CHK1和CHK2 shRNA转染对食管癌细胞照射后G2期阻滞的影响

目的 观察RNA干扰细胞周期检测点激酶CHK1和CHK2表达对食管癌细胞照射后G2期阻滞的影响。方法 CHK1和CHK2基因各选择4段序列分别设计合成短发卡状RNA（shRNA）,分别与pENTR^TM／U6质粒连接后转染Eca109食管癌细胞。采用Western blotting检测CHK1和CHK2蛋白表达,RT-PCR检测其mRNA表达,流式细胞仪检测5Cy照射后细胞周期变化,克隆法检测5Cy照射后细胞存活率。结果 CHK1和CHK2基因各成功建立4个序列的shRNA连接质粒,转染Eca109细胞后均使其蛋白表达降低。用抑制效果最好的CHKI和CHK2shRNA转染Eca109细胞后,其mRNA表达下降;在转染后72h,子一代细胞CHK1和CHK2蛋白仍明显降低,并使5Cy照射后1h的CHK2-T68磷酸化水平降低,而对CHK1-S345磷酸化水平无明显影响。CHK1 shRNA转染的Ecal09细胞在5Gy照射后12h时,明显减轻G2期阻滞程度;转染后72h和5Cy照射后12h,子一代Eca109细胞G2期阻滞仍明显低于单纯5Gy照射组;而CHK2shRNA转染不影响照射后C2期阻滞。CHK1和CHK2shRNA转染可降低5Gy照射后Eca109细胞存活率。结论 shRNA转染对CHK1和CHK2蛋白表达的抑制效应至少可以持续3d,且可传递给子代细胞;CHK1 shRNA转染可以减轻Eca109细胞照射后G2期阻滞,增加放射敏感性。     

电离辐射对食管癌细胞周期及MDC1、53BP1蛋白表达的影响

目的 观察60Co γ射线照射后食管癌细胞周期、细胞凋亡及其相关蛋白表达的变化,为食管癌放射治疗、靶向治疗提供理论依据。方法 食管癌细胞株TE 13进行不同剂量（0、1、2、5、10、15Gy）照射后,应用流式细胞术分别检测照射后1、2、12、24和48h细胞周期和凋亡指数的变化;同时采用Western blot方法检测MDC1和53BP1蛋白表达情况。结果 TE 13细胞照射后12、24、48h,TE 13细胞的G0/G1期、G2/M期和S期的变化呈现明显剂量依赖性,1Gy和2Gy照射后12h,细胞G2/M期阻滞开始出现;5、10、15Gy照射后24h,细胞G2/M期阻滞最为明显,与对照组（0Gy组）相比,差异具有统计学意义（P<0.05）;15Gy照射后12h、24、48h,TE 13细胞的凋亡增加非常显著（P<0.01）;不同剂量照射后1、2、24h,TE 13细胞MDC1和53BP1蛋白表达未见明显变化（P>0.05）。结论 TE 13细胞经不同剂量放射线照射后,细胞周期出现明显的G2/M期阻滞,细胞凋亡指数明显增加,但对MDC1和53BP1蛋白表达未见明显影响。     

食管癌细胞照射后细胞周期及相关蛋白表达的变化

目的：探讨食管癌细胞照射后细胞周期、细胞凋亡及其相关蛋白表达的变化。方法：食管癌细胞株TE-1和TE-13照射2、5、10、15Gy后，应用流武细胞仪分别检测照射后6、24和48h细胞周期和凋亡指数变化、Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达。结果：2、5、10、15Gy照射0～48h，TE-1和TE-13细胞均出现明显剂量依赖性的G2／M期阻滞和解除变化；5～15Gy照射后48h，TE-13细胞在G2／M期阻滞逐渐解除时伴随着细胞凋亡的明显增加，而TE-1细胞凋亡不增加。2株细胞胞浆CHK2-p68磷酸化水平均呈随照射后时间延长而出现时相性变化，但与照射剂量无关；而CHK1、CHK2、CHK1-p345和CDK1蛋白表达均无明显变化。15Gy照射后24h，TE-13细胞胞浆中eyelin B1表达下降而TE1细胞中无明显变化。结论：病理不同分化的食管癌细胞照射后细胞周期、细胞凋亡以及细胞周期相关蛋白表达变化不尽相同。     

