兔角膜基质细胞培养及对病毒敏感性的实验研究

目的 研究体外培养兔角膜基质细胞对病毒的敏感性。方法 采用微量细胞病变法,观察体外培养的兔角膜基质细胞对单纯疱疾病毒Ⅰ、Ⅱ型(herpes simplex virus Ⅰ、Ⅱ,HSV-Ⅰ、Ⅱ)、腺病毒3型(adenovirus type 3,Ad3)、滤疱性口腔炎病毒(vesicularstomatitis virus,VSV)等4种病毒的敏感性。结果 病毒接种于兔角膜基质细胞48h,HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ效价(TCID_(50))分别为64×10~(-3)、128×10~3,VSV效价(TCID_(50))为10~(-2),Ad3不引起细胞病变。结论 兔角膜基质细胞对HSV-1、HSV-2均敏感,对VSV、Ad3不敏感。     

RNA干扰对兔角膜基质细胞环氧化酶2与基质金属蛋白酶2表达的抑制作用研究

目的 探讨针对环氧化酶2(COX-2)的RNA干扰(RNAi)对兔角膜基质细胞中COX-2与基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的影响.方法 实验研究.体外培养兔角膜基质细胞,测定阳离子脂质体介导的小干扰RNA(siRNA)在兔角膜基质细胞中的转染率,设计并合成3条针对兔COX-2基因的短发卡RNA(shRNA)1、2、3和1条阴性对照shRNA,利用阳离子脂质体介导转染正常与IL-lα刺激后的兔角膜基质细胞,在IL-lα刺激后6、12、24、48、72 h收集细胞,实时荧光定量聚合酶链反应检测兔角膜基质细胞中COX-2和MMP-2基因的表达变化,并与对照组进行比较.同一时间点各组间比较采用单因素方差分析,处理组两两比较采用q检验.结果 阳离子脂质体能够有效介导siRNA转染体外培养的兔角膜基质细胞,转染率可达70%～80%.IL-lα刺激后兔角膜基质细胞中COX-2与MMP-2 mRNA的表达较空白对照组显著升高;在不同时间点,生物合成的3条针对COX-2的靶向shRNA中shRNA-2能显著抑制IL-α刺激后的兔角膜基质细胞中COX-2、MMP-2 mRNA表达,抑制率最高可分别达83.04%、73.69%,与单纯IL-lα刺激组相比差异均有统计学意义(q=24.03,P=0.00;q=14.76,P=0.00);而shRNA-1、shRNA-3、阴性对照shRNA转染组与单纯IL-lα刺激组相比,COX-2 mRNA的表达差异无统计学意义(F=0.02,P=0.99),MMP-2 mRNA的表达差异也无统计学意义(F=0.02,P=0.98).结论 针对COX-2的RNAi能够有效抑制IL-lα诱导后的兔角膜基质细胞中COX-2与MMP-2的表达.     

单纯疱疹性角膜炎的近代研究

由于单纯疱疹病毒(HSV)的广泛存在,激素应用的增多,单纯疱疹性角膜炎(HSK)的发病率在逐渐上升,已成为主要的致盲性角膜病变之一。美国每年有30万人患HSV性眼病,在致盲的角膜病中,仅次于外伤,居于第二位。眼部HSV感染多见于成人和青年,64%大干15岁,7%低于5岁。1/2 HSK病人在5年内复发,可致严重视力损害。一、单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒对人类的感染作用是1873年由实验性接种所证实。人的眼部感染为单纯疱疹病毒Ⅰ型。HSV普遍存在于人的皮肤和粘膜,15岁以上有90%的人曾有病毒感染,临床只有1%发病。     

脱细胞猪角膜基质体外支持角膜上皮和基质细胞的生长

目的:探讨脱细胞猪角膜基质体外能否支持兔角膜细胞的生长。方法:体外培养兔角膜上皮细胞和基质细胞,并接种到制备的脱细胞猪角膜基质上,倒置相差显微镜和组织学观察细胞生长情况。结果:上皮细胞能在脱细胞猪角膜基质上贴附生长,10d时可形成2~3层的复层结构。基质细胞在脱细胞猪角膜基质上贴附生长后可向材料深层迁徙。结论:制备的脱细胞猪角膜基质体外可支持兔角膜上皮细胞和基质细胞的生长。     

