sTRAIL真核表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的 探讨可溶性肿瘤坏死因子相关捌亡诱导配体(soluble tumor necrosis factor.related apoptosis inducing lig-and,sTRAIL)真核表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制作用. 方法 建立胃癌细胞株BGC-823裸鼠移植瘤模型,成瘤后于瘤内多点注射重组真核表达质粒pBud-EGFP-TRAIL,并设pBud-EGFP组和生理盐水组为对照,观察并记录肿瘤的生长情况.Western blot和RT-PCR检测sTRAIL mRNA和蛋白表达情况,HE染色观察肿瘤组织病理改变,TUNEL法及电镜技术观测肿瘤组织细胞凋亡情况.结果注射pBud-EGFP-TRAIL组的sTRAIL mRNA和蛋白为阳性,其瘤休大小明显小于pBud-EGFP组和生理盐水组.差异有统计学意义(P<0.05).HE染色示pBud-EGFP-TRAIL组肿瘤细胞大量死亡,电镜下可见到典型凋亡细胞,TUNEL法显示其凋亡细胞明显增多. 结论 sTRAIL真核表达质粒pBud-EGFP-TRAIL瘤内注射对人胃癌裸鼠移植瘤有抑制作用.     

TRAIL蛋白原核表达载体的构建及表达研究

目的 利用蛋白自剪切功能原核表达系统构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）胞膜外段融合蛋白表达载体,并进行表达条件优化和初步纯化。方法 设计基因拼接引物,合成TRAIL基因胞膜外段双链cDNA序列,将其连接于克隆载体pMD18-T中;将酶切、纯化的TRAIL基因与经相同处理的载体pTWIN1相连接,转化感受态大肠杆菌JM109,筛选阳性重组子。将鉴定（酶切及序列分析）阳性的重组子质粒转人大肠埃希菌ER2566表达菌中,采用蛋白质SDS—PAGE电泳方法分析不同浓度诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、不同诱导温度、不同诱导时间下目的蛋白表达情况。结果 成功获得了包含TRAIL基因胞膜外段的双链cDNA序列,酶切及序列分析证实成功构建了TRAIL胞膜外段蛋白自剪切功能原核表达载体。采用0．3mmol／LIPTG、15℃诱导过夜（14～16h）,目的蛋白获得较高表达量,且大部分为可溶性蛋白。结论 采用大肠埃希氏菌ER2566,TRAIL胞膜外段融合蛋白获得高表达,经简单后续处理即可获得不含任何额外氨基酸的可溶性目的蛋白。     

人类肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体真核表达质粒的构建与临床意义

目的：为实现高表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)治疗前列腺癌,通过分子生物学技术构建TRAIL基因的真核表达质粒。方法：采用RT-PCR技术,从HL-60、Jurkat细胞mRNA中扩增出人类TRAIL基因序列,利用基因工程技术将其插入到真核表达载体pLXIN中获得重组质粒pLXIN-TRAIL,并进行酶切鉴定和DNA序列分析。结果：RT-PCR获得预期的扩增产物TRAIL884bp基因片段,成功构建pLXIN-TRAIL重组质粒,酶切鉴定及测序结果与预期相符。结论：重组克隆载体pLXIN-TRAIL构建成功。     

TRAIL重组蛋白联合扶正抑瘤方诱导HepG2肝癌细胞凋亡的研究

目的:研究重组人可溶性TRAIL蛋白联合扶正抑瘤方诱导肝癌细胞HepG2凋亡的作用和意义。方法:HepG2细胞经重组人可溶性TRAIL蛋白及联合扶正抑瘤方处理后,以MTT法测定细胞存活率、流式细胞术检测细胞凋亡指数。结果:扶正抑瘤方对促进TRAIL蛋白诱导的HepG2的凋亡作用存在较好的量效和时效关系,其最佳作用剂量和最佳作用时间分别为105mg/ml和24小时。结论:扶正抑瘤方能加强TRAIL诱导HepG2肝癌细胞凋亡作用。     

激活淋巴细胞中TRAIL及其受体表达的初步研究

目的：探讨静止及激活状态外周血淋巴细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及其受体的表达和它们在淋巴细胞生长、增殖中的作用。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测和基因测序确定不同状态淋巴细胞TRAIL及其受体的表达。结果：在静止状态外周血淋巴细胞TRAIL及其受体皆不表达，而在激活状态TRAIL及其受体都存在不同程度的表达。结论：TRAIL及其受体在激活的淋巴细胞中表达增强，可能参与其激活调控机制。     