下调Chk1和Chk2基因促进射线照射后HeLa细胞凋亡

目的 探讨下调Chk1和Chk2基因对HeLa细胞射线照射后细胞周期和凋亡的影响及其作用机制.方法 应用流式细胞仪检测不同剂量60Co照射引起的HeLa细胞周期和凋亡的动力学变化,以激光共聚焦显微镜和Western blot法检测转染Chk1和Chk2正义寡核苷酸(sODN)和反义寡核苷酸(AsODN)对Chk1和Chk2蛋白表达的影响,以AnnexinV-PI法、凋亡细胞的周期特异性检测法及透射电镜观察单独或联合转染Chk1和Chk2反义寡核苷酸对射线照射后HeLa细胞凋亡的影响.结果 不同剂量的60Co照射可引起Hela细胞小同程度的G2/M期阻滞,15 Gy的60Co照射48 h后,G2/M期细胞可达75.53%±3.72%.当细胞周期阻滞解除后,细胞凋亡明显增加.转染Chk1 AsODN组的早期凋亡、晚期凋亡和死亡细胞共有94.42%±4.78%,明显高于转染Chk1 sODN组(44.35%±2.08%,P<0.0001);转染Chk2 AsODN组的凋亡细胞共有93.08%±5.24%,明显高于转染Chk2 sODN组(48.98%±3.35%,P<0.0001);而共转染Chk1和Chk2 AsODN组的凋亡细胞共有94.26%±4.92%,明显高于共转染Chk1和Chk2 sODN组(42.46%±2.56%,P<0.0001);共转染Chk1和Chk2AsODN组与仅转染Chk1 AsODN或Chk2 AsODN组比较,差异无统计学意义(P>0.05).凋亡细胞的周期特异性检测结果显示,转染Chk1和Chk2 sODN引起的凋亡主要来自于G1期细胞,而转染Chk1 AsODN或Chk2 AsODN后,G1期、S期、G2/M期的凋亡细胞均较对应sODN转染组明显增加,尤其共转染Chk1和Chk2 AsODN组更为显著.结论 射线照射激活细胞周期检测点信号传导通路引起细胞自我保护,是临床上产生放疗抵抗的主要原因,而阻断该信号通路的关键激酶Chk1或Chk2,可显著增强细胞的放射敏感性,其机制在于改变了凋亡细胞的周期特异性,凋亡细胞可以来自G1、S、G2/M各周期的细胞.     

RNA干扰MDC1基因对食管癌细胞X线照后细胞周期及相关蛋白表达影响

目的 利用RNA干扰技术降低食管癌细胞ECA109中MDC1基因表达, 观察照射后细胞周期和放射敏感性变化并探讨相关机制。方法 针对MDC1mRNA序列设计合成3对有效干扰序列和阴性对照序列, 与载体pSIH1-H1-copGFP形成重组质粒, RT-PCR和蛋白印迹法测定MDC1mRNA和蛋白水平表达。克隆形成实验检测细胞放射敏感性, 流式细胞术检测细胞周期, 蛋白印迹法检测CHK1、CHK2蛋白表达, 激光共聚焦显微镜观察细胞核内MDC1斑点数量。单因素方差分析组间差别。结果 成功构建pMDC1-shRNA质粒并感染ECA109细胞, 获得稳定转染细胞ECA109M。ECA109M细胞MDC1mRNA、蛋白表达水平低于ECA109N、ECA109细胞(P=0.032、P=0.041)。5 Gy照射后ECA109M细胞G₂+M期比例低于ECA109N、ECA109(P=0.026)。5 Gy照射后ECA109、ECA109N、ECA109M细胞中CHK1和CHK2蛋白表达相近(P=0.345和P=0.451), ECA109M细胞CHK2T68蛋白表达低于ECA109、ECA109N细胞(P=0.012)。ECA109细胞D₀值为3.06 Gy, SF₂值为0.91;ECA109N、ECA109M细胞的D₀值分别为2.90、1.88 Gy;SF₂值分别为0.89、0.84(P=0.021;P=0.037)。结论 RNA干扰降低MDC1蛋白表达后可以降低细胞周期相关蛋白的表达, 解除细胞周期阻滞, 增强食管癌细胞ECA109的放射敏感性。     

