基因芯片技术对乙型肝炎病毒拉米夫定耐药基因变异检测的临床应用

目的通过对应用拉米夫定治疗患者HBV基因耐药性变异的长期监测，验证基因芯片技术的临床应用前景。方法针对HBV3个主要的拉米夫定耐药性相关突变设计探针，制成HBV耐药寡核苷酸芯片，选取51例应用拉米夫定进行治疗的乙型肝炎患者分别采用基因芯片和传统测序的方法对其进行24个月的监测，观察HBV基因变异情况。结果39％的患者在用药2年内发生了耐药性突变，使用基因芯片与传统的测序方法得到的结果一致，并且可以在早期方便检测出混合感染。结论应用基因芯片技术可以准确，高效的检测出耐药基因变异，具有临床应用价值。     

PCR-RFLP结合克隆测序监测乙肝病毒拉米夫定耐药突变株的产生

目的 建立PCR结合酶切的方法监测慢性乙型肝炎患者体内拉米夫定耐药突变株的产生,并与PCR产物克隆后测序相结合。了解此方法的可靠性和可行性,同时用此方法筛查50例应用拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者中耐药株的发生情况。方法 拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者50例,治疗时间9个月-24个月,设计错配PCR结合限制性片段长度多态性方法,快速检测患者体内乙型肝炎病毒（HBV）酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸（Tyrosine-Methionine-Aspartic acid-Aspartic acid,YMDD)变异株的发生情况,对筛检耐药株阳性的标本应用PCR产物克隆后测序加以证实。结果 在50例服用拉米夫定患者中发现9斧正患者在用药超过9个月时出现拉米夫定耐药突变株（YMDD变异株）,其中YIDD变异5例,YVDD变异4例,后者有3例合并有1526M突变。结论 本方法在检测YMDD变异方面具人快速简便的特点,经克隆后测序证实,具有较好的可靠性。     

拉米夫定抗乙肝病毒治疗研究近况

拉米夫定是一种核苷酸类似物,具有抗乙肝病毒效应,其作用机理可能是抑制DNA聚合酶活性;拉米夫定治疗使HBVDNA复制明显要抑制,伴随组织学改善,100mg／日可能是最佳的治疗剂量,停药后复发率与疗程有关;拉米夫定抗HBV治疗较安全,不良反应轻微;DNA聚合酶YMDD变异可能导致抗拉米夫定病毒株的产生;低病毒水平、高转氨酶水平是拉米夫定治疗有效的指标。     

乙肝病毒YMDD基序变异的分子生物学检测方法

拉米夫定治疗乙肝6个月以上就会产生耐药性,这与HBV YMDD基序变异有关。目前检测YM- DD变异的检测技术主要有直接测序法、限制性片断多态性分析(RFLP)、5′-核酸酶检测法、基因芯片法、实时定量PCR、焦磷酸测序(pyrosequencing)技术、高效变性液相色谱法(DHPLC)等。这些方法各有利弊,并且有些弊端暂时还没有较好的解决方法。     

拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者HBVP区基因突变模式与基因型的关系

目的分析慢性乙型肝炎患者在拉米夫定（LAM）治疗过程中出现耐药后,HBVP区基因突变模式及基因分型的关系。方法对2008年9月至2010年6月在我院就诊的107例临床诊断为LAM耐药慢性乙型肝炎患者进行HBVP区及基因分型测定。结果107例患者的基因突变模式为8种,100％均发生YMDD序列突变,其中单位点突变43例,其余均为联合突变;107例患者主要以B（25．2％）和C（73．8％）基因为优势,1例为B和c混合基因,且c基因以rtM204＋rtL180M模式为主,占60．7％（48／79）,B基因以rtM204突变模式为主,占66．7％（18／27）;rtM204和rtM204＋rtL180M突变模式的B和C基因比较两者差异有统计学意义（x2分别为8．4和7．2,P〈0．01）。结论YMDD基序突变是LAM耐药后HBVP区基因突变的主要模式,不同基因型决定了与耐药相关的变异出现形式。     