TRAIL及其受体在人树突状细胞分化过程中的表达及其调控

目的：检测人单核细胞（monocyte）和CD34^ 干细胞来源的树突状细胞（DC）--MoDC和CD34DC,在分化发育不同阶段表达TRAIL及TRAIL受体（TRAIL-Rs）的情况和外源性因子LPS或IFN-β刺激未成熟DC后TRAIL-Rs的表达变化。方法：采用RT-PCR和FACS两种方法检测人DC表达TRAIL和TRAIL-Rs的水平。结果：人CD34^ 干细胞在向CD34DC分化过程中,表达TRAIL和TRAIL-Rs的先后顺序为DCR1和DCR2( 0d),DR4和DR5( 5d),TRAIL( 8d)。成熟DC表达中度水平的TRAIL、DR4、DR5、DCR2,不表达DCR1。除了DCR1外,MoDC和未经诱导的单核细胞表达TRAIL及其4个膜受体的水平基本一致,DCR1在诱导过程中逐渐降低。未成熟的MoDC在LPS的刺激下,表达DR5和DR4的水平增高,在IFN-β刺激下表达DR5的水平增高。结论：TRAIL和TRAIL-Rs可能参与DC分化或其功能的发挥。LPS或IFN-β能够增加DC对TRAIL诱导凋亡的敏感性,表明它们参与机体的免疫调控。     

pSVL／GM—CSF真核表达质粒的构建及其表达活性观察

以真核瞬时表达质粒ｐＳＶＬ为载体构建ｐＳＶＬ／ＧＭＣＳＦ真核表达质粒,用电穿孔法导入Ｃｏｓ－７细胞,以ＧＭ－ＣＳＦ依赖株ＴＦ１为靶细胞,检测其生物学活性;将不同剂量的ＰＳＶＬ／ＧＭ－ＣＳＦ质粒直接注射Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠股四头肌,动态观察小鼠血清中ＧＭ－ＣＳＦ的表达;     

靶向性重组TRAIL基因诱导人黑色素瘤细胞株A375凋亡的效应

目的研究TRAIL基因结合端粒酶启动子特异性靶向治疗的作用。方法刺激人外周血淋巴细胞增殖,提取总DNA。采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL功能区的融合基因,克隆入pGL3-181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL。将该重组载体经阳离子脂质体转染入人黑色素瘤细胞株A375中,以台盼蓝拒染法和电镜下细胞形态变化,观察转染的A375细胞的凋亡。结果构建了肿瘤人可溶性TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL,其表达产物能诱导人黑色素瘤细胞株A375凋亡。结论成功地构建了重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL,为肿瘤的基因靶向治疗提供了可能性。     

人核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其体内外抗瘤效应研究(英文)

目的构建人核心蛋白聚糖(human decorin,hDCN)pcDNA3.1(+)真核表达载体,并探讨其对S180细胞在体内、体外的抗肿瘤效应及其作用机制。方法用PCR法从pPIC9K-DCN扩增hDCN核心蛋白分子编码序列的全长cDNA,与pcD-NA3.1(+)载体连接。将重组pcDNA3.1(+)-DCN质粒通过脂质体转染法转入小鼠肿瘤细胞S180中,用G418筛选出阳性克隆细胞,RT-PCR、双酶切及测序鉴定。流式细胞仪对转染了重组质粒pcDNA3.1(+)-DCN、空质粒pcDNA3.1(+)的S180细胞和未转染的S180细胞进行细胞凋亡检测和细胞周期分析。分别注射等量的pcDNA3.1(+)-DCN/S180、pcDNA3.1(+)/S180的细胞和未转染质粒的S180细胞到随机分组的小鼠腋部皮下,观察三组小鼠的肿瘤生长情况;处死三组小鼠后,分别剥离肿瘤组织做病理学检查。结果转染了DCN的S180细胞凋亡指数明显增高,G0/G1期细胞百分率明显高于其他两组,G2/M期、S期细胞百分率分别明显低于其他两组(P<0.01)。与注射pcDNA3.1(+)/S180和S180的小鼠相比,注射pcDNA3.1(+)-DCN/S180的小鼠肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤体积小于其他两组(P<0.01)。结论成功构建了人核心蛋白聚糖真核表达载体。体外实验结果显示转染该表达载体的S180细胞凋亡指数明显增高,且凋亡多发生在G0/G1期;转染DCN表达载体的S180细胞在实验动物体内成瘤性降低,提示转染DCN在实验动物体内外都能表现抑瘤效应。     