慢病毒介导的RNAi沉默食管癌Eca109细胞MDC1基因表达对裸鼠移植瘤放射敏感性的影响

目的 研究抑制MDC1基因的蛋白表达对裸鼠移植瘤的影响,观察裸鼠肿瘤病理组织学和细胞生物学特征的变化。方法 根据MDC1 mRNA序列,设计合成3对有效的干扰序列和阴性对照序列,并与载体pSIH1-H1-copGFP形成重组质粒,RT-PCR和蛋白印迹法测定MDC1 mRNA和蛋白表达水平,筛选出阴性转染组(ECA109-N)、MDC1转染组(ECA109-M)细胞,将其接种裸鼠分为ECA109-M、ECA109-N、ECA109组,上述各组又分为⁶⁰Coγ射线照射组和未照射组。观察各组裸鼠移植瘤照射后体积变化,蛋白印迹法检测移植瘤组织中CHK1、CHK2、CHK2T68表达水平,流式细胞仪分析裸鼠肿瘤组织中细胞周期分布和细胞凋亡情况。多组样本均数间的比较采用方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验。结果 成功构建pMDC1-shRNA质粒并转染ECA109细胞,获得稳定转染细胞ECA109-M。所有接种裸鼠均成活并在接种后1周左右可见裸鼠爪下形成移植瘤,各组之间肿瘤大小相近(P>0.05)。15 Gy照射后单纯照射组和空载照射组裸鼠的肿瘤生长速度慢于未照射组(P<0.05),其中MDC1转染联合照射组较阴性对照组和空白组肿瘤相对生长速率降低(P<0.05),生长抑制率升高(P<0.05)。MDC1转染联合照射组q值为1.36。MDC1转染联合照射组裸鼠体内CHK1和CHK2的蛋白表达水平相近(P>0.05),但CHK2T68磷酸化水平明显降低(P<0.05),各组裸鼠肿瘤组织中细胞周期分布和凋亡细胞比例也相近(P>0.05)。结论 RNA干扰降低MDC1蛋白表达后可有效增强细胞的放射敏感性,表现为抑制了⁶⁰Coγ射线照射后裸鼠移植瘤的生长速度。     

Bcl-2基因表达抑制联合射线对NCI-H460细胞增殖状态及细胞周期影响的研究

目的 利用RNAi技术抑制Bcl-2基因的表达,联合放疗后观察其对非小细胞肺癌NCI-H460株细胞周期及细胞增殖状态的影响。方法 利用以pCYU6/GFP/Neo为载体的Bcl-2/shRNA重组质粒转染非小细胞肺癌NCI-H460细胞株,采用Western blot方法检测Bcl-2基因蛋白表达水平的变化,继而给予直线加速器6 Gy X线照射,采用MTT法和流式细胞术检测RNA干扰及照射后对NCI-H460细胞增殖和细胞周期的影响。结果 成功转染并经筛选获得阳性转染成功的细胞(HT),荧光显微镜下可见发绿色荧光的NCI-H460细胞,证明转染成功;Western blot检测显示Bcl-2蛋白表达水平显著降低;X线照射6 Gy,24 h及48 h后转染有义序列组细胞增殖情况较无义序列组及未转染组明显降低;流式细胞术显示转染有义序列细胞组经照射后24小时G₂/M期分布比例增高,48小时后G₂/M期分布比例显著减低。结论 RNAi技术可以有效的抑制非小细胞肺癌NCI-H460细胞Bcl-2基因表达,联合放疗后NCI-H460细胞的增殖率及细胞周期发生改变,起到一定的放射增敏作用。     

全反式维甲酸联合射线对食管癌细胞TE13增殖及凋亡的影响

目的:研究全反式维甲酸( all-trans-retinoicacid,ATRA)联合放射线照射对食管癌TE13细胞增殖、凋亡的影响及可能的作用机制.方法:采用MTT法检测ATRA对人食管癌细胞TE13增殖的影响;以其对TE 13细胞生长抑制率(inhibitory rate,IR)达25％、50％和75％时的ATRA的浓度分别联合γ-射线进行分组处理细胞;FCM法分析ATRA单药及联合放射治疗对TE13细胞周期及凋亡的影响;采用克隆形成实验分析对克隆形成率和细胞存活率的影响;采用FCM法检测cyclinD1蛋白的表达.结果:ATRA对TE13细胞有增殖抑制作用,且呈剂量和时间依赖性;ATRA浓度为0.78、6.25和12.5 μmol/L作用48 h后,其对TE13细胞的IR分别达到22.0％、55.1％和71.1％.ATRA联合γ-射线(4 Gy)与ATRA单药组比较,可明显降低TE13细胞的存活率和克隆形成率;ATRA联合γ-射线(4 Gy)处理TE13细胞24和48 h后,细胞增殖能力明显下降,更多的细胞被阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率明显增加,与ATRA单药组比较,联合放射治疗可明显增强对TE13细胞周期和凋亡的影响;ATRA浓度为0.78 μmol/L时和γ -射线联合作用对细胞周期cyclinD1蛋白表达量影响不大,但ATRA浓度为6.25和12.5 μmol/L时则能明显下调cyclinD1的表达.结论:ATRA对TE 13细胞具有明显的增殖抑制作用,其可能通过下调cyclinD1蛋白的表达,将TE13细胞阻断于G0/G1期并诱导细胞凋亡.在ATRA浓度较高时联合放疗,能显著下调cyclinD1蛋白表达,加强细胞G0/G1期阻滞及促进凋亡,抑制细胞克隆的形成能力;在ATRA浓度较低时联合放疗对原代细胞cyclinD1蛋白表达量的影响较小,但对促进细胞凋亡、抑制细胞克隆仍有一定的效果,其损伤效应可能需要一定时间.     

