应用基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐异烟肼基因型

目的研制一种新型DNA芯片,用于快速检测结核分枝杆菌耐异烟肼katG基因突变。方法根据结核分枝杆菌katG基因序列设计探针并制作DNA芯片,用四甲基罗丹明标记的引物扩增结核分枝杆菌katG基因突变热点的片断,与DNA芯片杂交,同时以聚合酶链反应-单链构象多态性(pdymerase chain reaction-single stranded conformation polymorphism,PCR-SSCP)和DNA测序法为对照。结果153株结核分枝杆菌临床分离株中30株异烟肼敏感株的PCR-SSCP和DNA芯片杂交结果与结核分枝杆菌标准株完全相同,123株异烟肼耐药株中有85株检测到katG基因突变,占69.1%(85/123)。其中83株为315位密码子AGC→ACC突变,2株为315位密码子AGC→AAC突变,该突变与PCR-SSCP和DNA芯片杂交结果一致;余38株未检测到突变,经测序证实其中1株PCR-SSCP有不同突变的为279位密码子GGC→GAC突变,因芯片上未点该位点的探针,所以杂交结果为阴性。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐异烟肼分离株的katG基因突变,可用于临床耐药性的检测,指导临床用药。     

四川地区结核分枝杆菌喹诺酮耐药基因突变研究

目的 研究结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物的分子机制,探索四川地区耐喹诺酮结核分枝杆菌临床分离株的耐药基因突变特征。方法 采用绝对浓度法检测结核分枝杆菌临床分离株的最小抑菌浓度(MIC),再通过聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和直接测序检测结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物临床分离株gyrA耐药决定区(QRDR)突变,并和标准株H37Rv比较。结果 68株临床分离株中,14株喹诺酮药物敏感株和8株低耐药株未发现gyrA耐药决定区基因突变,25株高耐药株、11株低耐药株和10株药物敏感株检测到gyrA基因突变,高耐药株突变率为100％,低耐药株突变率为58％,敏感株突变率为42％,总的突变率为68％。根据SSCP条带,gyrA突变可分成4种类型,测序发现分别为Ser95Thr、Asp94Gly、Ala90Val、Ala83Val突变。结论 结核分枝杆菌耐喹诺酮与gyrA基因突变密切相关,gyrA基因突变是耐喹诺酮结核分枝杆菌耐药性的主要分子机制。     

结核分支杆菌异烟肼耐药的分子机制及其快速鉴定

目的：探讨快速检测结核分支杆菌异烟肼耐药的分子药敏方法。方法：用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)检测了20株异烟肼(INH)敏感的结核杆菌临床分离株，20株INH耐药株的katG基因，随后用SSCP方法鉴定扩增产物有无突变，以结核分支杆菌H37RV作对照。结果：所有INH敏感株均观察到katG基因扩增产物，20株INH耐药株中19株观察到katG基因扩增产物。以H37RV标准株为对照，20株敏感株SSCP带谱与对照相同；19株INH耐药株中8株与对照相同，11株有不同程度的差异，INH耐药katG基因突变或缺失的阳性率为60％。结论：多数结核分支杆菌耐INH是由于其katG基因突变所致，用PCR-SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分支杆菌INH耐药的目的。     

PCR-SSCP快速检测耐多药结核分枝杆菌

目的:了解本地区结核病耐药基因突变情况,探讨PCR-SSCP作为新的分子药敏试验方法在临床的应用价值。方法:通过提取耐INH、RFP、SM的肺结核患者痰中结核分枝杆菌DNA,进行PCR-SSCP分析,检测结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL基因是否存在突变,并与传统L-J药敏实验对照。结果:30株耐多药株中,耐RPF、INH、SM基因突变阳性率为90%(27/30)、63%(19/30)、53%(16/30)。3个基因联合突变共8株(26.7%),2个基因联合突变共18株(60%),即26株(86.7%)。单基因突变共2株,2株无基因突变。结论:通过PCR-SSCP方法可检测出绝大部分耐多药结核病的耐药基因,rpoB、katG、rpsL基因突变与本地区结核杆菌对RFP、INH、SM耐药性有关。与传统L-J药敏实验对比,PCR-SSCP是一种敏感、快速的指导临床用药的先进检测方法。     

