以减毒沙门菌为载体布鲁氏菌DNA疫苗的构建及免疫原性分析

目的 构建携带布鲁氏菌BLS-L7/L12融合基因的重组减毒沙门菌并进行免疫原性分析,为口服布鲁氏菌DNA疫苗研究奠定基础.方法将BLS-7/L12融合基因克隆到真核表达载体asd -pVAX1,依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd -pVAX1-BLS-L7/L12).以1×109CFU/只的剂量口服免疫Balb/C小鼠,3次免疫后进行免疫效果的评价.结果构建的重组减毒沙门菌质粒转染COS-7细胞经免疫组化和Western-blot试验证明BLS-L7/L12融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清和肠黏液中有特异性抗体IgG和sIgA产生.通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主.结论 所构建的以重组沙门菌为载体口服布鲁氏菌DNA疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,且以细胞免疫应答为主.可作为潜在的布鲁氏菌新型疫苗.     

SARS冠状病毒S基因重组DNA诱导的体液免疫反应

目的 以严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）密码子优化的S、S1和S2基因分别构建其真核表达质粒，免疫BALB／c小鼠，以初步评价其诱导特异性体液免疫的效果。方法将人工合成密码子优化的S、S1和S2基因克隆入pcDNA4／HisMax-TOPO表达载体，重组质粒转染293T细胞，Western blot和免疫组化检测其真核表达，重组质粒免疫BALB／c小鼠，酶联免疫（ELISA）检测抗S蛋白抗体，伪病毒中和试验、细胞融合抑制试验检测中和抗体。结果3种重组质粒均可在真核细胞中获得表达，免疫小鼠后可诱导针对S蛋白的特异性抗体，抗体在12周观察期内呈持续上升趋势；其中，仅S和S1蛋白重组质粒能够诱导中和抗体的产生，以S蛋白的效价为高。结论密码子优化S和S1蛋白重组质粒可以有效诱导BALB／c小鼠产生中和抗体，其抗体可能具有阻断SARS-CoV侵袭易感细胞的能力。该结果为进一步研究SARS-CoV DNA疫苗提供了参考依据。     

空肠弯曲菌PEB1-LTB DNA疫苗构建及其对小鼠免疫保护性的研究

目的:研究粘膜佐剂大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)辅助的空肠弯曲菌(C.jejuni)外膜蛋白PEB1基因重组DNA疫苗诱导小鼠免疫应答水平。方法:构建pcDNA3.1(-)-PEB1-LTB真核重组表达载体,转染Hela细胞,Westernblot鉴定蛋白表达。滴鼻免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2周,测定小鼠血清中IgG、IgA及气管、小肠粘膜冲洗液sIgA抗体;脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-4水平。末次免疫后4周,采用空肠弯曲菌重复攻击的方式进行灌胃攻击,攻击后,根据动物疾病指数评价疫苗临床保护率。结果:构建的重组表达质粒能在Hela细胞内表达,重组蛋白。疫苗免疫小鼠后,不仅诱导了高水平血清IgG、IgA抗体,而且诱导了高水平粘膜sIgA抗体。其诱导的特异性免疫应答能有效保护免疫后小鼠免遭空肠弯曲菌的感染攻击。结论:构建的DNA疫苗经粘膜免疫能诱导小鼠产生较高水平的特异性免疫应答,能有效预防空肠弯曲菌感染。     

tPA信号肽和鼠疫杆菌保护性抗原V融合基因的构建及免疫效果鉴定

获得含有鼠疫杆菌V抗原编码基因以及tPA信号肽编码序列的重组质粒,并测定其诱导特异性免疫应答的能力。采用PCR扩增鼠疫菌杆菌V基因构建到pVAX1质粒中产生pVAX1/V重组质粒,PCR扩增tPA信号肽编码序列片段并将其插入到pVAX1/V中V基因的上游,构建tPA-pVAX1/V重组质粒;转染COS-7细胞,免疫细胞化学方法鉴定V蛋白的表达;二重组质粒分别加mGM-CSF质粒免疫BALB/c小鼠,观察免疫应答反应;以400个LD50强毒鼠疫杆菌皮下攻击免疫小鼠观察保护效率。结果显示,tPA-pVAX1/V在COS-7细胞中表达了V蛋白;免疫小鼠血清产生了特异性抗体和细胞免疫应答;攻毒保护率达80%。成功构建了分泌型V蛋白的真核表达质粒载体,具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,对强毒鼠疫杆菌攻毒有一定的保护效力,为鼠疫杆菌新型疫苗研制奠定了基础。     