60Co分割照射对鼻咽癌细胞生长增殖影响的观察

目的:观察不同剂量射线分割照射对鼻咽癌细胞株CNE-2细胞生长和细胞周期素(Cyclin)D1及增殖细胞核抗原(PC-NA)的影响.方法:0、2.0、4.0、6.0 Gy60Coγ射线分割照射CNE-2细胞1次/d,共5 d.四唑盐(MTT)比色法测定细胞抑制率;流式细胞术检测细胞周期.PCR检测PCNA和CyclinD1表达水平.结果:2.0、4.0、6.0 Gy60Coγ射线分割照射5次/5 d后各组细胞生长抑制率分别为-17.05%、4.01%和1 5.52%;各照射组G1期细胞数量减少,S+G2/M期细胞数比例增多,X2=16.53,P<0.001.0、2.0、4.0、6.0 Gy60Coγ射线分割照射CNE-2细胞5次/5 d,Cyclin D1表达水平随照射分割剂量增加而下降直至不表达,P值分别为0.035、0.022和0.000.2.0 Gy照射CNE-2细胞5次/5 d,细胞生长增殖未受到抑制,PCNA表达无下调,P=0.471;4.0和6.0 Gy照射CN E-2细胞5次/5 d,细胞生长增殖受到抑制,PCNA表达下调,P值分别为0.028和0.016.结论:4.0、6.0 Gy60Coγ射线分割照射5次/5 d,细胞生长增殖受到抑制;2.0 Gy照射5次/5 d细胞生长增殖未受抑制;2.0、4.0、6.0 Gy60Coγ射线分割照射5次/5 d后,Cyclin D1和PCNA表达受抑制.     

mRNA干扰BMI-1对人食管癌细胞放射增敏作用研究

目的 研究BMI-1对食管癌TE-13细胞放射敏感性的影响及其机制。方法 以TE-13细胞为研究对象,分为转染有效BMI-1 mRNA干扰序列(siRNA)即BMI-1 siRNA组、转染阴性对照序列即NC组、未转染即control组。qRT-PCR和蛋白印迹法检测TE-13细胞中BMI-1 mRNA和蛋白表达水平;MTT法和克隆形成实验检测BMI-1对食管癌TE-13细胞增殖和放射敏感性影响;流式细胞术检测BMI-1对TE-13细胞周期、凋亡的影响;蛋白印迹法检测细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达水平。组间差异采用方差分析。结果 BMI-1 siRNA组BMI-1 mRNA和蛋白表达水平均显著低于control、NC组(P=0.000、0.000)。照射后BMI-1 siRNA组肿瘤细胞的增殖水平、克隆形成能力均显著下降(P=0.031、0.000);照射后BMI-1 siRNA组G₂+M期细胞比例显著低于control、NC组(P=0.000、0.000),且凋亡率明显增加(P=0.000、0.000),同时Bcl-2的表达显著降低(P=0.000、0.000),而Bax表达明显增加(P=0.000、0.000)。结论 干扰siRNA抑制了食管癌TE-13细胞中BMI-1基因的表达,消除了G₂+M期阻滞,显著提高了电离辐射后细胞凋亡水平,增加了放射敏感性,该作用可能与Bcl-2和Bax基因表达有关。     

CHK1和CHK2在食管癌组织中的表达

目的观察CHK1和CHK2在食管癌和癌旁不典型增生组织中的表达及其与食管癌单纯放疗疗效的关系。方法采用WesternBlotting方法检测33例胃镜活检标本诊断为食管鳞癌以及12例癌旁不典型增生组织中CHK1和CHK2蛋白表达,分析单纯放疗的疗效及预后相关因素。结果33例食管癌组织和12例癌旁不典型增生组织中CHK1和CHK2蛋白表达量均无明显差别(P>0.05)。33例食管癌病人单纯放疗后1年生存率为61.44%,中位生存期11.5个月;单因素分析显示年龄、食管造影X线病变长度、CT扫描显示病变长度、临床T分期、N分期、近期疗效以及临床分期均与食管癌放疗预后有关(P<0.05);COX多因素分析仅临床分期为独立预后因素;而食管癌组织中CHK1和CHK2表达对预后无明显影响(P>0.05)。结论CHK1和CHK2不能作为判断食管癌放疗预后的指标,而临床分期则是影响食管癌单纯放疗疗效的主要因素。     