基质金属蛋白酶在实验性单纯疱疹性角膜炎中的分布表达

目的 明确角膜感染Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV—1)后基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制剂(TIMPs)在角膜中的分布。方法 HSV—1(KOS株)接种于BALB／c小鼠角膜上。分别收集正常眼球及感染后第2、7、14及28d的感染眼球行石蜡包埋，并应用抗MMP—2、—8、—9及TIMP—1、—2的抗体免疫染色角膜切片。结果 感染后第2d，MMP—2、—9及TIMP—1、—2的表达比未感染眼增加且表达主要位于浅表基质层及上皮下的炎性细胞中。感染后第14d及28d可见坏死性角膜炎及角膜溃疡形成，角膜基质中及浸润的炎性细胞中尤其是溃疡处可见MMP—2、—9及TIMP—1、—2表达显著增加。溃疡区域可见大量MMP—8阳性染色的中性粒细胞。结论 HSV—1角膜感染后由角膜细胞及浸润的炎性细胞分泌产生的MMPs对于上皮性角膜炎及溃疡形成过程可能起重要作用。     

异种角膜基质材料的制备和体外细胞种植的实验研究

目的研究异种角膜基质生物支架材料的制备方法和体外种植兔角膜基质细胞后细胞在材料上的生长、增殖情况。方法将York猪全层角膜用去垢剂联合0．25％胰蛋白酶、DNA-RNA酶祛除猪角膜基质细胞并冻干制备成支架材料；将兔角膜组织块用胶原酶消化后，用含10％血清的DMEM培养液体外培养，并做波形丝蛋白，角蛋白免疫组织化学染色检测；将培养的兔角膜基质细胞的2～3代接种在材料上，培养5d后，做HE染色、扫描电镜观察。结果猪角膜基质片经脱细胞处理后，细胞成分祛除干净并保留了角膜组织的三维网格状结构，网状间隙明显增大，利于细胞生长；体外培养的兔角膜基质细胞波形丝蛋白染色为阳性、角蛋白染色为阴性；HE染色、扫描电镜结果显示兔角膜基质细胞在支架材料上生长、增殖良好。结论异源性角膜经祛脱细胞处理而获得的生物支架材料利于异种细胞的黏附和增殖，可进一步用于组织工程角膜的研究。     

蛋白激酶Cα在人角膜基质细胞中的表达

目的 观察蛋白激酶Ca（PKCα）在原位及体外培养的人角膜基质细胞中的表达。方法标本来源于北京大学第一医院眼库。人角膜基质细胞体外原代及传代培养，应用免疫组织化学法检测PKCα在培养的人角膜基质细胞中的表达；制作人正常角膜组织冰冻切片，观察PKCα在角膜基质细胞中的表达。结果免疫组织化学法检测显示：正常人原位角膜基质细胞对PKCα无明显表达，而体外培养的人角膜基质细胞有明显阳性表达。结论特殊的角膜创伤模型——体外培养人角膜基质细胞中PKCα有明显阳性表达，提示PKC在角膜基质细胞增生过程中扮演了重要角色，抑制PKC的活性有可能成为治疗角膜瘢痕愈合的一个新途径。     

猪脱细胞角膜基质组织结构特点与生物相容性研究

背景构建组织工程化角膜时,载体的选择十分重要。目前有多种载体可供选用,但脱细胞角膜基质是公认的较好载体。目的观察猪脱细胞角膜基质的组织结构特点,评价其与异种角膜基质和上皮细胞的生物相容性。方法取猪角膜组织进行组织块培养,经胰蛋白酶-EDTA酶消化角膜上皮、基质、内皮细胞,支架组织于-20℃冷冻干燥后灭菌保存。猪脱细胞角膜基质石蜡切片行常规苏木精一伊红染色,光学显微镜下观察组织的形态学特征;扫描电镜下观察其组织结构特点;并对其物理特性,如抗拉性、膨胀性、含水量和透明度进行评价。将猪脱细胞角膜基质移植到兔角膜基质层内,同时与体外培养的兔角膜上皮细胞共培养4周,分析其组织和细胞生物相容性。结果经酶消化处理后猪角膜组织中未见上皮、基质和内皮细胞,其胶原纤维直径大小、排列与正常角膜组织相同,抗拉性、膨胀性、含水量和透明度等物理特性与正常猪角膜相似。猪脱细胞角膜基质行异种兔角膜基质层间移植1周时可见轻度水肿,2周后水肿基本消退,4周时透明度较好。猪脱细胞角膜基质与兔角膜基质之间贴附良好,未见炎症反应及新生血管。兔角膜上皮细胞接种于猪脱细胞角膜基质上共培养4周后CK3表达阳性。猪脱细胞角膜基质脱水前与脱水2h、4h后及正常猪角膜基质间的抗拉性、膨胀性、含水量的差异均无统计学意义（P〉0．05）,但脱水2h、4h后及正常猪角膜基质的透明度明显好于脱水前,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论猪脱细胞角膜基质组织结构与正常猪角膜相似,与兔角膜基质和上皮细胞具有良好的生物相容性。     

