新生大鼠神经干细胞的分离培养

目的 探讨新生大鼠神经干细胞的分离培养方法及其外源报告基因在神经干细胞中的表达情况。方法 采用无血清细胞培养技术，间接免疫细胞化学染色法及其绿色荧光蛋白转导技术。结果 从新生大鼠脑组织分离的细胞具有连续克隆能力，表达神经上皮干细胞蛋白，诱导分化后的细胞表达成熟神经细胞和星形胶质细胞特异性的蛋白。绿色荧光蛋白报告基因转导神经干细胞后能够有效表达。结论 该方法分离培养的神经干细胞保持了干细胞的未分化属性，具有自我更新、增殖能力和多分化潜能，而且外源报告基因在神经干细胞中能够有效表达。     

人胎脑神经干细胞体外培养及分化研究

目的研究人胚胎神经干细胞体外长期培养的条件、不同部位脑组织神经干细胞数量及其分化能力和特点。方法分离人胚胎海马、皮质、室周、纹状体脑组织，培养在含碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、表皮生长因子（EGF）、B27、N2掭加剂的无血清培养基中，形成神经球，用有限稀释法进行克隆、传代。计算神经球数量，用溴脱氧尿苷（BrdU）标记神经球，使用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞自主分化能力。结粜人胚胎海马、皮质、室周、纹状体部位脑组织均能培养出具有自我增殖能力的神经干细胞，其中海马所含神经干细胞最丰富。室周次之。BrdU检测有正在分裂、增殖的细胞。液氮冻存6个月的细胞复苏后仍具增殖分化能力。细胞贴壁分化后可形成Nestin、胶质原性纤维酸性蛋白（GFAP）、微管相关蛋白2（MAP2）表达阳性细胞。结论胚胎脑组织具有丰富的神经干细胞。具有自我更新和增殖能力，可长期培养。含b-FOF、EGF的无血清培养基能促进神经干细胞连续稳定增殖，保持神经干细胞特性。分离培养的神经干细胞可向神经元、胶质细胞分化。     

大鼠胚胎神经干细胞移植治疗类脊髓栓系综合征的实验研究

目的将胎鼠的神经干细胞移植到脊髓栓系综合征大鼠的病变脊髓中，观察治疗效果。方法从孕17d大鼠胚胎脊髓中分离、培养神经干细胞并诱导分化，通过免疫组化技术研究证实其特性。制作大鼠脊髓栓系模型，3d后将未分化的神经干细胞注人病变脊髓内，2个月后观察大鼠的运动功能，处死大鼠，研究移植后的干细胞在体内存活、迁移及分化情况。结果实验中分离、培养的神经干细胞能够被诱导分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。脊髓栓系大鼠移植干细胞后运动功能改善，神经元数目增多，显著好于未移植组。免疫组化方法证实移植后的干细胞在体内可以存活、迁移、分化成神经细胞。结论大鼠胚胎神经干细胞体内、体外均具有多向分化潜能，移植神经干细胞是治疗脊髓栓系神经变性的一种有效途径。     

胶质细胞源性神经营养因子和神经营养素-3双基因转染大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经样细胞的研究

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和神经营养素3(NT-3)双基因修饰诱导的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经样细胞的可行性以及GDNF和NT-3的表达变化.方法 全骨髓法分离培养BMSCs,流式细胞术检测BMSCs标志CD90和造血干细胞标志CD45.转染带荧光的GDNF和NT-3基因,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及细胞形态变化;免疫荧光检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)和神经胶质酸性蛋白(GFAP)表达;Western blot 检测细胞中GDNF及NT-3蛋白表达.对照组为未转染GDNF和NT-3基因的BMSCs.结果 BMSCs能在体外成功分离培养,细胞高表达CD90(92.7%),不表达CD45.诱导分化后,BMSCs胞体变圆,伸出明显突起,并可见多数细胞相互交织成网状结构,呈神经细胞样形态.免疫荧光标记检测可见实验组细胞表达NSE和NF,而不表达GFAP.而对照组阴性.Western blot检测可见细胞GDNF及NT-3蛋白表达增强.结论 GDNF和NT-3双基因修饰诱导的BMSCs可分化为神经样细胞并表达神经元的标志,为基因治疗神经系统疾病如先天性巨结肠提供实验基础.     