限制性片段长度多态性分析拉米夫定治疗引起乙型肝炎病毒耐药基因变异的研究

目的　应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析方法 (PCRRFLP) ,研究拉米夫定治疗引起慢性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒耐药基因 (HBVDNA)变异。方法　收集 2 4 0例用拉米夫定治疗 5 2～ 78周慢性乙型肝炎患者的血清标本 ,应用PCRRFLP方法扩增HBV 5 5 2 ,5 2 8两个基因位点片段 ,用限制性内切酶NdeⅠ ,NlaⅢ酶切分析 ,同时测定HBVDNA含量 ,并用DNA序列分析测定 3例患者HBVDNAP区基因序列 (1例野毒株 ,1例M5 5 2V伴L5 2 8M变异 ,1例M5 5 2I变异 )。结果　 2 4 0例患者应用拉米夫定治疗 5 2～ 78周后 ,5 1例血清HBVDNA出现YMDD变异 ,其中M5 5 2V变异 38例 ,M5 5 2I变异 13例 ,L5 2 8M和M5 5 2V同时变异 2 6例 ,L5 2 8M和M5 5 2I同时变异 1例。与定量PCR比较 ,可以测定YMDD变异的最低含量为 1× 10 4 copies mlHBVDNA序列分析结果与RLFP测定一致。结论　PCRRLFP方法是一种快速、简便的检测HBVDNA聚合酶变异的方法 ,可以用来筛查大量的血清标本 ,适宜作为临床用来观察拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者检测HBV变异的方法     

基因芯片检测拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中HBV变异技术的建立和应用

目的建立乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片对拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中出现的肝炎病毒P基因区YMDD变异进行快速准确的检测诊断。方法设计特异性寡核苷酸探针阵列,特殊处理芯片载体。用点样法制备乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片。在本院住院治疗患者中选择30例服用拉米夫定后,HBV DNA转阴(<500 copies/ml)168周后又反跳≥5 000 copies/ml的患者进行基因芯片杂交检测分析。同时用PCR直接测序法对上述30例患者血清标本进行双盲HBVDNA聚合酶活性区域测序对照。结果 30例服药后HBVDNA反跳患者中基因芯片测得HBV YMDD变异21例,其中YVDD变异11例。YIDD变异10例。HBVDNA PCR直接序列测定结果,有核苷酸A741变为G,使氨基酸由蛋氨酸552变为缬氨酸(氨基酸基序由YMDD变为YVDD)11例,并有6例核苷酸A669变为C,使氨基酸由亮氨酸528变为蛋氨酸。核苷酸G743变为T,使氨基酸由蛋氨酸552变为异亮氨酸(氨基酸基序由YMDD变为YIDD)10例。其中有3例伴有核苷酸T781变为C,使氨基酸由亮氨酸565变为脯氨酸。标本阳性变异序号与基因芯片检测结果完全一致。结论 乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片可以同时检测YVDD,YIDD变异,同PCR直接测序法比较,准确率达100％,无假阳性。     

HBVYMDD拉米夫定耐药变异及其检测的研究进展

主要阐述HBV多聚酶及其逆转录酶区C区的分子结构，YMDD基序及其变异的含义、类型及诱其发生的背景，YMDD变异病毒对拉米夫定耐药的分子机制，目前用于检测HBVYMDD变异的分子生物学方法。     

阿德福韦治疗拉米夫定耐药慢性乙肝患者的疗效

目的拉米夫定是临床上最早应用于慢性乙型肝炎治疗的抗病毒药物,但是随着治疗时间的延长,有部分患者会对拉米夫定产生耐药性,从而影响了临床治疗的效果,而对耐药患者的治疗成为临床上亟待解决的问题。本研究选用阿德福韦联合拉米夫定和阿德福韦单药治疗拉米夫定耐药的慢性乙型肝炎,以观察阿德福韦的疗效和安全性。方法选取经拉米夫定治疗后产生YMDD耐药的慢性乙型肝炎患者62例,将患者随机分成两组:A组采用阿德福韦(10mg,每日1次口服)联合拉米夫定(0.1g,每日1次口服)治疗72周;B组采用阿德福韦单药治疗72周。治疗期间分别于治疗的第12周、24周、48周、72周检测乙肝病毒标志物检测(HBV-M),HBV DNA定量、肝功能,并记录。结果第12、24、48、72周时A组ALT复常率为59.3%、71.9%、78.1%、87.5%,B组为33.3%、36.7%、40.0%、53.3%;A、B组的HBV-DNA阴转率分别为56.3%、62.5%、71.9%、90.6%;30.0%、33.3%、40.0%、53.3%;A组HBe Ag阴转率、HBe Ab转换率为50.0%、65.6%、75.0%、90.6%;B组为20.0%、26.7%、46.7%、66.7%。应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析,判定为差异有统计学意义(P<0.05)。结论 1阿德福韦联合拉米夫定的疗效,要明显优于阿德福韦单药治疗;2提示阿德福韦能有效抑制拉米夫定耐药株的复制,阿德福韦联合拉米夫定和阿德福韦单药治疗对拉米夫定耐药的慢性乙型肝炎都具有较强的抗病毒作用;3阿德福韦联合拉米夫定治疗拉米夫定耐药的慢性乙型肝炎可以降低耐药的发生。     