单纯疱疹病毒性角膜炎的发病机制

单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis,HSK)是一种常见的眼部疾病,由单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)感染引起。人群中超过90%的人曾经感染过HSV。HSV可以在神经组织及角膜组织长期潜伏。在适宜的刺激下,如紫外线照射、发热、精神压力、高温、低温、手术等,病毒活化增殖导致HSK。HSV感染引起的免疫反应是造成角膜组织损害的主要机制。HSK的免疫反应主要是由CD4+细胞介导的,而CD8+细胞对病毒感染具有保护作用。     

体外构建含细胞组织工程角膜基质的方法

目的:研究体外构建组织工程角膜基质的方法.方法:用去垢剂联合酶的方法脱细胞处理猪角膜基质,在去细胞猪角膜基质材料上接种体外培养的兔角膜基质细胞,并将兔角膜基质细胞进行PKH26荧光标记,在体外构建组织工程角膜基质.用倒置荧光显微镜;HE染色光学显微镜;扫描电镜观察.结果:利用异种去细胞角膜基质组织为支架材料而构建的组织工程角膜基质具有近似正常角膜基质的三维立体结构.结论:以去细胞猪角膜基质材料为支架,利用组织工程技术可成功的在体外构建出含细胞的组织工程角膜基质组织.     

单纯疱疹性角膜炎几种常用辅助诊断方法的比较

目的 比较常用的3种检测单纯疱疹性角膜炎(HSK)辅助诊断方法的敏感性和临床实用性。方法6只新西兰白兔双眼接种1×105PFU单纯疱疹病毒I型(HSV-I)McKrea株。病毒接种后第8天应用无环鸟苷眼膏每2 h 1次,共4次。另外2只兔中1只兔双眼在角膜上划痕但不接种病毒,另1只兔双眼角膜接种曲霉菌作为阴性对照。在病毒接种后的3、9、21天,利用病毒分离、多聚酶链反应(PCR)和蛋白吸附膜快速单纯疱疹病毒I型抗原检测方法进行检测。结果 接种后第2天全部角膜出现典型的HSK点状或树枝状浸润,第5天出现地图状溃疡,第21天仍有2只角膜有持续性感染。抗病毒治疗1天后无明显好转。2只兔于接种后14和16天死亡。病毒分离方法只有接种后3天的泪液培养阳性,第9、21天的标本检测均为阴性。有11/12、11/12和6/8只角膜在接种后的第3、9、21天用PCR方法检测到了HSV-I DNA。蛋白吸附膜抗原检测在接种后的第3、9、21天的阳性率分别为12/12、12/12和3/8。结论 蛋白吸附膜快速HSV—I检测是一种快速、简便、经济的方法。其阳性结果与临床表现相吻合。     

复合自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质移植治疗兔角膜碱烧伤

目的:研究复合脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质对碱烧伤角膜的治疗效果。方法:制备晾干的脱细胞猪角膜基质,取第3代体外培养的兔自体脂肪干细胞,体外种植到脱细胞猪角膜基质上,培养3d后用于板层角膜移植。结果:板层角膜移植2mo后,术眼角膜基本恢复透明,未发生排斥反应,新生血管较少,3mo后新生血管基本消退。结论:复合自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质对兔碱烧伤角膜具有良好的修复能力。     