PCDGF shRNA对乳腺癌细胞系MCF-7增殖凋亡和VEGF表达的影响

背景与目的：畸胎瘤细胞源性生长因子（PC cell-derived growth factor,PCDGF）是调节乳腺癌细胞增殖和凋亡的重要因子,然而其作用机制目前尚不清楚。本研究通过构建并体外转染针对PCDGF的shRNA,分析PCDGF对乳腺癌细胞系MCF-7增殖、凋亡及细胞中血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响。方法：RT-PCR法检测PCDGF在4种乳腺癌细胞系中的表达,构建含2条shRNA的RNAi质粒,脂质体转染质粒于MCF-7细胞中,MTT法检测转染前后细胞增殖变化,ELISA法检测VEGF表达。结果：被检测的4种乳腺癌细胞中均有不同程度的PCDGFmRNA表达,转染shRNA质粒对MCF-7细胞PCDGF mRNA表达抑制率为59．8％;转染质粒后MCF-7细胞增殖受到抑制,实验组早期细胞凋亡率为30．41％,晚期细胞凋亡率为35．38％;阴性对照组早期细胞凋亡率为3．69％,晚期细胞凋亡率为15．39％。同阴性对照质粒相比,转染阳性质粒的MCF-7细胞VEGF的表达抑制率为47．2％。结论：PCDGF调节MCF-7细胞的增殖、凋亡和VEGF的表达。     

CDK1、CDK2 siRNA干扰对肿瘤细胞凋亡和细胞周期的影响

Objective: We investigated the influence of CDK1 and CDK2 expression inhibited by cotransfection of CDK1 and CDK2 siRNA on cell cycle and apoptosis, explored the exact role of cell cycle master regulator in tumor cell apoptosis process. Methods: The siRNA targeting the CDK1 and CDK2 genes were synthesized and simultaneously cotransfected into Hela cells by lipofectamine 2000.48 or 60 h after the cotransfection, CDK1 and CDK2 protein expressions were examined by Western blot. Cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry. Cell apoptosis was detected by the Annexin V/PI method. The changes of the transfected cell morphological under a microscope after Wright-Giemsa Staining were studied. Results: CDK1 and CDK2 protein expression was decreased at 48 or 60 h after cotransfection. The accumulation of the G2/M and S phase population in cell cycle of the cotrensfected cells at 48 or 60 h after transfection was enhanced obviously compared with control. The ratio of apoptotic cell of cotransfected cells at 48 or 60 h after transfection was increased significantly compared with control. More binucleate or multinucleate cells among cotransfected cells were observed under the microscope. Conclu- sion: The decreased expression of CDK1 and CDK2 by cotransfection of CDK1 and CDK2 siRNA not only leads to tumor cell cycle arrest in S phase and G2/M phase, but also induces tumor cell apoptosis.     

A selective cyclooxygenase-2 inhibitor, NS398, inhibits cell growth and induces cell cycle arrest in the G2/M phase in human esophageal squamous cell carcinoma cells

It is well known that cyclooxygenase (COX) -2 is expressed in a variety of human malignant solid tumors, associated with tumor angiogenesis, cell proliferation and inhibition of apoptosis. Here, we examined the effect of NS398, a selective COX-2 inhibitor, on two human esophageal squamous cell carcinoma (SCC) cell lines, TE-1 and TE-12. Western blot analysis confirmed the expression of COX-2 in TE-12, but not in TE-1. Treatment with 100microM NS398 suppressed the cell viability in TE-12 (48.6% of control) after 48 hours, in contrast to showing no effects in TE-1. The apoptotic index was extremely low in both cell lines after the treatment. NS398 clearly increased the number of cells in the G2/M phase and decreased the cells in the G1 and S phases in TE-12, but not TE-1. A pre-G1 fraction was not noted in either cell line. Moreover, TE-12 cells showed a decrease in the expression levels of cyclin B1 and an increase in p27Kip1. These findings suggest that NS398 inhibits cell growth and induces G2/M arrest in human SCC cells expressing COX-2.