拉米夫定阻断乙肝病毒母婴传播的临床研究

目的观察拉米夫定阻断乙肝病毒(HBV)母婴传播的效果和安全性.方法选择HBsAg/HBeAg双阳性,且HBV DNA阳性妇女64例,治疗组32例孕前给予拉米夫定口服,对照组32例不用任何抗病毒药物自行妊娠,婴儿出生时、1年时检测两对伴和HBV-DNA.结果治疗组妇女所产婴儿出生时、1年时检测两结伴和HBV-DNA均阴性,儿科智力/体格检查均未发现异常;对照组妇女所产婴儿出生时检测HBsAg阳性25%(8/32),HBsAg/HBeAg双阳性9.37%(3/32),HBV-DNA阳性18.75%(6/32),两组新生儿HBV感染率有显著性差异(P＜0.05).结论拉米夫定用于预防乙肝病毒(HBV)母婴传播有确切效果和近期安全性,值得临床进一步探讨.     

乙型肝炎病毒耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法研究

目的 建立简便、准确、实用的检测乙型肝炎病毒耐拉米夫定多聚酶(P)基因变异的方法。方法 根据HBV基因序列，设计5只寡核苷酸引物，用巢式聚合酶链反应(nested PCR)分别扩增HBVP基因B区和C区片段，产物用NdeⅠ或NIa Ⅲ酶切，琼脂糖胶电泳，分析酶切产物长度多态性(RFLP)，建立检测P基因变异的方法。对30例长期服用拉米夫定的慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者检测YMDD基序及526位点变异，16例未用拉米夫定的慢乙肝患者为对照。4份PCR产物作克隆测序以验证方法的准确、可靠。结果 所建的巢式PCR-RFLP方法操作简便、快速，从模板提取到酶切后电泳分析仅需11h；灵敏度高，可检测到10^3拷贝／ml的HBVDNA；结果准确，4份经酶切分别判断为野毒株或变异株的标本经测序证实。30例用拉米夫定的慢乙肝患者中，发现单纯YMDD变异8例(26．7％)，YMDD联合L526M变异3例(10．0％)，16例对照未检出上述位点的变异。结论 本方法简便、准确，适合较大样本检测。可用于临床筛检常见拉米夫定耐药性HBVP基因变异。     

慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗前后外周血树突状细胞和淋巴细胞亚群的变化及意义

目的 分析慢性乙型肝炎患者拉米夫定抗病毒治疗前后外周血树突状细胞和淋巴细胞亚群变化。方法 对16例拉米夫定抗病毒治疗有效的慢性乙型肝炎患者动态观察48周，在治疗前、后对外周血单核细胞来源的树突状细胞进行体外培养，用流式细胞仪检测DC表面分子及淋巴细胞亚群水平，观察治疗前、后的变化。结果 16例患者中，11例治疗持续有效，未发生YMDD变异，5例发生变异。无变异组的慢性乙肝患者，治疗12周时，HLA—DR水平较治疗前降低（P〈0．05）；治疗48周时，CD80、CD40和CD1a与治疗前比明显提高（P〈0．05）而HLA—DR恢复至治疗前水平。变异组患者。治疗12周时，CD83及HLA—DR降低（P〈0．05）；治疗48周时，HLA-DR仍低于治疗前（P〈0．05）。无变异组患者，治疗12周时，CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞、NK细胞、CD19^＋B细胞和CD4^＋／CD8^＋T细胞比值均无明显变化；48周时，CD4^＋T细胞比例增高，NK细胞比例下降（P〈0．05）。而变异组患者的淋巴细胞亚群则无显著改变。结论 拉米夫定治疗持续有效组，DC表面共刺激分子CD80、CD40可随着HBV被长时间有效抑制而得到部分恢复，治疗过程中有DC表面的HLA-DR暂时降低，而后HLA—DR水平恢复和CD1a明显提高，同时外周血CD4^＋T细胞比例上升和NK细胞比例下降。而发生YMDD变异组。DC表面HLA—DR呈现持续性降低。     

PCR-RFLP检测拉米夫定抗HBV感染中聚合酶YMDD变异

目的 建立用PCR－限制性片段长度多态性技术（PCR－RFLP），分析拉米夫定抗HBV感染中聚合酶YMDD变异方法。方法 在拉米夫定抗HBV治疗过程中HBV DNA由阴性再次转为阳性患者及HBV DNA始终保持阳性的血清达1年或1年以上，用3对引物扩增HBV P基因的C区，扩增产物分别用3个限制性内切酶分析，酶切结果用8.4%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。检测HBV YMDD变异，同时血清用全自动测序仪检测YMDD变异。分析比较两者结果。结果 35例病人，包括33例HBV DNA再次阳性患者，2例用药1年HBV DNA未转阴。14例病人出现YMDD变异。PCR－RFLP结果为6例YVDD变异、4例YIDD、1例YI／MDD、21例YMDD与测序一致。另3例PCR－RFLP结果为YI／VDD，即混合变异，测序报告为2例YIDD、1例YVDD，分析相应的测序图，存在混合变异。并把YIDD与YVDD变异的血清混合，行PCR－RFLP，结果与YI／VDD一致。结论 用PCR－RFLP能快速、简便、灵敏地检测YMDD变异。     