无环鸟甙(acycloguanosine)对家兔疱疹性角膜溃疡的疗效

作者以实验方法对一种新的低毒性抗疱疹病毒化合物无环鸟甙(简称248u),在家兔疱疹性角膜溃疡的疗效进行了观察研究。以体重2—3kg家兔麻醉后,以环钻钻穿角膜上皮25处,行上皮损伤恢复试验(Corneal epi-thelial lesion reduction assay)。接种单纯疱疹病毒(HSV)Ⅰ型RE株。另眼重复上述操作。在一组4兔中,右眼用3％无环鸟甙油膏治疗,左眼用0.5％IDU油膏治疗。另一组4眼不接受任何治疗作为对照。接种后48小时开始治疗。白天     

双氢青蒿素对体外培养兔角膜上皮细胞毒性作用的实验研究

目的 评价双氢青蒿素对体外培养的兔角膜上皮细胞的毒性作用。设计 实验研究。研究对象 体外培养兔角膜上皮细胞。方法 体外培养兔角膜上皮细胞,加入不同稀释浓度（1.6%、0.8%、0.4%、0.2%、0.1%、0.05%和0.025%）的双氢青蒿素共同孵育,同时以洗必泰和聚六亚甲基双胍（PHMB）做对照药物。在培养后2、6、24小时,光学显微镜下观察细胞形态,LIVE/DEAD染色观察药物作用后兔角膜上皮细胞的活性改变。主要指标 细胞形态改变。结果 培养后2、6小时,0.4%双氢青蒿素作用后的细胞出现圆化,细胞间隙加宽;0.0125%洗必泰作用后的细胞开始出现细胞间隙加宽,边界不清;0.003%PHMB作用后的细胞开始出现细胞边界不清,细胞内颗粒样改变。培养后24小时,0.1%的双氢青蒿素作用的角膜上皮细胞尚存在活性,0.025%的双氢青蒿素对角膜上皮细胞无明显影响。0.006%洗必泰和0.003%PHMB可导致角膜上皮细胞的死亡。结论 双氢青蒿素对体外培养的兔角膜上皮细胞的毒性较低,其对活体角膜细胞的作用尚待进一步研究。     

组织工程角膜基质的体外构建及移植的实验研究

目的探讨利用组织工程技术体外构建角膜基质进行板层角膜移植的可行性和有效性。方法将猪角膜基质去细胞处理后制备成组织工程角膜基质载体;取幼兔角膜基质细胞体外培养,将其种植在载体上,体外构建成组织工程角膜基质,用PKH26荧光标记兔角膜基质细胞示踪角膜基质的构建;将16只兔的角膜基质内植入壳聚糖膜使之形成无菌性角膜溃疡,随机从16只兔中选8只,进行组织工程角膜基质移植;另外8只作为对照组,进行新鲜的同种异体兔板层角膜移植。术后对角膜进行裂隙灯、光学显微镜、透射电镜观察。结果体外构建的组织工程角膜的基质细胞具有活性,其结构与正常角膜基质相近。移植治疗无菌性角膜溃疡术后,1~2周有新生血管侵入组织工程角膜基质植片边缘,植片为灰白色半透明状;3~4周随着新生血管减退,组织工程角膜基质植片局部开始透明变薄;术后8~10周角膜溃疡完全修复,角膜恢复透明性,角膜神经可再生;观察最长达10月,角膜仍保持透明,无免疫排斥发生,与对照组疗效相同。结论体外构建的组织工程角膜基质无免疫原性、具有良好的生物相容性,可作为临床治疗角膜溃疡的移植材料。     

培养的兔羊膜上皮细胞构建角膜表层移植片的研究

目的应用培养的兔羊膜上皮细胞（AECs）体外构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料,探讨利用AECs重建角膜表层的可行性。方法取妊娠晚期新西兰大白兔（27～28孕周）的羊膜,制成AECs单细胞悬液,用含血清和表皮生长因子（EGF）的DMEM／F12培养液培养、传代,利用免疫组织化学单克隆抗体AE1／AE3、AE5检测培养的AECs中细胞角蛋白ck3／12的表达;将体外培养的2～3代兔AECs种植在新鲜兔角膜基质上,利用气-液界面培养法使之复层化,体外构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料,进行光学显微镜和扫描电镜观察,并进行免疫组织化学测定。结果体外培养的兔AECs呈现单克隆抗体AE1／AE3、AE5表达阳性,AECs在新鲜兔角膜基质上能形成形态类似于正常角膜上皮细胞的3～5层复层结构,且复层化后的上皮细胞单克隆抗体AE5表达阳性。结论应用培养的AECs能成功构建类似角膜表层的复层上皮细胞-角膜基质移植材料,AECs可能成为重建角膜表层的一种新的细胞来源。     