重组hTRAIL腺病毒载体的构建及其体外抗肿瘤效应的初步观察

目的:利用AdEasy 载体系统构建含人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)全长基因的重组腺病毒载体,并初步观察其体外对肿瘤细胞的杀伤作用.方法:利用 RT-PCR法从人外周血单个核细胞(PBMCs)克隆人TRAIL全长基因.将hTRAIL cDNA克隆入穿梭质粒pAdTrack-CMV中, 与腺病毒骨架结构pAdEasy-1共同转化入大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,重组子经酶切鉴定正确后,用脂质体转染入人胚肾293细胞中,包装获得重组腺病毒颗粒,Western blot 检测TRAIL蛋白的表达.将重组腺病毒颗粒体外感染对TRAIL敏感的3种人肿瘤细胞(淋巴瘤细胞Jurkat、前列腺癌细胞PC-3、宫颈癌细胞HeLa)后,进行AnnexinⅤ-FITC/PI染色流式细胞术检测、细胞基因组的DNA电泳和锥虫蓝染色,以观察TRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用.结果:利用RT-PCR法从人PBMCs中扩增出843 bp的cDNA片段,测序证实为人TRAIL基因.重组子经酶切鉴定正确,Western印迹证实感染TRAIL腺病毒的293细胞中有TRAIL蛋白的正确表达.将重组腺病毒颗粒体外感染HeLa、PC-3和Jurkat细胞,4 h后用AnnexinⅤ-FITC/PI染色,流式细胞术检测AnnexinⅤ PI-细胞群分别占(41.15±3.12)%、(46.20±4.07)%、(38.56±3.45)%;24 h后,抽提Jurkat细胞的基因组进行DNA电泳,出现细胞凋亡时特有的DNA条带;36 h后用锥虫蓝对HeLa 、PC-3、Jurkat细胞染色,细胞死亡率分别为(75±5)%、(82±7)%、(70±5)%.结论:成功构建了hTRAIL腺病毒载体,体外感染HeLa 、PC-3、Jurkat肿瘤细胞后,能通过诱导细胞的凋亡而杀伤肿瘤细胞;为下一步的基因治疗和基础研究打下了基础.     

来氟米特对免疫性肝损伤大鼠Kupffer细胞TRAIL表达的影响

目的 观察来氟米特（Lef）对免疫性肝损伤大鼠的保护作用及对Kupffer细胞（KC）中肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及其受体表达的影响，探讨Lef防治肝损伤的作用及机制。方法 雄性SD大鼠24只，随机分为正常组、模型组和Lef组，每组8只。模型组及Lef组采用卡介苗（BCG）+脂多糖（LPS）诱导大鼠免疫性肝损伤模型，Lef组再采用lef干预，考察Lef对大鼠免疫性肝损伤的保护作用；体外分离培养KC，观察Lef对KC分泌细胞因子TRAIL及其受体TRAIL-R的影响。结果 Lef可明显改善免疫性肝损伤大鼠肝细胞损伤、肝细胞变性坏死减轻，视野内凋亡小体变少。Lef能显著降低KC分泌的TRAIL、TRAIL-R1、TRAIL-R2表达，与模型组相比明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 Lef对BCG+LPS诱导的免疫性肝损伤有保护作用，其机制可能与抑制TRAIL信号传导通路有关。     

胃癌组织中Angiopoietin-2、TRAIL与凋亡关系的研究

目的研究血管生成素-2(Angiopoietin-2)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis indueing ligand,TRAIL)在胃癌组织中的表达,探讨二者与细胞凋亡的关系.方法应用免疫组化技术检测67例胃腺癌组织中及相对应的正常胃黏膜中Angiopoietin-2、TRAIL蛋白的表达,用原位末端标记(TUNEL)技术检测癌组织中的凋亡指数(AI).结果angiopoietin-2在胃癌组织中明显表达(52.39%),而在癌旁正常黏膜呈弱表达(7.46%),低分化癌的angiopoietin-2的表达水平高于中高分化癌,有淋巴结转移者的angiopoietin-2的表达高于无淋巴结转移者(P均<0.05).TRAIL在正常胃黏膜中的阳性表达率97.01%高于癌组织中的阳性表达率47.76%(P<0.05);TRAIL蛋白的表达与肿瘤的分化程度有关,分化程度越低,TRAIL的表达率越低(P<0.05),TRAIL蛋白表达与胃癌的直径、部位、大体分型,浸润深度及有无淋巴结转移及患者的年龄、性别无关(P>0.05).胃癌组织中细胞凋亡指数为1.85±0.66.angiopoietin-2蛋白表达阳性组与阴性组、TRAIL蛋白阳性组与阴性组中凋亡指数分别存在着显著性差异(P<0.05);Angiopoietin-2与TRAIL蛋白表达之间无明显的相关性(rs=0.112,P>0.05).结论Angiopoientin-2可抑制肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤的恶性进展;TRAIL可诱导胃癌细胞发生凋亡.     