PCR-SSCP检测结核分枝杆菌耐利福平诊断的系统评价

目的 用Meta-分析的方法评价PCR-SSCP检测结核分枝杆菌耐利福平的准确性.方法 通过检索PUBMED、EMBASE、中国生物医学文献数据库、中国期刊全文数据库、中文科技期刊全文数据库等数据库和其他方式广泛收集文献.用QUADAS标准评价文献质量.用Meta-disc软件计算合并敏感度、合并特异度和SROC曲线下面积等.结果 最终纳入4篇外文文献(5个研究),Meta-分析显示PCR-SSCP用于结核分枝杆菌耐利福平的诊断均显示了较高的敏感度和特异度,有较高的诊断价值.其合并敏感度为97%,[95%CI(95%,99%)];合并特异度为84%,[95%CI(78%,89%)];合并阳性似然比为8.14,[95%CI(1.77,37.42)];合并阴性似然比为0.05,[95%CI(0.02,0.14)1;SROC曲线下面积:AUC=0.989 0,SE(AUC)=0.012 0.结论 目前PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌耐利福平诊断有一定诊断价值,可作为诊断结核分枝杆菌耐利福平的确诊方法.     

快速检测结核分枝杆菌γpoB基因突变的研究

目的 :应用PCR SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌γpoB基因突变 ,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 :以结核分枝杆菌H37Rv为对照、5 0例耐RFP(单耐和多耐 )结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本 ,采用PCR SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌γpoB基因突变。结果 :5 0例耐RFP菌株中有 45例PCR SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别 ,与药敏试验结果做对比 ,PCR SSCP检测敏感性为 90 % ,特异性为 10 0 % ;12例敏感菌株与H37Rv条带一致 ,35份肺结核病人痰标本 ,2 1份痰PCR扩增阳性 ,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别 ,而用PCR SSCP 2 8份图谱与H37Rv有差别 ,阳性率为 80 %。结论 :PCR SSCP检测结核分枝杆菌γpoB基因突变快速、简便、易行 ,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定 ,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法     

某地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变特征分析

目的了解深圳地区结核分枝杆菌临床分离株利福平和异烟肼的耐药相关基因的突变特点。方法 60株结核分枝杆菌临床分离株通过全自动快速分枝杆菌培养鉴定系统(BACTEC-MGIT960)进行鉴定和药敏分析。在这60株菌株中,针对包括利福平耐药决定区(RRDR)在内的rpoB基因和异烟肼耐药相关位点katG315、inhA-15、kasA269、kasA312进行PCR扩增,并将扩增产物T-A克隆后进行测序。结果在60株结核分枝杆菌临床分离株中,检出利福平耐药株45株,敏感株15株;异烟肼耐药株41株,敏感株19株;利福平和异烟肼同时耐药的有14株。在45株利福平耐药株中,rpoB基因RRDR突变发生率为91.1%(41/45),共检测到12种突变形式,主要突变位点在531、526、516、533,以Ser531Leu突变最常见,占rpoB发生基因突变株的51.2%(21/45)。在41株异烟肼耐药株中,katG315位点有29株发生突变,包括28株katG315(AGC-ACC)和1株katG315(AGC-AAC)突变,突变发生率为70.7%(29/41);inhA-15位点有9株发生突变,均为(C-T)突变,突变发生率为21.95%(9/41)。kasA基因未发现常见突变形式。结论深圳地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变位点与国内外研究基本一致,但各位点频率有所不同。     