一种BRAF基因突变检测方法的建立

目的 建立一种适用于临床样品检测的BRAF基因V600E突变的检测方法.方法 利用已知BRAF基因野生型、突变型样品,以BRAF基因15外显子V600E突变为靶位点设计特异性扩增引物和测序引物,建立BRAF基因V600E突变的SYRB Green PCR-Sanger测序检测方法,并对该方法进行方法学评价和21例结直肠癌临床样品检测.结果 成功建立了BRAF基因V600E突变SYRB GreenPCR-Sanger测序检测方法,该方法的灵敏度达5.0×101拷贝/ul,检测线性范围5×101～ 5×107拷贝/ul,且检测的重复性好.检测21例结直肠癌临床样品,突变率为9.5％(2/21).结论 成功建立了BRAF基因V600E突变SYRB Green PCR-Sanger测序检测方法,该方法可用于临床样品的检测.     

C基因截短的HBV复制与包装

目的 探讨C基因截短型HBV变异体的复制与包装。方法 采用分子克隆、人工定点突变等技术构建C基因截短型HBV变异体质粒，用脂质体法转染HepG2细胞，提取细胞内及培养上清液中DNA分别进行Southem杂交，PCR及实时定量荧光PCR分析。结果 经DNA测序及酶切鉴定证实C基因截短型HBV质粒载体构建成功；C基因截短型HBV为复制缺损型，与辅助质粒共转染HepG2细胞，可在细胞内及培养上清液中检测到HBV各种DNA构型；DNA定量分析提示C基因截短型HBV的包装效率较野生型HBV提高3～40倍。结论 C基因截短型HBV变异体为复制缺损型，单独转染后不能在肝细胞内包装与复制，但在缺失包装信号ε的相应辅助病毒辅助下可有效复制并包装成子代病毒颗粒分泌到胞外，且包装效率大大提高。     

拉米夫定耐药后的抗乙型肝炎病毒治疗

目的探讨拉米夫定耐药后慢性乙型肝炎患者采用α2b干扰素或α2b干扰素加α1胸腺肽进行后续抗病毒的疗效。方法共66例拉米夫定耐药患者,分治疗组A、治疗组B和对照组。治疗组A26例,单用α2b干扰素治疗1个月后停用拉米夫定,然后继续单用α2b干扰素治疗5个月;治疗组B10例,α2b干扰素和α1胸腺肽联合治疗1个月后停用拉米夫定,然后继续两药联合治疗5个月;对照组30例,直接停用拉米夫定,不用其他任何抗病毒药。定期进行血清肝功和病毒学指标检测。结果治疗组A和治疗组B的HBVDNA阴转率和HBeAg/HBeAb转换率均明显高于对照组。结论慢性乙型肝炎患者拉米夫定耐药后采用α2b干扰素或α2b干扰素加α1胸腺肽进行后续抗病毒治疗可能是有益的。     

Overlapping gene mutations of hepatitis B virus in a chronic hepatitis B patient with hepatitis B surface antigen loss during lamivudine therapy

Disappearance of hepatitis B surface antigens (HBsAg) in chronic hepatitis B usually indicates clearance of hepatitis B virus (HBV) infection. However, false HBsAg negativity with mutations in pre-S2 and 'a' determinant has been reported. It is also known that YMDD mutations decrease the production of HBV and escape detection of serum HBsAg. Here, we report overlapping gene mutations in a patient with HBsAg loss during the lamivudine therapy. After 36 months of lamivudine therapy in a 44-yrold Korean chronic hepatitis B patient, serum HBsAg turned negative while HBV DNA remained positive by a DNA probe method. Nucleotide sequence of serum HBV DNA was compared with the HBV genotype C subtype adr registered in NCBI AF 286594. Deletion of nucleotides 23 to 55 (amino acids 12 to 22) was identified in the pre-S2 region. Sequencing of the 'a' determinant revealed amino acid substitutions as I126S, T131N, M133T, and S136Y. Methionine of rtM204 in the P gene was substituted for isoleucine indicating YIDD mutation (rtM204I). We identified a HBV mutant composed of pre-S2 deletions and 'a' determinant substitutions with YMDD mutation. Our result suggests that false HBsAg negativity can be induced by combination of overlapping gene mutations during the lamivudine therapy.