。结论：成功地制备了ED、EA蛋白,形成全酶活性的β-半乳糖苷酶。     

腺相关病毒rAAV-LacZ转导体外培养的骨髓内皮祖细胞

目的:研究表达β-半乳糖苷酶的重组腺相关病毒(rAAV-LacZ)对于体外培养的骨髓内皮祖细胞(EPCs)的转导效率。方法:将pAAV-LacZ、pAAV-helper、pAAV-RC用磷酸钙法共转染HEK293细胞,得到rAAV-LacZ;用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提法浓缩纯化病毒;用AVSachTMELISA法rAAV2颗粒滴度测定试剂盒测定rAAV-LacZ的滴度;用不同MOI值(1.0×104~1.0×106v.g/cell)的病毒感染EPCs,48 h后,用β-Gal ELISA试剂盒测定β-半乳糖苷酶的表达,原位-βgal染色试剂盒染色,根据蓝染的阳性细胞占细胞总数的比率来估计rAAV-LacZ对于EPCs的转导效率。结果:rAAV-LacZ的滴度为9.6×1012v.g.ml-1;rAAV-LacZ对于EPCs的转导率约为60%,当MOI增加到106v.g/cell时,-βGal的表达量增至(31.40±2.51)ng.mg.protein-1。结论:rAAV-LacZ能够有效的转导EPCs,这为AAV载体应用于细胞生长因子与EPCs联合治疗缺血性血管疾病提供实验基础。     

EB病毒潜在膜蛋白在胃贲门腺癌组织中的表达

应用Ｓ－Ｐ免疫组化方法对８０例贲门腺癌进行抗ＥＢ病毒潜在膜蛋白单克隆抗体的检测。结果显示：癌组织阳性１４例，阳性部位主要位于癌细胞膜和胞浆内。对ＥＢＶ感染病例的形态学特征进行描述，并讨论ＥＢＶ与癌发生的联系。     

EB病毒不同抗原IgA抗体检测在鼻咽癌诊断中的作用

目的 探讨EB病毒壳抗原(VCA)、早期抗原(EA)和核抗原潜伏蛋白(EBNA1)免疫球蛋白A抗体(IgA)的检测对鼻咽癌血清学诊断的意义.方法 应用免疫酶法(IE)和酶联吸附试验(ELISA)检测326例鼻咽癌患者、1290例非鼻咽癌门诊患者、职工体检767例血清中EB病毒VCA/IgA、EA/IgA、NA1/IgA抗体.结果 鼻咽癌患者VCA/IgA、EA/IgA、EBNA1/IgA抗体阳性率分别为97.9%、81.9%、和87.7%;非鼻咽癌患者组为18.0%、0.2%、和15.3%;对照组为5.1%、0、13.8%.鼻咽癌组的三种IgA抗体阳性率均分别高于非鼻咽癌组和对照组(P<0.001),非鼻咽癌组的VCA/IgA抗体阳性率亦高于对照组(P<0.001).检测VCA/IgA的灵敏度和特异度为97.9%和94.9%;EA/IgA为81.9%和100%;EBNA1/IgA为87.7%和86.2%.结论 VCA灵敏度和特异度都在较高的水平;EA灵敏度低特异度高;EBNA1灵敏度和特异度不及VCA,提示免疫酶法检测VCA/IgA抗体仍然是鼻咽癌血清学诊断中理想的方法,ELISA法EBNA1/IgA检测灵敏度和特异度比前者低有待进一步改进.     

CTLA—4在大肠杆菌中的克隆和表达

目的 在原核表达系统大肠杆菌中表达具有生物活性的人毒性T淋巴细胞相关蛋白－4可溶性部分（human soluble CTLA-4)。方法 PCR扩增获得CTLA－4编码基因,利用表达载体pGEX－2T构建重组质粒2TC,在所获DNA片段与文献报道CTLA－4序列一致。在重组大肠杆菌中0．10mmol/L IPTG诱导4h可大量生成相对分子质量40000的GST－CTLA4融合蛋白。Westen blot分析表明原核表达产物CTLA－4具抗原抗体结合活性。结论 hsCTLA－4可在原核表达系统中表达并具有免疫活性。     

