多价阳离子脂质体介导重组基因pCKM-mPTH治疗甲状旁腺功能低下症的实验研究

目的探讨多价阳离子脂质体介导的pCKM-mPTH质粒治疗甲状旁腺功能低下症(HPT)的最佳方案。方法用DNaseⅠ敏感性试验测定脂质体对质粒的保护作用,用不同比例的脂质复合物及裸质粒进行体内外转染,收集细胞培养液和血清,采用放射免疫法测定其甲状旁腺激素(PTH)含量。结果脂质复合物比例为2∶1时,即对DNA有明显的保护作用;在体外转染实验中,复合物比例在3∶1时PTH表达量最高,为每24小时(16.4±4.8)pg/10 000细胞,而在此比例下pCKM-mPTH质粒达20μg/100μl时,模型体内PTH的血清浓度最高,为35.9 pg/m l±2.2 pg/m l。结论与裸质粒相比,多价阳离子脂质体更适宜于作为HPT基因治疗的非病毒载体,而其介导重组质粒pCKM-mPTH直接转染肌肉的良好效能取决于脂质复合物的构成比例和剂量。     

中心组合设计法优化前阳离子脂质体的制备工艺

目的:采用中心组合设计法优化前阳离子脂质体的制备工艺,考察前阳离子脂质体的有关性质。方法:以薄膜分散膜挤压法制备前阳离子脂质体,以平均粒径、转染效率为指标,对鱼精蛋白(protamine)与质粒DNA的质量比、CHETA([2[[4-[羧甲基]二硫-1-亚氨丁基]氨基]乙基]氨基甲酸胆固醇酯)摩尔百分比浓度、CHETA与质粒DNA的质量比3个自变量的各个水平进行二项式拟合,通过响应面分析选取较佳工艺条件。以LacZ为报告基因转染HepG2细胞,定量测定β-半乳糖苷酶活性和总蛋白含量计算转染效率。结果:影响平均粒径、转染效率的3个主要因子的最佳取值分别为:protamine/DNA,2.5∶1;CHETA(mol%),45;CHETA/DNA,4∶1。优化条件制备的前阳离子脂质体形态近似于球体,平均粒径为(228.9±8)nm,多分散指数为0.122±0.02(n=3),Zeta电位为-(25.08±2.5)mV(n=3),载基因前阳离子脂质体转染HepG2肝癌细胞转染效率为(24.26±2.6)mUβ-半乳糖苷酶/mg protein。结论:中心组合设计应用简便、预测性好,制备的前阳离子脂质体符合设计要求。     

靶向bcl-2基因的shRNA对肝星状细胞凋亡的影响

目的研究短发夹RNA(shRNA)重组载体介导抑制大鼠肝星状细胞(HSCs)bcl-2基因的表达,观察其对HSCs凋亡的影响。方法重组质粒载体pGPU6-GFP-shRNA由脂质体介导转染HSC-T6细胞株。荧光定量PCR和Western blotting鉴定bcl-2表达;CCK-8法观察质粒转染对HSCs生长和增殖的影响;Hoechst 33258染色观察细胞形态学改变;流式细胞术及caspase-3和caspase-9酶活性检测分析转染后细胞凋亡情况。结果pGPU6-GFP-shRNA能抑制bcl-2 mRNA和蛋白表达;转染后HSC-T6体外生长明显受到抑制;转染后72 h时细胞凋亡率为33.34%,caspase-3和caspase-9酶活性显著增高。结论shRNA重组载体pGPU6-GFP-shRNA能有效地抑制HSC-T6中bcl-2的表达,抑制细胞生长并促进凋亡。实验为进一步探索肝纤维化基因治疗提供了实验依据。     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

靶向bcl-2基因的shRNA对肝星状细胞凋亡的影响

目的 研究短发夹RNA(shRNA)重组载体介导抑制大鼠肝星状细胞(HSCs)bcl-2基因的表达,观察其对HSCs凋亡的影响.方法 重组质粒载体pGPU6-GFP-shRNA由脂质体介导转染HSC-T6细胞株.荧光定量PCR和Western blotting鉴定bcl-2表达;CCK-8法观察质粒转染对HSCa生长和增殖的影响;Hoechst 33258染色观察细胞形态学改变;流式细胞术及caspase-3和caspase-9酶活性检测分析转染后细胞凋亡情况.结果 pGPU6-GFP-shRNA能抑制bcl-2 mRNA和蛋白表达;转染后HSC-T6体外生长明显受到抑制;转染后72 h时细胞凋亡率为33.34%,caspase-3和caspase-9酶活性显著增高.结论 shRNA重组载体pGPU6-GFP-shRNA能有效地抑制HSC-T6中bcl-2的表达,抑制细胞生长并促进凋亡.实验为进一步探索肝纤维化基因治疗提供了实验依据.     