促进乳头状瘤病毒L1蛋白表达和DNA疫苗免疫效应的研究

目的 探讨促进乳头状瘤病毒（PV）晚期基因L1的蛋白表达和DNA疫苗免疫效应的途径及可能的机制。方法 分别将含人源化优化密码BPVL1-GFP融合基因（HL1-GFP）和野生型BPVL1-GFP融合基因（WE1-GFP）的真核表达质粒体外单独转染或与tRNA^ser真核表达质粒共转染人角质形成细胞HaCAT，荧光显微镜及Western blot方法观察L1-GFP融合蛋白的瞬时表达情况。半定量RT-PCR分析不同PV L1基因mRNA的表达。BALB／c小鼠股四头肌内分别接种野生型、优化密码L1 DNA疫苗，同时将L1 DNA疫苗与tRNA^ser真核表达质粒混合后接种小鼠，观察诱导产生的体液免疫反应。结果 野生型WE1-GFP融合基因在HaCAT细胞中未能有效表达，优化密码HL1-GFP基因在HaCAT细胞中的蛋白表达水平明显增强；但两者在mRNA水平差异无统计学意义。WE1-GFP与tRNA^ser真核表达质粒共转染细胞中L1蛋白的表达较单独转染WE1-GFP基因时增强。动物DNA免疫结果表明，优化密码HE1 DNA疫苗接种可使小鼠特异性L1中和抗体水平明显升高；而野生型WE1 DNA疫苗接种组小鼠仅产生低滴度的L1抗体，WE1 DNA疫苗与tRNA^ser真核表达质粒混合接种使小鼠的L1抗体水平增加。结论 优化密码能显著促进乳头状瘤病毒晚期基因L1在哺乳动物细胞中的表达和DNA疫苗的免疫反应；补充外源tRNA^ser基因能够提高野生型L1基因的蛋白表达和DNA疫苗诱导的体液免疫应答。     

鼠疫耶尔森菌重组质粒pVAX1/Fl-V的构建及其免疫效果的研究

目的获得含有鼠疫F1和V抗原编码基因的重组真核表达质粒pVAX1／F1-V，并测定其诱导特异性免疫应答的能力。方法PCR扩增鼠疫菌Fl和V编码基因，分别与pGEM-T连接测序，构建pVAX1／F1-V融合重组质粒，转染Cos-7细胞，用Western blot方法鉴定目的蛋白的表达，重组质粒pVAXI／F1．V加GM．CSF佐剂免疫BALB／c小鼠，观察免疫效果，400个半数致死量（uk）强毒鼠疫菌皮下攻毒观察保护率。结果pVAX1／F1-V在Cos-7细胞中表达，免疫鼠体内产生特异性抗体，通过抗体亚型分析、细胞因子等指标的测定表明所构建DNA疫苗以诱发TH1型免疫为主，攻毒保护率达60％。结论成功构建F1-V融合蛋白真核表达载体，具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力，对强毒鼠疫菌皮下攻毒有一定的保护效力，为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础。     

登革病毒外膜蛋白DⅢ区融合基因真核表达载体的构建及免疫效果研究

目的:构建登革病毒外膜蛋白DⅢ区融合基因真核表达载体并分析其免疫原性.方法:利用连接肽将登革病毒1型与2型、3型与4型的外膜蛋白(E蛋白)DⅢ基因片段连接在一起,克隆人真核表达载体pCDNA3.1(+),构建DEN1/2型、DEN3/4型EDⅢ融合基因的二价真核表达载体,转染哺乳动物细胞BHK-21,用间接免疫荧光法和免疫印迹法鉴定目的蛋白的表达.将两种二价重组质粒混合形成四价DNA疫苗免疫小鼠,观察其免疫原性及诱导产生中和抗体的能力.结果:二价重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的蛋白,四价DNA质粒免疫小鼠,能诱导产生针对登革病毒1~4型的中和抗体,平均中和效价分别为l:24.7、1:26.9、1:13.4、1:16.0.结论:本研究构建的DNA质粒在小鼠模型中具有良好的免疫原性,为登革多价DNA疫苗的研究提供了可行性.     