结核分枝杆菌耐异烟肼katG基因LiPA检测研究

目的利用LiPA技术检测结核分枝杆菌耐异烟肼katG基因,评价LiPA技术临床应用的可行性。方法应用比例法确定80株结核分枝杆菌临床分离株其耐药性,用katG基因PCR扩增产物进行DNA测序,然后用LiPA检测技术检测结核分枝杆菌katG基因的突变,对比3种方法的检测结果,评估LiPA检测技术的准确性。结果在80株结核分枝杆菌中,35株为异烟肼敏感株,45株为异烟肼耐药株。敏感株katG基因扩增阳性率为100％,耐药株为91．1％（41／45）。耐异烟肼茵株katG的缺失率为8．9％。41株扩增阳性耐药株中有26株检测到315位密码子的突变,分别为ACC（60．97％,25／41）,ATC（2．44％,1／41）,无突变（36．58％,15／41）。LiPA技术检测、药物敏感性试验和基因测序的结果基本一致。结论结核分枝杆菌katG基因突变的LiPA技术敏感性高,特异性强,可用于结核分枝杆菌的快速药物敏感性试验评价。     

结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变与耐药水平的相关性研究

目的：了解结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)katG、inhA和AhpC基因突变与异烟肼(isoniazid,INH)耐药的相关性。方法：回顾性分析南京市第二医院结核科2019年1月—2021年12月住院肺结核患者MTB培养及耐药基因检测结果。结果：痰或灌洗液MTB培养及菌种鉴定为人型结核分枝杆菌1 712例,INH表型药敏测定,敏感1 308例,耐药404例;其中663例标本同时送检INH耐药基因检测(分子药敏),99例未检出,564例分子药敏阳性,其中敏感390例,突变174例,突变位点为katG315、inhA启动子和AhpC启动子。以表型药敏作为金标准,分子药敏检出INH耐药的灵敏度为92.4%(95%CI:88.5%～96.4%),特异度为96.2%(95%CI:94.3%～98.1%),阳性预测值为91.4%(95%CI:87.2%～95.5%),阴性预测值为96.7%(95%CI:94.9%～98.4%),约登指数88.6%,准确率95.0%。172例表型药敏为耐药的患者检出耐药基因突变159例,分别为katG315突变126次,...     

多重聚合酶链反应检测结核菌耐异烟肼相关基因

目的：建立耐异烟肼(isoniazid,INH)结核分枝杆菌(M.tuberclasis,MTB)多重聚合酶链反应(multiple PCR,multi-PCR)检测系统，在一次扩增中快速，特异地同时检出aphC启动子，inhA和kagG基因，用于快速初步诊断结核分枝杆菌对INH的耐药性．方法：根据结核分枝杆菌的aphC启动子，inhA和kagG序列，分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物，采用multi—PCR技术，同时检出对结核分枝杆菌耐INH起作用的3个基因．结果：应用multi—PCR反应体系，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果；multi—PCR扩增的预期结果为：单基因引物出现一条特异性扩增区带，多重基因引物出现2或3条特异性扩增区带，经实验达到预期的扩增结果；对H37Rv标准株、INH敏感株及INH耐药株分别采用常规PCR和multi—PCR进行同时扩增，结果两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段，符合率达100％．结论：multi—PCR能有效地为多基因耐药的临床病原体的诊断提供快速、准确的诊断手段，更能提高检验效率。     

耐异烟肼结核分枝杆菌katG基因突变快速筛选的研究

目的：建立结核分枝杆菌（MTB）katG基因点突变的筛选方法，了解结核分枝杆菌耐异烟肼（INH）的状况。方法：采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性分析（PCR－RFLP）技术，对8株耐INH的临床MTB分离株、16株对INH敏感的临床分离株及MTB标准株H37Rv的katG基因，进行聚合酶链（PCR）反应扩增katG基因片段，再用Msp I内切酶分别对PCR产物进行消化反应。如果有315位点AGC突变为ACC，则将增加一个切点。结果：检测到8株耐药株中有7株增加了一个Msp I内切酶切点，耐药株中katG基因点突变检出率为87．5％（7／8）；16株敏感株和标准株均无额外的Msp I内切酶切点。未发现katG基因序列的缺失。结论：katG基因点突变是MTB耐INH重要机理之一；用PCR－RFLP检测耐INH的MTB的katG基因点突变具有快速、简便、敏感性高、特异性强的特点。     