EB病毒核抗原1优势表位区段抗原的克隆表达及其在鼻咽癌诊断中的应用

目的制备高活性EB病毒核抗原1(Epstein-Barr virus nuclear antigen 1, EBNA1)的优势表位区段抗原,并初步评价该抗原在鼻咽癌诊断中的应用价值。方法利用生物学软件BIOSUN分析EBNA1抗原的B细胞表位分布,并从中选取含有优势表位的抗原区段。然后利用分子生物学技术构建含有优势表位区段序列的原核表达质粒并进行表达,获得纯化优势表位抗原,采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)初步评价优势表位区段抗原的检测性能。结果成功构建含有优势表位抗原区段序列的原核表达质粒,获得了可溶性表达的EBNA1优势表位区段抗原NA-2(401~641 aa)。通过间接ELISA法对小量样本进行验证,确定NA-2抗原针对EBNA1-IgA抗体具有较高的抗原活性和特异性,较EBNA1-IgG和EBNA1-IgM抗体而言,能够较好地区分鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)和健康对照样本。放大样本量进行检测,基于NA-2抗原的EBNA1-IgA抗体间接ELISA方法检测灵敏度和特异性分别为90.38%和91.58%,EBNA1-IgA抗体检测的AUC值为0.942。结论获得EBNA1优势表位区段抗原NA-2,该抗原是优选的可以用于EBNA1-IgA检测的抗原,利用该抗原所建立的间接ELISA检测方法可以很好地区分鼻咽癌患者和健康对照。     

猴免疫缺陷病毒衣壳蛋白p27在大肠杆菌中的表达及纯化

目的获得用于SIV检测的衣壳蛋白p27重组抗原。方法利用生物信息学软件选择衣壳蛋白p27抗原表位集中的区域,合成SIV p27基因;将该基因与pMAL-p5x载体连接构建pMAL-p5x-p27重组质粒,并转化大肠杆菌BL21中,诱导表达;用Amylose Resin亲和层析柱对表达产物进行纯化。结果 SDS-PAGE分析显示,pMAL-p5x-p27重组质粒可在大肠杆菌中高效表达,表达产物分子量约为70×103;经纯化获得目的蛋白p27纯度可达90%。结论本研究利用原核表达系统成功表达了SIV p27蛋白,为SIV检测方法的建立奠定了基础。     

人干细胞因子在大肠杆菌中的表达研究

目的 经过改造重组人干细胞因子（ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ,ｈＳＣＦ）,提高其表达量。方法 应用人工合成寡核苷酸引物及ＰＣＲ技术,改变人工干细胞因子ｈＳＣＦ ｃＤＮＡ起始密码子ＡＴＧ与ＳＤ序列之间的距离及在翻译起始区（即Ｎ端氨基酸）部分采用大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）喜用型密码子的策略,使重组表达质粒ｐＢＶ２２０－ｈＳＣＦ在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得高效稳定表达。结果 ＤＮＡ序列测量证明基因     

人干燥综合征B抗原的基因克隆及融合表达

目的：建立新的检测方法，克隆并表达人干燥综合征B抗原（SS-B）。方法：应用逆转录PCR（RT-PCR）技术，从HL-60细胞株中克隆SS-B全长基因，将PCR产物直接TA克隆、鉴定及测序，再定向克隆至pGEX-5T载体中，转入大肠杆菌BL-21，阳性克隆鉴定后在IPTG诱导下表达，产物行十二烷基硫酸钠-多丙烯酰胺冻胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blot）试验。结果：PCR产物约为1200bp，与预期1224bp接近，测序结果与Gen-Bank报道的完全一致。pGEX-ST-SS-B重组阳性克隆酶切鉴定正确，SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白相对分子质量为71000，具有天然SS-B的免疫原性。结论：成功克隆表达SS-B，为下一步研究奠定了基础。     

具有免疫反应性的弓形虫多表位抗原在大肠杆菌中的可溶性表达和鉴定

目的 获得弓形虫多表位基因在原核系统中可溶性表达产物,为弓形虫病重组抗原试剂盒的制备及疫苗的研究奠定基础.方法 以PCR法扩增弓形虫多表位基因,使其两端带有与载体pET2a相匹配的酶切位点,插入载体pET2a,酶切并测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE),以IPTG进行诱导,SDS-PAGE分析和鉴定该基因的表达水平、表达产物的可溶性及其相对分子质量,Western-blot分析表达产物的免疫反应性.结果 该基因在原核表达系统中经诱导,得到了M_r1000的可溶性融合表达产物.经Ni-NTA纯化,纯度可达90%以上.免疫印迹实验表明该产物能够被弓形虫B6感染的小鼠血清和弓形虫RH感染的兔血清特异识别.结论 弓形虫多表位基因在原核中的可溶性表达产物在弓形虫病诊断及疫苗研究中有潜在的应用价值.     

