骨形态发生蛋白2基因治疗与缓释载体修复骨缺损的比较研究

[目的]比较骨形态发生蛋白2（BMP-2）基因治疗与生长因子缓释方法修复节段性骨缺损效果。[方法]于兔双侧桡骨中段造成1．5cm骨缺损，采用4种方法修复：A组植入转基因骨髓间质干细胞（MSCs）与PLA／PCL（聚乳酸／聚己内酯）支架的复合物；B组植入单纯MSCs与含重组BMP-2的PLA／PCL缓释载体的复合物；C组植入单纯MSCs与PLA／PCL复合物；D组植入单纯PLA／PCL。术后4、8、12周行X线、组织学、生物力学和骨密度等检测，[结果]A组体内植入4周后，成骨细胞和间质细胞呈BMP-2强阳性表达；其成骨速度及成骨质量均明显优于B组，12周时骨缺损完全修复、C组成骨能力较弱，而D组则无新骨形成，残留骨缺损。[结论]BMP-2基因治疗是修复节段性骨缺损的好方法。     

负载骨形态发生蛋白与血管内皮生长因子的超聚消旋乳酸修复兔桡骨缺损的实验研究

[目的] 探讨同时负载BMP、VEGF的PDLLA材料的体内成骨能力,以得到一种较好的可吸收骨构建材料.[方法] 成骨细胞分离培养后负载到PDLLA材料中进行兔桡骨缺损修复实验,术后4、8、12 周行X线、组织学及扫描电镜观察骨生成状况, 12周行生物力学测试(三点折弯强度).[结果] 术后实验组各观察阶段骨形成明显高于对照组,第12周三点折弯强度与对照组相比差异有显著性(P<0.01).[结论] 负载BMP及VEGF两种细胞因子PDLLA支架材料修复兔桡骨缺损效果明显优于负载单一细胞因子PDLLA支架材料, 是一种有临床应用前景的骨移植材料.     

基因修饰的组织工程骨联合带血管蒂骨膜移植修复长段骨缺损的研究

目的评价骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2,BMP-2）基因修饰的组织工程骨联合带血管蒂骨膜移植修复长段骨缺损的效果。方法分离培养兔骨髓基质干细胞,经BMP-2基因转染后复合异种骨支架体外构建基因修饰的组织工程骨（gene modified tissue engineering bone,GMB）。建立兔双侧桡骨缺损（长2.5cm）模型,采用5种方法修复。A组：GMB＋带血管蒂骨膜移植;B组：GMB＋血管束植入;C组：GMB＋游离骨膜移植;D组：GMB;E组：单纯支架。于术后第4、8、12周行X线、组织学、生物力学测定和微血管墨汁灌注等观察血管形成及成骨情况。结果①A组血运建立快,第8周时即可修复骨缺损,其修复机制包括膜内成骨和软骨成骨两种机制;②B组血管束发出分支向移植骨内长入,但中心区成骨缓慢,第12周时骨缺损得到完全修复;③C组第4周时游离骨膜成活并发出微小血管,第8周时形成薄层外骨痂,第12周时骨缺损基本修复;④D组在BMP-2基因诱导下成骨速度和质量优于E组,可在第12周时使骨缺损部分修复,但中心区呈＂空心＂现象;而E组第12周时形成骨不连,缺损区内被纤维组织填充。结论带血管蒂骨膜与BMP-2基因修饰的组织工程骨联合移植,既提供了血运又提供了骨膜成骨细胞,同时具有良好的骨生成、骨诱导和骨引导作用,是治疗节段性骨缺损较为理想的方法。     