布氏杆菌PBP39/pCDNATE重组表达质粒的构建及免疫效果的研究

目的构建pBp39/pCDNATE重组表达质粒,免疫BALB/c小鼠观察诱导的特异性体液免疫、细胞免疫及免疫保护效果.方法克隆PBP39基因,构建PBP39/pCDNATE重组表达质粒.首先转染Cos-7细胞,免疫组化检测其PBP39蛋白抗原的表达.然后用PBP39基因疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠4次,观察特异性体液免疫和细胞免疫效果.进一步用1.25×104布氏杆菌544A强毒株腹腔攻毒,观察PBP39重组表达质粒的免疫保护效果.结果扩增的PBP39保护性抗原基因片段在牛、羊和猪布氏杆菌株中具有高度保守性,构建的PBP39/pCDNATE重组表达质粒在Cos-7细胞中有目的蛋白的表达.制备的PBP39重组表达质粒肌肉免疫BALB/c小鼠4次,ELISA检测PBP39重组表达质粒产生了较高水平的特异性IgG抗体,并随免疫次数增加抗体的滴度也递增,抗体亚型以IgG2a为主,表明诱导了TH1型的免疫应答.MTT测定PBP39重组表达质粒的淋巴细胞增殖能力与对照组差异有统计学意义.布氏杆菌A544强毒株攻毒后,动物存活及脾组织细菌数与对照组比较差异有统计学意义,说明PBP39重组表达质粒能够产生有效的保护效果.结论研制的PBP39重组表达质粒免疫BALB/c小鼠能产生高水平的特异性抗体和细胞免疫,且以细胞免疫为主,并产生有效的免疫保护效果,为布氏杆菌病新型疫苗的研究奠定了基础.     

鼠疫菌重组质粒pcDNATE/F1-V的构建及其免疫效果的研究

目的 获得含有鼠疫F1和V抗原编码基因的重组质粒pcDNATE／E1-V,并测定其诱导特异性免疫应答的能力。方法PCR扩增鼠疫菌F1和V编码基因,分别与pGEM-T连接测序,构建pcDNATE／F1-V融合重组质粒,转染COS-7细胞,用Western blot方法鉴定目的蛋白的表达,重组质粒pcDNATE／E1-V加集落刺激因子(GM-CSF)免疫Balb／c小鼠,观察免疫效果。结果pcDNATE／F11-V在COS-7细胞中表达,免疫鼠体内产生特异性抗体,抗体亚型分析、细胞因子等指标的测定结果表明所构建DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主。结论成功构建重组真核表达质粒pcDNATE／F1-V,其具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础。     

人乳头瘤病毒11型L1/E7嵌合DNA疫苗的构建及其诱导的免疫效应

目的 构建人乳头瘤病毒11型L1/E7嵌合DNA疫苗pcDNA3 L1-E7并研究其在小鼠中诱导的免疫效应.方法 用分子克隆技术构建重组真核表达质粒peDNA3 L1-E7.重组质粒DNA股四头肌注射免疫小鼠,用ELISA方法 检测L1、E7特异性抗体和脾细胞分泌的IL-2、γ-INF;MTT法检测脾淋巴细胞增殖反应.结果 成功构建pcDNA3 L1-E7.免疫小鼠后,重组质粒可诱导机体产生特异性脾淋巴细胞增殖及IL-2、γ-INF分泌增加,并诱导机体产生HPV 11-E7 IgG和HPV 11-L1 IgG抗体.结论 嵌合DNA疫苗pcDNA3 L1-E7能诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫反应.     

Protective immunity elicited by a divalent DNA vaccine encoding both the L7/L12 and Omp16 genes of Brucella abortus in BALB/c mice