人黑色素瘤特异性抗原基因的克隆及其在原核系统中的表达

目的：克隆及表达人黑色素瘤特异性抗原(PRAME)基因的cDNA片段。方法：从人急性髓细胞白血病细胞系HL-60提取总RNA，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从中扩增出PRAME基因cDNA片段。将PRAME基因cDNA片段插入载体pGEM-T-easy中，经全自动序列分析仪测序正确后，再克隆至表达载体pGEX-4T-2中，构建高效表达克隆，并转化大肠杆菌进行表达。结果：1mmoL／L异丙基-β—D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5h，PRAME蛋白表达即达高峰。结论：PRAME基因在极少数正常组织中低表达，而在白血病患者高表达，并编码被自体细胞毒T淋巴细胞识别的抗原，所以该基因有望成为肿瘤免疫治疗的新成员。     

TIMP-4基因的克隆、原核表达及活性测定

目的：采用RT-PCR法获取TIMP-4基因,并通过原核表达获取具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。方法：从SD大鼠心肌组织中提取总RNA,利用RT-PCR法扩增出TIMP-4基因,经基因序列分析后构建表达载体PET-28a（＋）-TIMP-4,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导TIMP-4的表达。利用N2＋-NTA纯化和复性后,根据其骨肉瘤细胞迁移能力的影响检测其活性。结果：克隆到编码序列完全正确的大鼠TIMP-4基因,能在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物占全菌总蛋白的23.5%,N2＋-NTA纯化和复性后,纯度达90%以上。纯化后的融合蛋白使骨肉瘤细胞株的迁移能力得到显著抑制。结论：通过基因克隆和原核表达的方式可以大量获得具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。     

融合表达载体pET22b-SUMO-FGFR4的构建及其在大肠杆菌中表达条件的优化

目的：设计合成小泛素修饰物-成纤维细胞生长因子受体4（SUMO-FGFR4）基因,构建pET22b-SUMO-FGFR4表达载体,并对其表达条件进行优化。方法：采用Overlap PCR方法制备SUMO-FGFR4融合基因,并连接到原核表达载体pET22b中,获得pET22b-SUMO-FGFR4重组表达载体。以乳糖为诱导剂,观察乳糖浓度、诱导时机、诱导温度、诱导时间和乳糖的添加方式等因素对SUMO-FGFR4蛋白表达量的影响,确定最佳诱导条件,并进行重组蛋白的可溶性分析。结果：pET22b-SUMO-FGFR4表达的融合蛋白在相对分子质量40000处显示目标条带,并与FGFR4抗体特异性结合。融合蛋白在乳糖终浓度为1.0 g·L^-1、诱导时间为3 h、诱导时机A（600）值为 0.8、诱导温度为37 ℃时表达量最高,乳糖的添加方式对SUMO-FGFR4融合蛋白的表达量无明显影响。乳糖作为诱导剂比传统诱导剂IPTG诱导SUMO-FGFR4融合蛋白的表达量高7.5%,融合蛋白以包涵体形式为主。结论：以乳糖作为诱导剂,成功表达了SUMO-FGFR4融合蛋白,确定了融合蛋白的最佳表达条件。     

Soluble expression and characterization of the immunoreactive multiepitope antigen of Toxoplasma gondii in E.coli]

OBJECTIVE: To obtain soluble expression product of immunoreactive recombinant multiepitope antigen of Toxoplasma gondii from E.coli. METHODS: The gene encoding the multiple epitopes (MEG) of Toxoplasma gondii was amplified by PCR from the original plasmid containing MEG gene and cloned into the prokaryotic soluble expression vector pET32a. After identification by enzyme digestion and sequencing, the positive recombinant plasmid pET32a-MEG was transformed into BL21(DE3), which was induced with IPTG for expression of the target antigen. The relative molecular mass, solubility and antigenicity of the expression products were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. RESULTS: The recombinant expression plasmid pET32a-MEG was successfully constructed and the highly efficient expression of the antigen was achieved after IPTG induction of E.coli. Improvement of the induction condition increased the expression product which accounted for about 28% of the total bacterial protein. The target protein, with good solubility and a relative molecular mass of about 31 000, was purified by immobilized metal affinity chromatography (Ni-NTA resin) and could be well recognized by mouse and rabbit antisera derived by infection of the animals with Toxoplasma gondii B36 and RH, respectively. CONCLUSION: The recombinant multiepitope antigen has good antigenicity and potential value in diagnosis and vaccine development of toxoplasmosis.