透明质酸复合人骨形态发生蛋白-2转染兔骨髓基质干细胞的体内外成骨研究

目的观察透明质酸(HA)复合腺病毒介导的人骨形态发生蛋白(AdvhBMP)2基因转染的兔骨髓基质干细胞(BMSCs)的体内外诱导成骨活性。方法(1)体外成骨活性研究方法分成4组,AdvhBMP2转染细胞 HA组、AdvhBMP2转染细胞组、未转染细胞 HA组和未转染细胞组,采用免疫沉淀法(IP)、Western印迹法检测hBMP2表达、逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法检测骨涎蛋白mRNA表达、ALP和vonKossa染色及ALP定量检测;(2)裸鼠肌内诱导成骨实验裸鼠12只(共24侧)分4组注射AdvhBMP2转染细胞 HA组(n=8)、注射AdvhBMP2转染细胞组(n=8)、注射未转染细胞组(n=4)和单纯注射HA组(n=4),观察方法采用X线、成骨计量对照、组织学观察法。结果(1)AdvhBMP2转染细胞 HA组和AdvhBMP2转染细胞组BMSCs表达hBMP2和骨涎蛋白mRNA,两组的ALP活性均高于未转染细胞 HA组和未转染细胞组(P<0.01),并有明显的钙结节形成;(2)AdvhBMP2转染细胞 HA组和AdvhBMP2转染细胞组均有成骨,两组差异有显著性(P<0.01),未转染细胞和单纯注射HA组均未见成骨,局部以纤维和脂肪组织为主。结论HA复合AdvhBMP2基因转染的BMSCs在体外有较好的诱导成骨活性,在裸鼠肌内有良好的诱导成骨和成软骨的作用,是可注射性的骨缺损修复方法。     

血管内皮生长因子在骨形态发生蛋白-2诱导成骨过程中的表达

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）在骨形态发生蛋白-2（BMP-2）诱导成骨过程中的表达。方法采用昆明鼠20只，外科手术建立股部肌袋诱导成骨模型，以左侧为实验组，右侧为对照组。实验组肌袋内植入以明胶和羟基磷灰石复合物为载体的重组人骨形态发生蛋白（rh-BMP）-20．25mg；对照组仅植入空白载体。分别于术后3、7、14和21d取材，采用免疫组织化学和Western blot法检测VEGF的表达情况。结果术后3d可见大量问充质细胞聚集，胞质出现VEGF的表达（Western blot IA=4221．323±178．672），但随着间充质细胞分化为前软骨细胞并不断成熟，VEGF在间充质细胞内的表达逐渐消失，而在成软骨细胞和软骨细胞内的表达水平迅速提高（Western blot IA=7139．558±289．347），VEGF在成熟软骨细胞中的表达最为活跃（Western blot IA=15849．848±137．462），至到新骨形成，在成骨细胞和骨细胞中仍可检测到VEGF的强烈表达（Westernbid IA=9463．268±548．453）；而对照组则未检测到VEGF的表达。结论VEGF的表达贯穿BMP-2诱导成骨的全过程，并在成熟软骨细胞和成骨细胞呈现强烈表达；BMP-2具有促进VEGF合成与分泌的作用．rhBMP-2对成骨细胞VEGF表达的促进作用。     

假体周围骨溶解性骨缺损的转骨形态发生蛋白-2基因治疗

目的 模拟假体周围骨溶解环境,观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因治疗假体周围骨溶解性骨缺损的效果.方法 成年雄性Beagle犬6条,于股骨外髁造成假体周围3mm骨缺损区.1条动物的左侧缺损区植入1ml平均直径1μm的钛合金颗粒混悬液,右侧植入1ml磷酸盐缓冲液(PBS),观察造模结果;其他5条动物双侧植入1ml钛合金颗粒混悬液,于术后2个月取出假体,植入转BMP-2基因冻干骨或单纯冻干骨,二次术后3个月取材,行组织学、组织形态计量学观察植骨愈合替代及界面骨整合情况.结果 颗粒造模术后2个月可见典型的骨溶解界膜组织形成.翻修术后3个月,冻干骨组见较多植骨残余,假体-骨界面基本为软组织界膜,假体骨接触率(BIC)为(1.38±1.22)%;基因治疗组见少量植骨残余,假体-骨界面有点状骨接触,BIC为(12.96±1.61)%,两组差异有统计学意义(P<0.01).结论 采用BMP-2基因治疗可提高假体周围骨溶解性骨缺损的界面骨整合.     