新生大鼠海马神经干细胞的无血清培养及鉴定

目的探讨新生大鼠海马神经干细胞无血清培养的最佳方法，观察神经干细胞的生长、增殖及分化的特点。方法分离新生24h大鼠的海马组织，分别采用含碱性成纤维生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、及bFGF＋EGF的无血清条件培养基进行悬浮培养，采用神经巢蛋白（nestin）免疫荧光染色方法鉴定神经干细胞，通过胎牛血清诱导分化，鉴定分化细胞，进一步证实神经干细胞。结果bFGF＋EGF能更好的诱导神经干细胞增殖，培养细胞呈nestin抗原阳性，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性抗原。结论bFGF＋EGF的无血清培养基可用于培养大鼠海马神经干细胞。     

神经干细胞移植促进类脊髓脊膜膨出鼠脊髓功能恢复的实验研究

目的研究神经干细胞移植对脊髓脊膜膨出鼠脊髓功能恢复的作用.方法从孕17d大鼠胚胎脊髓中分离、培养出神经干细胞并诱导分化,通过免疫组化技术研究其特性.制作脊髓脊膜膨出鼠模型,待其长至1个月大时,随机分成4组,将用绿色荧光蛋白标记的神经干细胞注人移植组幼鼠病变脊髓内,2个月后用斜板试验评估每组鼠双后肢的功能,3个月大时处死实验鼠,取脊髓标本,研究移植后的十细胞在体内存活、迁移及分化情况.结果神经干细胞移植组鼠的双后肢运动功能改善,脊髓标本中神经元数目增多,显著好于未移植组.免疫组化方法证实移植后的干细胞在体内可以存活、迁移、分化成神经细胞.结论大鼠胚胎神经于细胞体内、体外均具有多向分化潜能,移植神经干细胞能够改善脊髓脊膜膨出鼠的脊髓功能.     

Chop及Grp78基因在先天性脊柱裂大鼠胚胎12天神经管中的异常表达

目的 探讨Chop及Grp78基因在先天性脊柱裂大鼠胚胎12 d神经管及神经上皮干细胞中的表达情况.方法 取畸形大鼠12d胚胎神经管组织,荧光实时定量PCR考察Chop及Grp78基因表达.另取12 d正常大鼠胚胎,分离消化神经管行神经上皮干细胞培养.荧光实时定量PCR考察Chop及Grp78基因表达.结果 先天性脊柱裂大鼠胚胎12 d神经管内Chop基因及Grp78基因表达异常增高.神经上皮干细胞分化为神经元后Chop及Grp78基因的表达上调.结论 Chop及Grp78基因在先天性脊柱裂大鼠胚胎12d神经管中表达异常增高,二者在神经上皮干细胞分化为神经元后表达上调,可能与内质网应激相关的凋亡有关.神经上皮干细胞培养培养体系稳定、高效,可以为胚胎早期发育提供实验模型.     

大鼠胚胎肠神经嵴干细胞的分离培养和诱导分化

目的 探索从大鼠胚胎肠组织获取肠神经嵴干细胞（neural crest stem cells，NCSCs）的可能性；与脑神经干细胞（neural stem cells，NScs）比较，了解其生物学性状。方法 用NSCs的培养液同时进行肠NCSCs和脑NSCs的培养；得到的神经细胞球用神经上皮干细胞蛋白（nestin）进行鉴定，计数NCSCs神经细胞球和NSCs神经细胞球中各自的Nestin阳性细胞比例。NCSCs神经细胞球在胎牛血清诱导分化培养7d后，用神经元细胞特异性标记神经纤维丝蛋白（NF68）和星形胶质细胞特异性标记神经胶质酸性蛋白（GFAP）对其进行免疫荧光鉴定。结果从大鼠胚胎肠组织成功得到NCSCs，并且形成神经细胞球，Nestin为阳性；分化后细胞为NF68或者GFAP阳性；与NSCs比较，NCSCs能较快形成神经细胞球，其神经细胞球中的Nestin阳性细胞比例（66．75±12．42）％低于NSCs（91．60±5．62）％（P=0．000）。结论 肠NCSCs可以从大鼠胚胎肠组织分离培养得到，在体外培养环境下能够增殖，并且具有多向分化潜能。     