This study was designed to evaluate the immunogenicity and the protective efficacy of a divalent fusion DNA vaccine encoding both the Brucella abortus L7/L12 protein (ribosomal protein) and Omp16 protein (outer membrane lipoprotein), designated pcDNA3.1-L7/L12-Omp16. Intramuscular injection of this divalent DNA vaccine into BALB/c mice elicited markedly both humoral and cellular immune responses. The specific antibodies exhibited a dominance of immunoglobulin G2a (IgG2a) over IgG1. In addition, the dual-gene DNA vaccine elicited a strong T-cell proliferative response and induced a large amount of gamma interferon-producing T cells upon restimulation in vitro with recombinant fusion protein L7/L12-Omp16, suggesting the induction of a typical T-helper-1-dominated immune response in vivo. This divalent DNA vaccine could also induce a significant level of protection against challenge with the virulent strain B. abortus 544 in BALB/c mice. Furthermore, the protection level induced by the divalent DNA vaccine was significantly higher than that induced by the univalent DNA vaccines pcDNA3.1-L7/L12 or pcDNA3.1-Omp16. Taken together, the results of this study verify for the first time that the Omp16 gene can be a candidate target for a DNA vaccine against brucellosis. Additionally, a divalent genetic vaccine based on the L7/L12 and Omp16 genes can elicit a stronger cellular immune response and better immunoprotection than the relevant univalent vaccines can.     

嗜肺军团菌免疫原蛋白核酸疫苗诱导的小鼠免疫应答及其保护力

目的:研究嗜肺军团菌免疫原蛋白核酸疫苗诱导的小鼠免疫原性以及对LP感染小鼠的保护能力。方法:用嗜肺军团菌免疫原蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFNγ-产生水平和CTL特异杀伤活性等指标,以评价疫苗的免疫原性。真核表达重组质粒pcDNA3.1-ipDNA疫苗重复免疫BALB/c小鼠2次,末次免疫2周后,用10倍LD50剂量攻击小鼠,计数小鼠的存活数及小鼠肺中的细菌数,观察感染鼠的肺部病理变化。结果:pcDNA3.1-ip免疫小鼠后诱导产生了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答,免疫组的免疫原性和免疫保护性均高于对照组pcDNA3.1( )组(P<0.01)。结论:免疫原蛋白基因可作为嗜肺军团菌核酸疫苗的侯选基因。     

HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合DNA诱导BALB/c小鼠产生特异性细胞免疫的研究

目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV)6b结构蛋白L1和沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)多表位嵌合DNA(HPV6b L1/Ct MOMP)诱导BALB/c小鼠产生特异性细胞免疫效应,及HPV6b L1对Ct MOMP多表位基因诱导细胞免疫的增强作用.方法 将Ct MOMP多表位基因连接在经真核密码子优化的HPV6b L1羧基端,构建嵌合重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP多表位,经酶切和测序证实后,转染COS-7细胞,间接免疫荧光鉴定其在真核细胞中的表达;将纯化后的嵌合重组质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,并设置pcDNA3.1(+)/Ct MOMP多表位质粒、pcD-NA3.1(+)和PBS三组对照.采用0、2、4周免疫程序,DNA剂量为每只150μg/次.于末次免疫后2周,分别用乳酸脱氢酶(LDH)释放法和细胞内细胞因子染色-流式细胞术(ICS-FAGS)检测小鼠脾细胞对Ct MOMP多表位蛋白和HPV6b L1蛋白的特异性CTL活性,胞内细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10产生水平等细胞免疫应答指标.结果免疫后,在效靶比(E∶T)分别为40∶1、20∶1时,pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合重组质粒免疫组小鼠产生了针对Ct MOMP多表位蛋白特异性CTL杀伤活性(44.56%±4.02%,35.35%±2.89%)和HPV6b L1蛋白特异性CTL杀伤活性(27.08%±2.04%,21.68%±4.06%),与各对照组比较差异有统计学意义(F=72.87,F=114.55,P＜0.05;F=30.04,F=10.47,P＜0.05),且显著高于pcDNA3.1(+)/Ct MOMP多表位质粒组(35.50%±2.68%,30.24%±1.75%;12.27%±3.36%,9.32%±3.07%;P＜0.05);而pcDNA3.1(+)/Ct MOMP多表位质粒组小鼠仅显示了Ct MOMP多表位特异性的CTL杀伤活性,与对照组比较差异也有统计学意义(F=58.85,F=120.21;P＜0.05).胞内细胞因子IFN-γ的产生水平,pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合质粒组(4.34%±0.06%)高于pcDNA3.1(+)/Ct MOMP多表位质粒组(3.14%±0.18%),与对照组比较差异有统计学意义(F=473.83,P＜0.05),而重组质粒组较空载体组和PBS对照组差异也有统计学意义(F=211.72,P＜0.05);但IL-4和IL-10水平则各组间差异无统计学意义(F=0.97,P＞0.05;F=2.25,P＞0.05).结论 pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合DNA质粒可诱导BALB/c小鼠同时产生针对HPV6b L1蛋白和Ct MOMP多表位蛋白特异性的细胞免疫效应;真核密码子优化的HPV6b L1能显著增强Ct MOMP 多表位基因诱导的小鼠特异性细胞免疫效应.     