流式细胞仪快速优化大鼠原代培养肝细胞基因转染

[目的]用流式细胞仪(FCM)快速检测外源性血管内皮生长因子基因(VEGF基因)在大鼠原代培养肝细胞转染表达,根据结果优化其转染表达条件.[方法]以加强型黄色荧光素蛋白(EYFP)为标记,用FCM快速检测重组质粒pIRES-EYFP/VEGF121在大鼠原代培养肝细胞中转染表达,根据结果优化pIRES-EYFP/VEGF121转染表达条件.[结果]pIRES-EYFP/VEGF121得以成功构建,并转染大鼠原代培养肝细胞;优化的转染表达条件:在细胞数密度0.1×106/mL,质粒孵育时间30 min,质粒与脂质体混合物孵育时间15 min,质粒与脂质体比例为1:10,转染时间2 h,NAIR-1作转染培养液时,转染效率达17.5%.[结论]以EYFP为标记,FCM可简便快捷地检测并优化外源性VEGF基因在大鼠原代培养肝细胞转染表达,可为研究VEGF基因修饰大鼠原代培养肝细胞移植和肝基因治疗打基础.     

提高Lipofectamine2000对PC12细胞转染效率的研究

目的探讨提高PC12细胞转染效率的方法。方法细胞培养板用10μg/mLⅠ型牛胶原蛋白包被,通过在转染过程中加入9μmol/L趋溶酶体试剂氯喹及8μmol/L聚胺类试剂亚精胺,同时调整Lipofectamine2000与DNA用量的比例和转染时间。考察DNA与Lipofectamine2000的比例对PC12细胞转染效率的影响,转染时间对PC12细胞转染效率的影响,氯喹、亚精胺用量对PC12细胞转染效率的影响,氯喹、亚精胺对PC12细胞活性的影响,氯喹、亚精胺对PC12细胞神经轴突生长的影响及与4种常用脂质体转染试剂对PC12细胞转染效率的比较。结果①对PC12细胞转染,DNA∶Lipofectamine2000用量比例应控制在1∶4。②当转染时间分别为1、2、4、8、24 h时,PC12细胞转染率分别为35.5%、37.9%、40.5%、40.3%及38.6%,4 h达到最大转染效率。③氯喹、亚精胺加入浓度的增加,PC12细胞转染效率随之增加,当氯喹、亚精胺加入终浓度分别增至9μmol/L和8μmol/L时,PC12细胞的转染效率最高,转染效率为40.5%。④加入终浓度为9μmol/L氯喹与8μmol/L亚精胺前、后MTT试验吸光度(590 nm)分别为(0.466±0.042)与(0.451±0.038),差异无统计学意义(P>0.05),对PC12细胞的活性无影响。⑤加入氯喹、亚精胺前、后,PC12细胞的神经轴突生长数量与长度差异无统计学意义(P>0.05)。⑥FuGENE、PolyJet、Lipofectamine LTX and Plus、Lipofectamine2000 4种脂质体转染试剂对PC12细胞转染效率分别为10.5%、8.6%、11.8%及15.3%,本法PC12细胞转染率为40.5%,差异有高度统计学意义(P<0.01)。结论加入氯喹及亚精胺,实现阳离子脂质体Lipofectamine2000对PC12细胞的高效转染,为PC12细胞进行神经细胞基因功能及开发遗传病治疗方案等生物学研究提供了一种安全、廉价的新方法。     

nm23-H1基因抑制口腔癌细胞的侵袭转移行为机制的实验研究

[目的]将nm23-H1导入口腔癌BcaCD885细胞株,观察nm23-H1对BcaCD885细胞株侵袭转移能力的影响,并对相关机制进行分析。[方法]制备高纯度的nm23-H1真核表达质粒,并用阳离子脂质体介导的转染技术,完成转染方法的建立。检测转染前后的NDPKA的表达并观察转染前后细胞的侵袭转移行为能力的变化。[结果]将nm23-H1转染口腔癌细胞,获得了稳定表达,发现BcaCD885细胞株nm23-H1基因的转染前后表达水平有明显差异,实验组和对照组的侵袭细胞相对数目分别为41.1％±1.2％和64.5％±6.3％,趋化运动细胞相对数目为50.0％±6.3％和81.0％±3.9％,实验组的粘附能力也显著降低。[结论]nm23-H1对BcaCD885细胞的侵袭转移能力具有显著抑制作用。     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选

目的构建能高效抑制肝星状细胞(HSCs)bcl-2表达的小发夹RNA(shRNA)重组质粒。方法利用RNA干扰技术,设计有小发夹结构的3条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体psiRNA-hH1neo上构建重组质粒,予以酶切和测序鉴定。重组质粒转染HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR和Western blotting进行筛选鉴定。结果酶切及测序鉴定表明,成功构建重组质粒shRNA1、shRNA2和shRNA3。实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,shRNA1和shRNA2转染后显著抑制HSC-T6中bcl-2mRNA和蛋白表达(P<0.05),其中siRNA1的bcl-2表达抑制效率>80%。结论构建的重组质粒shRNA1能有效抑制HSCs中bcl-2的表达。实验为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了基础。     