DNA芯片快速检测结核分枝杆菌对链霉素和乙胺丁醇的耐药性方法的建立

目的:利用基因芯片技术检测结核分枝杆菌(MTB)对链霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)耐药性的技术平台建立.方法:应用基因芯片法测定160株MTB临床分离株的SM和EMB耐药性,并与BAC了EC960法结果进行比较,分别对结果相符与不相符的菌株进行测序.结果:基因芯片法测定160株MTB临床分离株,结果显示SM敏感111株、耐药49株,以rpsL 43、88位aag突变为agg为主.芯片检测结果EMB敏感142株、耐药18株,耐EMB的MTB以embB 306位atg突变为gtg为主.基阅芯片法检测链霉素、乙胺丁醇耐药的敏感性、特异性分别为80.0%、99%和60.0%、100%.两种测定方法结果不符的菌株中,采用基因测序法测定,结果显示基因芯片法检测点突变具有高度的特异性.结论:基阅芯片法检测MTB对SM与EMB耐药性方法具有快速、简单,特异性高,准确性高,可作为MTB的SM与EMB耐药性快速筛选方法.     

Leber遗传性视神经病变家系线粒体DNA突变检测

目的：探讨Leber遗传性视神经病变(LHON)患者的线粒体DNA(mtDNA)突变。方法：运用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR—SSCP)和DNA序列测定方法，设计4对引物，扩增出含11778、14484、3460三个已知原发突变位点和3394、4136、4160、4216、11696、14459、14482、14498八个已知继发突变位点的4对mtDNA片段，对3个LHON家系30位母系成员的血样进行检测。32份无视力障碍的正常人血样作对照。参照mtDNA序列为剑桥标准mtDNA序列。结果：30位母系成员均含11778位点突变，其中1人合许4164位点突变(A→G)与剑桥标准mtDNA序列对比，30位LHON母系成员和32位正常对照均含有11719位点突变。结论：11778是LHON患者常见的突变位点，4164位点突变可能是新的继发突变或正常人单核苷酸位点多态性。11719位点突变可能是中国人存在的单核苷酸位点多态性。     

Molecular characteristics of rifampin and isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Beijing, China

Background China is one of the high burden countries of Mycobacterium tuberculosis （TB） infection globally, with high incidence and mortality. We studied the molecular characteristics of rifampin （RIF） and isoniazid （INH） resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Beijing, China, in order to find out the genetic marker for rapid detection of specific drug resistance. Methods Forty pansusceptible and 81 resistant strains of Mycobacterium tuberculosis isolated from Beijing, China during 2002-2005 were analyzed. The modified rifampin oligonucleotide （RIFO） assay based on reverse line blot hybridization was used to detect mutations in the 81 bp hot-spot region of rpoB gene, which is associated with RIF resistance. The INH resistance associated genes, regulatory region mab-inhA （-15C/T） and structural gene katG S315T were detected by reverse line blot hybridization and PCR-restriction fragment length polymorphism （RFLP） method respectively. All the strains were typed by spoligotying and the Beijing genotype was further subdivided by NTF locus analysis. The distribution of drug resistance associated mutations in the above genes was compared in these groups. Results Sixty-five （91.5%） of 71 RIF resistant and 52 （92.9%） of 56 multidrug-resistant （MDR, i.e. resistant to at least RIF and INH） strains were found to harbor mutations in the rpoB hot-spot region. No mutation was detected in RIF sensitive strains. The specificity and sensitivity of the modified RIFO assay were 100% and 91.5%, respectively, katG315 AGC〉ACC and inhA-15C〉T mutations were found in 40 （60.6%） and 10 （15.2%） of 66 INH resistant strains, respectively; 7.6% of INH-resistant strains had mutations in both of these genes. Therefore, a combined use of both katG315 and inhA-15 identified 68.2% of INH-resistant strains. The Beijing genotype accounted for 91.7% of total strains and was further subdivided into ＂modern＂ （76.6%） and ＂ancestral＂ （23.4%） group. There is no significant difference between ＂ancestral＂ and ＂modern＂ group in prevalance of drug resistance-associated gene mutations. Conclusions The hot-spot region of rpoB gene can be used as genetic marker for detection of RIF resistant strains; a combined use of both katG315 and inhA-15 can improve the detection rate of I NH resistant strains; the Beijing genotype is prevalent in Beijing, China; the modified RIFO assay can be a practical tool for rapid detection of RIF resistant and MDR isolates in the routine diagnostic work.     