TRAIL蛋白的表达、纯化和抗肿瘤活性

目的　利用大肠杆菌表达出TRAIL蛋白 ,并观察分离纯化后的TRAIL蛋白的抗肿瘤活性。方法　采用CaCl2 法将带有TRAIL(氨基酸 114 -2 81,含六聚组氨酸尾 )基因的pET d质粒转入大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS ,IPTG诱导蛋白表达 ;使用Ni NTA层析柱分离纯化蛋白 ,SDS PAGE和Westernblot法鉴定TRAIL蛋白的表达 ;MTT法检测TRAIL蛋白的抗肿瘤活性。结果　我们分离纯化出分子量为 2 0 .1× 10 3 的蛋白 ,Westernblot法证实为TRAIL蛋白 ,MTT法检测出其有较高的抗肿瘤活性 ,呈现出较好的时效和量效关系。结论　成功地利用大肠杆菌表达、Ni NTA层析柱分离纯化出具有抗肿瘤活性的TRAIL蛋白 ,并证明其具有抗肿瘤活性     

乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因载体的构建及表达

目的：构建乏氧（HRE）/辐射（Egr1）双敏感启动子介导的分泌型人TRAIL (shTRAIL)基因表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,观察乏氧和辐射对其表达的影响。 方法：利用化学合成HRE上、下链,PCR扩增得到双链HRE;pMD19T-Egr1经Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切得到Egr1;pshuttle-shTRAIL 经Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切得到shTRAIL;利用基因重组技术构建含有HRE/Egr1双敏感启动子介导shTRAIL的表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,经酶切、PCR和测序鉴定正确。肺腺癌A549细胞分为正常组、乏氧组（1%）、照射组(6 Gy)和乏氧加照射组;表达载体转染肺腺癌A549细胞,RT-PCR及ELISA法检测shTRAIL的表达。结果：BamH Ⅰ和Sma Ⅰ酶切,所得片段大小分别为1 284和4 998　bp、2 292和3 990 bp;以Egr1和shTRAIL引物PCR扩增该载体,得到469和820 bp产物;将pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL进行测序,所得结果与设计一致,说明构建正确。转染肺腺癌A549细胞后,乏氧组、辐射组及乏氧加照射组shTRAIL mRNA和蛋白表达增加,与对照组比较差异有显著性（P<0.05）,且乏氧加照射组表达更明显。结论：成功地构建了乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因表达的载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL;乏氧及照射能够诱导TRAIL表达增加,且二者具有协同作用。     

人TRAIL cDNA的真核表达和体外肿瘤细胞的凋亡诱导作用

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）全长cDNA及其胞外区真核表达产物体外诱导肿瘤细胞的凋亡作用。为TRAIL基因治疗实验依据。方法 从胎心cDNA文为吕经PCR扩增获得两种形式cDNAs,构建相应的真核表达载体后进行基因转染,并筛选得到稳定表达细胞株;收集表达上清进行肿瘤细胞的体外凋亡诱导,同时观察凋亡相关蛋白TFAR19与表达上清共同存在时对肿瘤细胞的作用。结果 成功获得表达两种目的蛋白的真核细胞系,其表达上清均能诱导肿瘤细胞HeLa和Hec-la的凋亡,而且TFAR19能增强表达上清的凋亡诱导作用。结论 证明TRAIL基因的真核表达产物同样能诱导肿瘤细胞凋亡,如有TFAR19存在则效果更佳。     

人重组TRAIL对胆囊癌细胞生长的影响

目的探讨人重组肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(recombinant human tumor necrosis factor relat-ed apoptosis inducing ligand,rhTRAIL)对胆囊癌细胞株SGC-996的作用。方法用Western-blot法检测胆囊癌细胞株中TRAIL死亡受体DR4、DR5和Fas相关死亡结构域(fas-associated death domain,FADD)的表达状况,生长曲线、相差显微镜和流式细胞仪观测rhTRAIL作用于胆囊癌细胞株后的细胞生长状况。结果胆囊癌细胞株SGC-996中,有死亡受体DR4、DR5和Fas相关死亡结构域(FADD)的表达,rhTRAIL作用胆囊癌细胞后,细胞生长受到抑制,作用前后细胞Casepase-3/7活性明显升高,流式细胞仪检测表明rhTRAIL治疗组和对照组细胞的凋亡差异明显(P<0.05)。结论rhTRAIL在体外对胆囊癌细胞株SGC-996有明显抑制作用,可能成为治疗胆囊癌的新途径。     