孕周与母儿血甲状腺激素含量的关系

目的：观察不同孕周与母儿血甲状腺激素的关系。方法：应用放射免疫分析法对67例中、晚期妊娠要求引产患者，10例早产及78例孕足月自然分娩患者进行了母血及胎儿脐静脉、脐动脉血中TSH、T3、T4的测定。结果：TSH值在母血及胎儿血中随着孕周的增加而增加．T3值在胎儿血中与母血中比较，显示低T3血症，T4值接近正常母体水平。结论：测定母血中的甲状腺激素，可动态观察不同孕周甲状腺激素变化，可及时发现胎儿低甲血症。     

褪黑素载药纳米粒的优化设计及研制

目的：探讨采用复合乳液-溶剂挥发法制备褪黑素载药纳米粒的最佳工艺条件。方法：以聚乳酸、壳聚糖可降解生物材料为载体,明胶为分散剂,span-80和tween-80混合液为微乳液,根据微粒的表面形态、粒径大小、分布、包封率、载药量选择最佳工艺条件,制备褪黑素载药纳米粒。结果与结论：原子力显微镜下可见纳米粒表面圆滑,分布均匀。正交设计效应曲线图直观分析和方差分析结果显示,搅拌速度、溶剂挥发温度、聚乳酸与褪黑素投药比、壳聚糖浓度是影响制备工艺的主要因素。在30℃,1000r／min搅拌速度,搅拌时间45min,m(褪黑素)：m(聚乳酸)为1：5,V(Tween-80)：V(Span-80)为5：1,壳聚糖质量浓度为1％条件下,可制备成平均粒径为45．84nm,包封率为38．33％,载药量为8．35％的褪黑素载药纳米粒。     

高效液相色谱法检测人血浆中咖啡因及其3种去甲基代谢产物

以８－氯茶碱作为内标，利用高效液相色谱同时测定人血浆中咖啡及其３种去甲基代谢产物－－副黄嘌呤、可可碱和茶碱的方法。这４种物质可以在一个固定相柱子上被同时分离；流动相为甲；０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钠（３０：７０）（Ｖ／Ｖ）；流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ；紫外检测器，波长２７４ｎｍ。实验表明这４种物质的最小检出量均在７５ｎｇ／ｍｌ，并具有较好的线性、重复性及较高回收率。     

5种生物碱胃癌多药耐药逆转剂的筛选及机制研究

目的 研究骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、贝母素甲、贝母素乙和氧化苦参碱对肿瘤细胞多药耐药性（MDR）的逆转作用及机制。方法 以胃癌亲本细胞系SGC-7901和MDR细胞系SGC-7901/VCR为细胞模型,采用MTT法检测上述5种生物碱的细胞毒活性及对MDR的逆转效果;用流式细胞仪检测MDR逆转效果最好的贝母素乙对肿瘤细胞内阿霉素（ADR）蓄积的影响;Western blotting法检测P-糖蛋白（P-gp）的表达;Hoechst荧光染色和细胞免疫荧光法检测贝母素乙诱导SGC-7901/VCR细胞凋亡情况。结果 骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、贝母素甲、贝母素乙和氧化苦参碱均能不同程度地抑制SGC-7901和SGC-7901/VCR细胞的增殖,在非毒剂量下贝母素乙能够显著提高SGC-7901/VCR细胞对ADR的敏感性及细胞内ADR的浓度,降低P-gp表达。贝母素乙联合5-氟尿嘧啶（5-FU）给药可诱导SGC-7901/VCR细胞凋亡,凋亡细胞cleaved caspase-3呈高表达。结论 贝母素乙具有作为胃癌MDR逆转剂的潜力,其逆转耐药的机制可能与下调P-gp表达和诱导细胞凋亡有关。     

HepG2 细胞谷胱甘肽含量和谷胱甘肽转移酶活力的诱导

目的：建立一种具有较高ＧＳＨ含量和ＧＳＴ活力的肝细胞系。方法：将ＨｅｐＧ２细胞在０．１,０．３,０．５ｍｇ／Ｌ浓度的ＣＤＤＰ间歇作用下传代１２个月后得到三种稳定的ＣＤＤＰ耐药细胞系ＨｅｐＧ２／ＣＤＤＰ０．１,ＨｅｐＧ２／ＣＤＤＰ０．３,ＨｅｐＧ２／ＣＤＤＰ０．５细胞的ＧＳＨ含量和ＧＳＴ活力,结果用显著性ｔ检验方法作统计学处理。结果：诱导刺激后的子代ＨｅｐＧ２／ＣＤＤＰ０．１,ＨｅｐＧ２／ＣＤＤＰ０     