骨髓间充质干细胞在先天性脊椎裂胎鼠脊髓中的分化

目的观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)在先天性脊椎裂胎鼠脊髓中的存活与分化,探寻细胞替代治疗先天性脊椎裂的方法。方法用贴壁培养法进行大鼠MSC原代培养并传代,携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒转染第3代骨髓MSC。将转染的MSC注射到先天性脊椎裂胎鼠的脊髓中。母鼠孕20 d时取先天性脊椎裂胎鼠的脊椎,固定脱水后做冷冻切片,免疫荧光方法检测脊髓中EGFP阳性MSC中巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果骨髓MSC中CD90阳性细胞占99%,CD44阳性细胞占95%,不表达CD34。腺病毒-EGFP转染骨髓MSC的转染率为61%。致畸组显性脊椎裂胎鼠占64.3%。移植的MSC存在于脊髓表面或进入脊髓中,部分细胞变为长梭形或多角形。免疫荧光法检测结果显示移植到脊髓中的MSC可表达神经干细胞的标志物Nestin和神经胶质细胞的标志物GFAP。结论带有EGFP的MSC经细胞移植后能在胎鼠脊髓内存活,并能分化为神经干细胞和神经胶质细胞。     

大鼠脂肪组织来源的干细胞向成骨方向诱导分化的初步研究

目的探索大鼠脂肪组织来源的干细胞的分离、培养的方法，以及在特定条件下向成骨细胞分化，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法取4周龄SD大鼠附睾处脂肪，成骨诱导培养基培养，组织化学、免疫细胞化学染色以及组织学定量检测其分化情况。结果从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪组织来源的干细胞，能稳定增殖传代，CD44、波形蛋白免疫组化染色阳性，证明其中胚层来源。在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的诱导下，脂肪组织来源干细胞的碱性磷酸酶活性增高，出现钙结节，四环素荧光染色阳性证实有新骨形成。碱性磷酸酶定量和钙定量随诱导时间延长表达增加。结论从脂肪组织中可获得具有多向分化潜能的干细胞，并能在体外稳定增殖传代，经诱导后可分化为成骨细胞，有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一。     

13-顺维甲酸体外诱导神经母细胞瘤干细胞分化的体外实验

目的 体外观察并鉴定13-顺维甲酸诱导神经母细胞瘤（NB）干细胞的分化作用,为临床用维甲酸治疗NB微小残留病灶提供实验依据。方法 取14例伴骨髓转移的Ⅳ期NB患儿的骨髓液标本,分离出NB细胞,将原代肿瘤细胞接种于无血清干细胞培养基中悬浮培养;在含5 μmol·L-1 13-顺维甲酸的分化培养基中培养神经球细胞,观察细胞的形态变化;RT-PCR法检测神经球细胞诱导前、诱导3和9 d Oct-4表达水平的改变;利用细胞免疫荧光技术比较诱导前及诱导9 d神经球细胞nestin表达的差异。结果 14例骨髓标本中,4例分离到原代NB细胞。无血清培养基中培养4~6 d后,可见原代悬浮神经球形成,传代后成球细胞能再次分裂增殖为神经球。神经球细胞在血清培养基中呈贴壁生长,呈三角形或星形,添加5 μmol·L-1 13-顺维甲酸后,细胞生长速度降低,形态发生明显改变。RT-PCR法检测结果显示,13-顺维甲酸诱导9 d后,神经球细胞Oct-4表达水平逐渐降低;细胞免疫荧光显示诱导9 d后神经球细胞nestin表达减弱。结论 13-顺维甲酸能有效诱导NB干细胞分化。     

大鼠胶质细胞源性营养因子及内皮素B受体基因共重组腺病毒的构建及表达

目的构建胶质细胞源性营养因子（GDNF）及内皮素B受体基因（EDNRB）共表达腺病毒并观察其在神经干细胞（NSC）中的表达。方法利用AdEasy腺病毒表达系统构建GDNF及EDNRB基因共表达腺病毒AdGE，体外感染NSC后通过观察绿色荧光蛋白表达及RT-PCR、流式细胞仪法鉴定外源基因的表达。结果NSC经Ad—GE感染后24h可观察到绿色荧光蛋白（GFP）表达，RT-PCR、流式细胞仪法证实外源性GDNF及EDNRB基因均可在NSC中表达。结论成功构建GDNF及EDNRB基因共表达重组腺病毒，证实了其在NSC的表达，为先天性巨结肠的联合基因治疗打下基础。     