人可溶性TRAIL蛋白表达及纯化条件优化

目的：优化人可溶性TRAIL蛋白生产菌发酵及纯化条件,从而提高TRAIL的产量及活性。方法①探索6种不同培养液、培养液pH值、异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导浓度及时间,选择最佳发酵条件;②联合镍离子亲和层析及超滤法纯化人可溶性TRAIL蛋白。结果①人可溶性TRAIL的最佳发酵条件为pH7．4的YPD培养液,所用IPTG的最佳浓度为0．2 mmol/L,最佳诱导时间为6 h;②经镍离子亲和层析和超滤联合作用可得纯度极高的蛋白。结论成功完成了人可溶性TRAIL发酵及纯化条件的优化,为今后大量提取TRAIL蛋白奠定了基础。     

TRAIL及其受体在自身免疫性疾病中的作用机制

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)是新的肿瘤坏死因子家族成员,共有5种受体,其配体-受体系统介导细胞凋亡。免疫细胞的凋亡异常与自身免疫性疾病的发生密切相关。以往研究主要集中在肿瘤的发生、发展和治疗等方面,近年来,TRAIL在免疫系统中的作用开始受到关注。现就TRAIL及其受体在免疫细胞凋亡中的作用及其与自身免疫性疾病发生和发展的关系予以综述。     

hTERT启动子调控的TRAIL基因表达载体的构建及其对肝癌细胞增殖的抑制作用

目的：构建hTERT启动子调控的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)基因表达载体,探讨其对肝癌细胞SMMC7721和肝细胞HL7702增殖的抑制作用。方法：采用分子生物学方法构建重组质粒pshuttle-TRAIL和pshuttle-hTERT-TRAIL,经PCR和酶切鉴定正确后,通过脂质体转染SMMC7721和HL7702细胞,同时转染pcDNA3.1+-GFP并用荧光显微镜检测转染效率。MTT法检测重组质粒对细胞增殖变化的影响。结果：成功构建重组质粒pshuttle-TRAIL和pshuttle-hTERT-TRAIL,荧光显微镜检测结果显示：质粒与脂质体的比例为1∶3时细胞转染效率最高。pshuttle-hTERT-TRAIL组SMMC7721细胞增殖抑制率从16 h开始明显增加,与对照组比较差异有显著性（P<0.001）,且从24 h开始与pshuttle-TRAIL组比较细胞增殖抑制率明显增加（P<0.05）;但重组质粒对HL7702细胞增殖抑制率无影响。结论： hTERT启动子调控的TRAIL可明显抑制肝癌细胞的增殖,而对人肝细胞的增殖无影响,其作用效果明显优于TRAIL单基因治疗。     

重组可溶性TRAIL的表达及其诱导A549和H460wt细胞凋亡

目的：获得人重组可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rsTRAIL)蛋白,并探讨其应用于非小细胞肺癌(NSCLC）治疗的前景。方法：RT-PCR从外周血单核细胞(PBMCs)中获取目的基因片段,构建重组质粒PQE₃0-TRAIL并转化入大肠杆菌(E.coli)M₁5,IPTG诱导目的蛋白表达并经镍固定金属亲和层析纯化,MTT法检测细胞增殖情况,荧光显微镜观察H460^wt细胞的形态学改变,流式细胞仪检测其凋亡率。结果：获得与GenBank中报道一致的TRAIL基因片段。SDS-PAGE电泳和免疫印 迹分析显示,获得具有TRAIL免疫原性、相对分子质量约为21 000目的蛋白。Ni²⁺-NTA agarose纯化得到单一条带蛋白。rsTRAIL处理H460^wt细胞24 h后,细胞凋亡率为43.2％,顺铂可以增强rsTRAIL对A549细胞的杀伤作用。结论：获得了与天然TRAIL蛋白具有相同生物学活性的目的蛋白,该目的蛋白具有诱导NSCLC细胞凋亡的作用,联合顺铂能够增强rsTRAIL对NSCLC的杀伤作用。