疾病词“癘”“痱”“脪”“瘘”等考证

对“癘”“”“痱”“”“脪”“瘘”等6个疾病词及其相关词汇进行考证。主要利用佛经音义相关材料,结合历代辞书、文献材料,与《汉语大字典》相关条目进行比对,补充了某些疾病词的书证,增补或订补了某些词的义项,纠正了某些词的注音及释义,明确了某些词之间的字际关系,并据此对《汉语大字典》中这些疾病词及其相关条目中存在的问题和缺漏进行了补正。     

应用重组促红细胞生成素治疗长期血透患者的贫血

作者应用重组促红细胞生成素(rHuEPO)治疗68例依赖输血的透析患者(醋酸盐血透32例,碳酸氢盐血透24例,血液滤过12例)。治疗前 Hb 52.7±8.0g/L,Ht19.4±2.2%,血清铁蛋白>100μg/L。rHuEPO 治疗剂量150～300 u·kg~(-1)/周,静脉推注。当 Hb>100～120g/L,Ht>30%～35%时将 rHuEPO 减至维持量。疗程6.2±4.3个月。所有患者经 rHuEPO 治疗后不再输血,Hb 和 Ht 均有不同程度上升。其中39例 Hb 净增大于60g/L,Ht 增加大于10%,分别占治疗病例的57.4%。结果表明,rHuEPO 剂量为150～300 u·kg~(-1)/周是安全有效的,副作用远较国外报道为低。     

高效液相 (HPLC) 荧光法同时测定人血浆中4种硫醇物的浓度

 目的  建立同时测定人血浆中半胱氨酸(cysteine,Cys)、同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)、半胱氨酰甘氨酸(cysteinylglycine,CysGly)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)等4种硫醇物的高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)。方法  血浆经磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)稀释后,用三(2-羧乙基)膦盐酸盐［tris-(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride,TCEP］还原,用三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶液进行蛋白沉淀,再用7-氟苯呋咱-4-硫酸铵盐(7-fluorobenzofurazan-4-sulfonic acid ammonium salt,SBD-F)进行衍生化反应,荧光检测器检测。色谱条件:色谱柱为Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm),柱温29 ℃;流动相为甲醇:0.1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH=4.5,3.5∶96.5,V/V),流速为0.8 mL/min,等度洗脱。激发波长385 nm,发射波长515 nm。采用外标法定量。结果  Cys、Hcy、CysGly和GSH的线性范围分别为50~800 μmol/L、4~64 μmol/L、10~160 μmol/L和2.5~40 μmol/L。Cys、Hcy、CysGly和GSH的最低检测浓度分别为2.5 μmol/L、1.0 μmol/L、1.0 μmol/L和1.0 μmol/L。各组分日内、日间精密度RSD均<12 %。平均回收率为95.01 %~116.17 %。结论  该方法具有检测时间短、灵敏性高、精密度和准确度好的特点,适用于临床人血浆中硫醇物浓度的常规检测。     

磁分离酶联免疫测定男性生殖激素方法性能评价

目的：对磁分离酶联免疫测定（MAIA）法测定男性生殖激素的方法学性能作临床和实验室评价。方法：将本法与放射免疫测定（RIA）法进行对比研究。结果：MAIA法测定促卵泡生成激素（FSH）、促黄体生成素（LH）、睾酮（T）和催乳素（PRL）的线性分别为0－150IU／L、0－200IU／L、0．5－55ng/L、0－250ng/L；最小检测量分别为0．3mIU/ml、0．25mIU/ml、4μIU/ml、4μIU/ml；批内CV＜4％，批间CV＜8％，平均回收率偏差＜5％，互感率＜3％；与RIA法比较，两法相关系数分别为0．9826、0．8550、0．8512、0．9831。临床质控观察60d，质控稳定；成年健康男性（n=95）血清FSH、LH、T、PRL的参考范围分别为：0．25－10．18IU／L、0．33－8．95IU／L、0．54－11．11ng/L和8．77－33．43ng/L。结论：用MAIA法测定男性生殖激素，方法灵敏，结果可靠，先例临床要求。     

磁场对大白鼠生殖功能的影响

本文采用放射免疫测定技术、通过检测雄性大白鼠体内 FSH、LH 及 T 和雌性大白鼠体内 FSH、LH 及 E_2的水平变化,研究了磁场对大白鼠生殖功能的生物学效应。实验结果表明,在表面静磁场为2000GS 的旋磁作用下,这些促性腺激素及性激素的含量均无明显改变。作者认为这一结果提示,磁场对大白鼠的生殖功能无不良影响,因而对磁疗技术在临床推广使用上的安全性问题提供了一个理论依据。