神经营养素3及神经干细胞联合移植治疗实验性大鼠缺氧缺血性脑损伤

目的研究神经营养素3（NT-3）及神经干细胞联合移植对缺氧缺血性脑损伤（HIBD）大鼠神经功能恢复及神经干细胞分化为神经元的比例的影响,并探讨其可能机制。方法取新出生的24h内的wistar大鼠,从海马中分离神经细胞,进行培养、鉴定。用出生7d的wistar新生大鼠制作缺氧缺血性脑损伤的动物模型,模型成功后7d进行移植。将实验大鼠随机分为5组：正常组、模型组、假移植组、神经干细胞移植组、NT-3及神经干细胞联合移植组（简称联合移植组）,每组12只。移植部位为损伤同侧侧脑室。移植后4周进行功能实验,取脑组织进行免疫组化及免疫荧光检查。结果从新生鼠海马中成功培养出神经干细胞,培养条件下呈悬浮状态生长,形成神经球,绝大多数的细胞表达神经干细胞的标志物神经巢蛋白（nestin）。说明培养的细胞大部分为神经干细胞,细胞纯度达90％以上。Y迷宫实验结果：神经干细胞移植组平均（163±11．6）次学会,记忆的平均正确率为（50±13．3）％;神经干细胞（NSC）＋NT-3联合移植组平均（117．27±11．04）次学会,记忆的正确率平均（63±11．2）％。握持牵引实验结果：神经干细胞移植组平均（30．1±11．8）s,右下肢能放置的占40％;NSC＋NT-3联合移植组平均（40．64±10．6）s,右下肢能放置的占72．73％。斜坡实验结果：神经干细胞移植组平均（20．3±8．25）;NSC＋NT-3联合移植组平均（12．9±5．15）s。说明接受NT-3及神经干细胞移植组大鼠的学习能力、记忆能力及肢体功能与单纯神经干细胞移植组相比有明显提高,差异具有统计学意义（P〈0．05）。其神经干细胞分化成神经元的比例（50％）与单纯神经干细胞移植组（30％）比有明显增多。结论NT-3与神经干细胞联合移植能提高缺氧缺血性脑损伤大鼠的学习、记忆能力和肢体功能,并能提高神经干细胞向神经元转化的比率,NT-3和神经干细胞联合移植较单独神经干细胞移植对缺氧缺血性脑损伤有更好的治疗效果。     

产前补充牛磺酸调节Rho家族因子活性促进生长受限新生大鼠神经干细胞增殖的研究

目的 探讨产前补充牛磺酸通过调节Rho家族因子活性促进生长受限 （FGR）新生大鼠神经干细胞增殖的可能性,为产前补充牛磺酸促进生长受限患儿脑发育提供实验依据。方法 将24只Sprague-Dawley孕鼠随机分为对照组、FGR组、牛磺酸组 （n=8）,通过全程饥饿法建立FGR模型。采用逆转录-聚合酶链反应法、免疫组化及免疫印迹法检测各组新生鼠脑组织神经干细胞特异性胞内标记物脂肪酸结合蛋白7 （FABP7）、Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶2 （ROCK2）、ras同源基因家族成员A （RhoA）、Ras相关的C3肉毒素底物 （rac）表达水平。结果 FGR组FABP7阳性细胞OD值、FABP7mRNA及蛋白的表达低于对照组,牛磺酸组FABP7阳性细胞OD值、FABP7mRNA及蛋白的表达高于FGR组 （P < 0.05）。FGR组中RhoA、ROCK2mRNA的表达高于对照组,牛磺酸组中RhoA、ROCK2mRNA表达高于对照组但低于FGR组 （P < 0.05）;FGR组中racmRNA的表达低于对照组,牛磺酸组中racmRNA表达高于FGR组及对照组 （P < 0.05）;FGR组中RhoA、ROCK2蛋白表达水平高于对照组,牛磺酸组中RhoA、ROCK2蛋白表达水平低于FGR组 （P < 0.05）。结论 产前补充牛磺酸可促进FGR新生大鼠神经干细胞增殖,其机制可能与调控Rho家族因子的活性有关。     

Abnormal development of tracheal innervation in rats with experimental diaphragmatic hernia