结核分支杆菌耐乙胺丁醇分离株embB基因测序分析

目的：探讨结核分支杆菌对乙胺丁醇(EMB)产生耐药性的分子机制，建立直接快速检测结核分支杆菌EMB药物敏感性的实验方法。方法：采用PCR扩增技术对10株耐乙胺丁醇结核分支杆菌进行PCR扩增，扩增产物经纯化后，直接在ABI377型全自动测序仪上进行DNA测序分析。结果：10株EMB耐药株的embB基因测序有7株(70％)发现点突变，其中Met(ATG)→Lle(ATA)2例，Met(ATG)→Lle(ATC)1例，Met(ATG)→Lle(ATT)2例，Met(ATG)→Val(GTG)2例，另外3株EMB耐药株的embB基因测序未发现突变位点。结论：embB306位氨基酸Met被置换是结核分支杆菌对乙胺丁醇产生耐药性的重要机制，测序分析可确认耐药基因的突变位点，是快速检测耐乙胺丁醇结核菌的有效方法。     

结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变的研究

目的 :了解我国结核分枝杆菌耐异烟肼 (INH)分离株katG基因突变情况 ,探讨快速检测结核分枝杆菌耐药基因型的分子药敏检测方法。方法 :用PCR单链构象多态性 (PCR SSCP)和PCR直接测序法 (PCR DS)检测 30株结核分枝杆菌临床分离株的katG基因。结果 :以结核分枝杆菌H3 7RV 标准株对照观察所有INH敏感株的PCR SSCP和PCR DS图谱 ,均未发现异常 ;而在 12株INH耐药株中 ,有 4株无PCR SSCP和PCR DS图谱异常 ,占INH耐药株的33 4% ;有 5株在 94位发生核苷酸错义突变 ,占INH耐药株 41 7% ,有 3株在 96位发生核苷酸同义突变 ,占INH耐药株的 2 5 %。结论 :多数结核分枝杆菌耐INH是由于其katG基因突变所致 ,可先用PCR SSCP筛选突变株 ,再用PCR DS方法测定其突变位点 ,达到快速检测结核分枝杆菌INH耐药基因型的目的     

利用寡核苷酸芯片快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变

目的:开发快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB寡核苷酸突变的基因芯片。方法:根据结核杆菌rpoB基因序列设计探针和引物并制备基因芯片,从临床痰标本中提取结核菌的基因组DNA,PCR扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段,荧光标记后与芯片上的特异性寡核苷酸探针进行杂交,同时与DNA测序法比较。结果:22株临床痰标本有18株可用寡核苷酸芯片检测出来,正确率可达82%;患者痰液中少量DNA足够进行芯片检测,无须细菌培养。结论:利用寡核苷酸芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的准确性和敏感性,可以应用于临床耐药性诊断。