Vaccination with recombinant L7/L12-truncated Omp31 protein induces protection against Brucella infection in BALB/c mice

Brucellosis is the most common bacterial zoonotic disease worldwide and no vaccine is available for the prevention of human brucellosis. In humans, brucellosis is mostly caused by Brucella melitensis and Brucella abortus. The Outer membrane protein 31 (Omp31) and L7/L12 are immunodominant and protective antigens conserved in human Brucella pathogens. In the present study, we evaluated the humoral and cellular immune responses induced by a fusion protein designed based on the Truncated form of Omp31 (TOmp31) and L7-L12 antigens. Vaccination of BALB/c mice with the recombinant fusion protein (rL7/L12-TOmp31) provided the significant protection level against B. melitensis and B. abortus challenge. Moreover, rL7/L12-TOmp31 elicited a strong specific IgG response (higher IgG2a titers) and significant IFN-γ/IL2 production and T-cell proliferation was also observed. The T helper1 (Th1) oriented response persisted for 12 weeks after the first immunization. The rL7/L12-TOmp31 could be a new potential antigen candidate for the development of a subunit vaccine against B. melitensis and B. abortus.     

密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染

目的:构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2.方法:用PCR技术从988载体中获得L1-IRES-L2片段,将该片段克隆到pCR -XL-TOPO 载体,然后定向亚克隆到pcDNA3.1( )真核表达载体中,从而构建真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2;通过水动力转染技术(hydrodynamics-based transfection)和脂质体细胞转染法(liposome-mediated transfection of cells),检测衣壳基因的体内、外转录情况;重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化,用Western blot方法检测293T细胞中L1衣壳蛋白的表达.结果:酶切和测序结果表明真核共表达载体pcD-NA3.1-L1-IRES-L2构建正确.重组质粒中的L1和L2基因在小鼠肝脏、293T细胞中均发生转录.重组质粒转染293T细胞后出现CPE(cytopathic effect)现象,表明衣壳基因在细胞中已表达.Western blot方法检测发现L1蛋白在293T细胞中表达.结论:成功地构建了pcDNA3.1-L1-IRES-L2共表达真核载体,为进一步研究HPV16感染机制奠定基础.     

Comparison of immune responses induced in mice by vaccination with DNA vaccine constructs expressing mycobacterial antigen 85A and interleukin-21 and Bacillus Galmette-Guérin

In this paper, we addressed the immune adjuvant effects of interleukin(IL)-21 on DNA vaccine constructs expressing mycobacterium tuberculosis (TB) Ag85A and compared immune responses induced in mice inoculated DNA vaccine constructs expressing Ag85A and IL-21 with mice inoculated DNA vaccine constructs expressing Ag85A alone or Bacillus Galmette-Guérin(BCG.). In this experiment, the gene of IL-21 was firstly amplified from plasmid pcDNA3.1-mIL21 by PCR and cloned into the plasmid pRSC, forming recombinant plasmid pRSC-IL21. Then, the gene of Ag85A was amplified from the plasmid pIRES-Ag85A by PCR and cloned into the recombinant pRSC-IL21 again, finally forming co-expression DNA vaccine constructs pRSC-IL21-Ag85A. It was identified by the analysis of endonuclease digestion, DNA sequencing, the IL-21 and Ag85A expression in SP2/0 cells. Mice were i.m. immunized with BCG, DNA vaccine constructs pRSC-Ag85A or pRSC-IL21-Ag85A respectively, and the immune responses induced in mice was compared with other vaccines. The results showed that the DNA vaccine constructs pRSC-IL21-Ag85A was successfully constructed since the Ag85A and IL-21 was correctly expressed in SP2/0 cells respectively, and it elicited stronger immune responses in Balb/c mice than that of mice immunized with pRSC-Ag85A and the efficiency was as BCG did. We concluded that the IL-21 was a promising immune adjunctive modality to enhance immunigenicity of DNA vaccine containing Ag85A and the study provided the possibility of further development of immune accessory effect of IL-21 on DNA vaccine against TB.