Background  We previously demonstrated that tracheobronchial innervation, originated from the vagus nerve and hence of neural crest origin, is deficient in rats with experimental congenital diaphragmatic hernia (CDH). The present study examines the development of this innervation during fetal life in an attempt to understand the nature of these deficiencies. Materials and methods  Pregnant rats were given either 100 mg nitrofen or vehicle on E9.5. Embryos were recovered on E15 and E18. Control and nitrofen/CDH pups (n = 10 each) were studied on each of these days and compared with our previous results on E21. Whole mount preparations of tracheas stained for anti-protein gene product 9.5 (PGP 9.5) and smooth muscle contractile α-actin were examined under confocal microscopy for the morphology of intrinsic neural network. Sections of tracheas were immunostained with anti-low-affinity neurotrophin receptor (p75^NTR), neural cell marker PGP 9.5, and anti-glial cell marker S100 antibodies. The proportions of sectional areas occupied by neural and glial structures were measured in the proximal and distal trachea. PGP 9.5 protein, and mRNA expressions were determined. Mann–Whitney tests with a threshold of significance of P < 0.05 were used for comparison. Results  Positive staining for p75^NTR confirmed the neural crest origin of tracheal neural cells. The neural network appeared less organized on E15, and it was less dense on E18 in nitrofen-exposed embryos than in controls. The proportions of section surface occupied by neural elements were similar in both groups on E15, but that of glial tissue was significantly increased in nitrofen-exposed embryos. On E18, the relative neural surface was significantly reduced in CDH embryos in contrast with increased glial tissue surface. On E21 the proportion of neural tissue was reduced only in the distal trachea. The expression of PGP 9.5 protein was decreased in CDH fetuses on E18 and E21. In contrast, PGP 9.5 mRNA levels were increased in CDH fetuses on E18 and E21. Conclusions  The development of intrinsic innervation of the trachea in rats with CDH is abnormal with reduction of neural tissue accompanied by increase of glial tissue that could represent a response to neural damage. The significance of increased PGP 9.5 mRNA levels is unclear. Presented at the 21st International Symposium on Pediatric Surgical Research, Leipzig, Germany, 2–4 October 2008. F. Pederiva is a research fellow of the CAM (FPI-000760 Grant).     

高龄妊娠对子鼠海马神经干细胞发育的影响

目的 探讨高龄妊娠对子鼠海马神经干细胞发育的影响。方法 将3月龄（n=10）与12月龄（n=10）的雌性大鼠分别与3月龄雄性大鼠（n=20）合笼,以其子鼠为研究对象,分为适龄子代组和高龄子代组,每组40只。分别采用免疫荧光及Western blot法定位及定量检测生后第7天两组海马组织巢蛋白（Nestin）、双皮质素（DCX）及生后第28天成熟神经元标志物NeuN、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达水平;采用免疫荧光法定位检测生后第14天两组海马组织多聚唾液酸神经细胞黏附分子（PSA-NCAM）表达情况;每组各检测指标随机取8只大鼠。结果 Western blot检测结果发现高龄子代组海马DCX蛋白的表达明显低于适龄子代组（P < 0.05）,Nestin、NeuN及GFAP蛋白表达在两组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。免疫荧光检测结果显示,高龄子代组海马齿状回（DG）区Nestin、DCX及PSA-NCAM的表达均明显低于适龄子代组（P < 0.05）,而上述指标分别在两组海马CA1区、CA3区的表达比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。高龄子代组海马CA1区NeuN的表达高于适龄子代组（P < 0.01）,两组CA3区和DG区NeuN的表达比较差异无统计学意义（P > 0.05）。高龄子代组海马CA1区、CA3区、DG区GFAP的表达均低于适龄子代组（P < 0.05）。结论 高龄妊娠可能引起子鼠海马神经干细胞的增殖、存活及迁移受到抑制,并影响其向神经元和星形胶质细胞的分化,最终导致子鼠海马神经干细胞发育障碍。     

新生大鼠脑缺血后脑室下区基因表达谱的生物信息学分析

摘要 目的 建立3日龄大鼠脑缺血模型，采用基因芯片分析新生大鼠未成熟脑缺血损伤后脑室下区（SVZ）基因表达谱的变化。方法 同窝3日龄大鼠随机分为实验组和对照组，采用双侧颈总动脉结扎法制备缺血性脑损伤模型，于不同时点取SVZ组织，采用Affymetrix Rat230 2.0基因表达谱芯片观察SVZ基因表达变化，芯片数据分别用3种不同方法分析，并用实时PCR方法验证芯片结果。结果 ①通过差异基因筛选，发现3日龄大鼠脑缺血损伤后SVZ有17个基因发生表达变化，其中上调基因10个，下调基因7个，这些基因参与多种功能的调节。②基于基因功能的表达趋势分析显示，在所有参与增殖、凋亡功能的基因中，转化生长因子-β（TGF-β）在3日龄大鼠脑缺血损伤后SVZ微环境基因表达变化中起枢纽作用。实时PCR验证结果显示，TGF β1及Smad2于缺血后1、4和7 d表达均上升，7 d达高峰。③在参与Wnt、TGF、BMP 和血管内皮生长因子（VEGF）通路所有基因组成的基因功能相似性网络中，有13个基因在网络中起核心调控作用，构成信号通路串话节点。结论 新生大鼠在脑缺血损伤后SVZ微环境中，参与神经新生的BMP、TGF、VEGF和Wnt通路间的串话可发生于信号转导通路中多个水平，TGF-β1对神经新生的调控起重要作用。