骨形态发生蛋白与骨缺损的治疗

骨缺损的治疗一直是骨科领域的难题，BMP的出现为骨缺损的治疗带来了希望，本对骨形态发生蛋白及其治疗骨缺损的研究现状进行了综述。     

基因修饰的生物可降解人工骨修复骨缺损的血管化研究

目的评价转染骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）基因的骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）复合生物可降解人工骨修复兔桡骨缺损的血管化过程，观察BMP-2基因对促进移植骨血管化的影响。方法利用携带BMP-2基因的腺病毒载体（adenovirus carrying BMP-2 gene，Ad—BMP-2）转染MSCs及复合人工骨制备。取新西兰大耳白兔60只制成双侧桡骨中段1．5cm骨缺损模型，随机分为4组，每组15只（30侧）。各组采用不同材料植入缺损，A组：Ad—BMP-2转染MSCs＋聚乳酸／聚己内酯（polylactic acid／polycaprolactone，PLA／PCL）；B组：β-半乳糖酐酶基因的重组腺病毒转染MSCs＋PLA／PCL；C组：未转染MSCs＋PI，A／PCL；D组：单纯PLA／PCL。分别于术后4、8和12周各组处死5只动物，行X线片、微血管分布、组织学、透射电镜观察，并行血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达检测及微血管计数。结果A组4周时见移植骨内片状成骨影，有较多新生血管长入，支架孔隙内充满软骨痂，功能活跃的成骨细胞围绕微血管生长，VEGF表达及微血管数均明显高于其它各组，且差异有统计学意义（P〈0．01）；8周时移植骨内成骨逐渐增多，微血管迂曲扩张并相互连接，软骨痂转变为小梁骨；12周时皮质骨连续，髓腔再通，微血管呈规则地纵向排列。B、C组成骨能力较弱，血管再生缓慢，12周时骨缺损得到初步修复，微血管沿新生骨小梁孔隙分布。D组各时间点新生血管少见，12周时骨端硬化，缺损区被纤维组织填充。结论BMP-2基因转染可通过上调VEGF表达，间接诱导移植骨血管化，促进种子细胞成活，加速新骨形成。     

骨形态发生蛋白及其在骨缺损修复中应用进展

骨形态发生蛋白(BMP)有成骨作用,已应用于骨组织工程修复骨缺损。除成骨作用外,BMP在其他组织的发育中也发挥重要的生物学作用。目前BMP修复骨缺损的实验研究热点包括BMP复合各种有机或无机载体修复骨缺损、BMP多基因联合、BMP与其他生长因子协同作用、BMP转导或转染种子细胞后缓慢释放、诱导种子细胞向成骨细胞分化等。部分BMP已引入临床骨缺损治疗,并取得了显著疗效。大多数研究还处于实验阶段,有待进一步探索。     

聚乳酸作为骨形态发生蛋白载体修复骨缺损的实验研究

目的 探讨聚乳酸（ｐｏｌｙｌｄａｃ ａｃｉｄ,ＰＬＡ）作为骨形态发生蛋白（ｂｏｎ ｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏ－ｔｅｉｎ,ＢＭＰ）载体的可行性及观察其诱导成骨能力。方法 手术造成日本大耳白兔左尺骨中上段１２ｍｍ骨缺损实验模型。随机分为实验。对照及空白组,实验组植入以ＰＬＡ为载体的ＢＭＰ１０ｍｇ、对照组植入以牛松质骨基质为载体的ＢＭＰ１０ｍｇ、空白组不做任何处理,术后摄Ｘ线片观察各组不同时相骨缺损修复情况,并于术后第４、８、１２周观察各组缺损内组织学变化。图像分析骨小梁的生成量。结果 实验修复情况优于对照组,无论是骨连接发生时间还是骨成熟时间,实验组均较对照组提前２周左右,同期骨生成量也明显多于对照组,而空白组缺损内主要形成纤维组织。结论 ＰＬＡ可以作为ＢＭＰ的载体修复骨缺损,它比异种松质骨基质载体的成骨效     

BMP-2重组质粒转染人骨髓基质干细胞及表达蛋白的诱导活性观察

目的 构建骨形态发生蛋白-2(BMP-2)真核表达质粒，使其在人骨髓基质干细胞(hBMSCs)中表达，并观察表达产物的诱导成骨活性。方法在脂质体介导下将BMP-2基因导入hBMSCs，流式细胞仪、ALP检测和VEGF探针原位杂交分析其对细胞增殖、ALP活性和VEGF表达的影响。并利用转染后的培养液上清诱导小鼠成纤维细胞(L929)，检测其骨钙素、Ⅱ型胶原表达。结果 转染后细胞稳定表达BMIP-2基因，S期细胞比例增多，ALP活性和VEGF的表达明显增加。且诱导L929细胞骨钙素、Ⅱ型胶原阳性表达。结论 BMP-2重组质粒转染hBMSCs后表达目的蛋白，促进自身增殖、分化和上调VEGF的表达，并诱导成纤维细胞向成骨细胞转化，为BMP-2基因治疗奠定了实验基础。     

血管内皮生长因子及骨形态发生蛋白2对成骨细胞生长的促进作用

目的研究血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）以及骨形态发生蛋白2（bone morphogendtic protein 2,BMP-2）对成骨细胞增殖的调节作用。方法提取人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）并使其分化为成骨细胞,分别添加不同浓度的VEGF和BMP-2进行药物干预,用四甲基偶氮唑盐（MTT）法研究成骨细胞的增殖率。结果两组干预组的吸光度（A）值与对照组的A值相比较,差异有统计学意义（P〈0.05）,对成骨细胞增殖的调节作用均随剂量和时间变化而改变,两组调节作用的最佳时间均为72 h左右。两组最佳作用浓度分别为：BMP-2为1.8×10-9 mol/L,对成骨细胞的增殖率达179.59%;VEGF为1×10^-8 mol/L,其增殖率达189.80%。结论 VEGF对成骨细胞增殖的促进作用不亚于BMP-2。     

透明质酸复合BMP-2转染骨髓间充质干细胞修复兔桡骨干骨缺损

目的评价携带人BMP-2(hBMP-2)基因重组腺病毒(Adv-hBMP-2)转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)与透明质酸(HA)复合构建的组织工程化骨对骨缺损的修复效果。方法取兔骨髓行BMSCs培养及Adv-hBMP-2的体外转染,建立桡骨干1.5cm缺损模型。20只兔(40侧)分四组(n=10):第一至三组分别注射Adv-hBMP-2转染细胞 HA、Adv-hBMP-2转染细胞、单纯HA,第四组为空白对照。结果(1)注射后第12周,第一组8侧骨缺损中6侧完全愈合,皮质骨形成,部分髓腔再通;第二组8侧骨缺损中有3侧完全愈合;第三、四组骨缺损均未愈合。X线疗效评分各组差异有统计学意义。(2)第一、二组4～8周时骨缺损内有多量新生骨痂形成,12周时部分髓腔再通;第三、四组4～8周时骨缺损处为纤维组织填充,12周时骨缺损未愈合,两骨端硬化。第一、二组之间新生骨小梁面积差异有统计学意义。(3)第一组的最大压缩载荷和弹性模量分别为(211.54±63.58)N和(113.36±56.47)MPa,第二组为(126.74±53.13)N和(98.91±63.36)MPa,差异有统计学意义。平均最大压缩载荷与正常桡骨之比:前者为75.86%,后者为45.45%。结论HA复合Adv-hBMP-2转染BMSCs构建的组织工程化骨可以修复兔桡骨干骨缺损,HA是一种安全的、有效的组织工程载体。     

骨形态发生蛋白2基因转染的骨髓间充质干细胞修复羊胫骨干骨缺损

目的 评价腺病毒介导的人骨形卷发生蛋白2(Adv-hBMP-2）基因转染的羊骨髓间充质干细胞(BMSCs)对长骨干骨缺损的修复效果．方法 22只羊，体重18．1～29．5kg．制造羊胫骨干骨缺损(2．1cm)．分为4组：Ⅰ组．Adv-hBMP-2转染BMSCs组(8只)；Ⅱ组．腺病毒介导的β半乳槠苷酶(Adv-βgal)转染BMSCs组(6只)；Ⅲ组，未转染BMSCs组(6只)；Ⅳ组，未治疗组（2只)。细胞自身分泌的细胞外基质作为细胞载体。分期行X线、计量组织学检查和生物力学测定。结果 X线检查示Ⅰ组的羊胫骨干骨缺损内有明显骨痂形成；24周，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的愈合率分别为6/7、1／5、2／5及0／1，X线疗效评分显示Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ组的评分比较．差异有显著性意义。组织学检查显示，与其它组相比．Ⅰ组的新生骨量最多，并有皮质骨形成。生物力学测试示Ⅰ组的力学强度最大。结论 Adv-hBMP-2基因转染的BMSCs在缺乏骨传导性支架的条件下可修复长骨干骨缺损。     

基因修饰的组织工程骨修复节段性骨缺损及相关免疫学研究

目的：观察骨形态发生蛋白-2（BMP-2）基因修饰的组织工程骨修复节段性骨缺损效果及异种骨支架体内应用的安全性。方法：①制备去抗原牛松质骨块（BCB），植入小鼠股四头肌袋内，术后行淋巴细胞转化试验和组织学观察。②在腺病毒载体介导下将BMP-2基因导入兔骨髓间质干细胞后，种植到BCB支架中，构建基因修饰的组织工程骨。于兔双侧桡骨中段造成15mm骨缺损，采用5种方法进行处理：BMP-2基因转染细胞＋B（B（A组）；未转染细胞＋重组BMP-2＋BCB（B组）；对照基因转染细胞＋BCB（C组）；未转染细胞＋B（B（D组）；单纯BCB（E组）。术后4、8、12周行X线、组织学和生物力学检测。结果：①BCB具有较低的抗原性和良好的组织相容性；②A组术后4周诱导生成软骨组织并向编织骨转化，12周骨缺损修复，髓腔再通，新骨强度明显优于其他各组（P〈0．01）。结论：BMP-2基因修饰的组织工程骨是修复节段性骨缺损的好方法。     

骨形态发生蛋白-2基因活化纳米骨浆修复兔桡骨缺损的实验研究

目的观察骨形态发生蛋白-2（BMP-2）基因活化纳米骨浆在损伤部位的局部成骨基因表达和骨缺损重建修复效果。方法新西兰白兔54只，其中48只实验动物随机分成三组（每组16只32侧），制成双侧桡骨中段15mm骨缺损模型。A组：注入hBMP-2＋纳米骨浆；B组：注入空白质粒＋纳米骨浆；C组：注入纳米骨浆。另6只动物制作左桡骨中段骨缺损，不植入材料，作为空白对照。术后4、8和12周取材行影像学检查、组织学观察、分子生物学检测和生物力学检测。结果术后12周A、B和C组骨缺损均修复，A组骨缺损处有明显BMP-2的mRNA和蛋白质表达，在ALP水平、成骨速度、新生骨量及新生骨力学强度等方面均明显优于B、C两组（P〈0．05）。空白对照组骨缺损无愈合。结论纳米骨浆复合BMP-2质粒后，具有一定骨诱导作用，植入体内后成骨速度、质量及力学强度较单纯的纳米骨浆明显增强，能够有效修复骨缺损。     

转染重组人骨形态发生蛋白-7基因对骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的 观察重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)基因转染骨髓基质细胞(BMSCs)后的稳定表达及表达产物对BMSCs生物学行为的影响。方法利用脂质体介导法将rhBMP．7基因转染BMSCs，以G418筛选出阳性克隆并扩大培养，用免疫组织化学链霉抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法检测转基因细胞的稳定表达；转染48h后，用转基因细胞的培养液上清刺激正常培养的BMSCs，利用^3H标记的胞腺嘧啶氧核苷(^3H-TdR)掺入法、Na2^35SO4掺入法以及氯胺T法检测基因表达产物对BMSCs增殖、合成蛋白多糖以及胶原的影响。结果 转基因细胞4周时仍能表达外源性基因；基因表达产物能明显促进BMSCs的增殖以及蛋白多糖和胶原的合成。结论 rhBMP-7基因转染BMSCs后可获得稳定表达，且基因表达产物能促进BMSCs增殖。诱导其向软骨细胞分化并增强其生物学活性。