汉防己甲素等5种抗纤维化药物对离体兔角膜基质细胞的抑制作用

目的比较汉防己甲素等5种抗纤维化药物对离体兔角膜基质细胞的抑制作用,为减轻角膜创伤愈合反应提供一种新药。方法选用原代及传代兔角膜基质细胞,实验组分别加入含不同浓度汉防己甲素、TGF-β抗体、α-2b干扰素、维拉帕米、氟美童的培养液,对照组加入含等量PBS的培养液,分别培养24h、48h、72h后,采用MTT法检测其对细胞增殖的抑制作用,计算出抑制率和IC50,并对其进行比较。结果汉防己甲素在各时间段各浓度组,均能明显抑制角膜基质细胞的增殖,其24h、48h、72h的IC50分别为4·407mg·L-1、3.758mg·L-1和3.524mg·L-1,并具有明显的时间剂量-效应依赖关系。TGF-β抗体在各时间段各浓度组均有较强抑制作用,其IC50分别为6.550mg·L-1、4.060mg·L-1和3.860mg·L-1。α-2b干扰素在各时间段各浓度组均有抑制作用,但作用都较弱。维拉帕米的抑制作用不确切。氟美童在各时间段各浓度组均有确切的抑制作用,其IC50分别为36.190mg·L-1、43.742mg·L-1和47.052mg·L-1。结论在5种药物中,汉防己甲素对离体兔角膜基质细胞增殖的抑制作用最强,且明显强于激素类药物氟美童,因此在减轻角膜创伤愈合方面具有潜在的运用前景。     

羊膜上皮细胞培养液抑制角膜基质细胞凋亡的实验研究

目的 对羊膜上皮细胞培养液抑制由肿瘤坏死因子(TNF-α)诱发的角膜基质细胞凋亡进行研究。方法 体外培养兔角膜基质细胞(RCK),30ng/ml TNF-α诱发角膜基质细胞凋亡。实验分为对照组、羊膜上皮细胞培养液组(羊膜组)和阴性对照组。应用FITC-dUTP-TUNEL和DAPI染色检测RCK细胞凋亡发生率,分别测定经24h培养后各组细胞凋亡特异性DNA梯形降解。Western blot检测细胞凋亡保护性因子Bcl-2、促进因子Bax在经羊膜上皮细胞培养液处理后于细胞中表达强度及Bcl-2/Bax比值变化。结果 羊膜上皮细胞培养液明显抑制由TNF-α诱发的兔角膜基质细胞凋亡,DAPI染色显示24h对照组,羊膜培养液组和阴性对照组细胞凋亡发生率分别为:42.4％±4.3％,2.2％±0.3％和2.7％±0.4％。DNA降解实验显示羊膜上皮细胞培养液明显抑制TNF-α诱导的DNA片段降解。Western blot显示羊膜上皮细胞培养液明显刺激RCK细胞Bcl-2蛋白的表达和分泌。结论 羊膜培养液中可能释放的多种细胞因子对TNF-α诱发的角膜基质细胞调亡具有明显的抑制作用,其作用机制之一是刺激Bcl-2在RCK细胞的表达,并使Bcl-2/Bax比值上调。     

培养兔角膜基质细胞的一种新方法——悬浮基质片法

目的寻找一种新的、简易的兔角膜基质细胞培养方法。方法去除兔角膜上皮层、后弹力层及内皮细胞层,将处理后剩下的全层基质(简称基质片)置于6孔板中,分别进行悬浮培养(悬浮基质片法)、组织块贴壁培养法培养、Ⅱ型胶原蛋白酶消化法培养。观察所培养细胞的体外生长特性,并进行波形蛋白免疫组化鉴定。结果采用悬浮基质片法可成功培养出兔角膜基质细胞,细胞具有长短不等的数个突起,呈梭形、不规则三角形或纺锤形,核椭圆、居中,胞浆清亮,未见其他细胞混杂其中。悬浮培养8～10d贴壁,贴壁后约5d基本融合。其生物学特性与组织块贴壁培养法及Ⅱ型胶原蛋白酶消化法培养的细胞一致。波形蛋白免疫组化染色显示3种方法均为阳性。结论悬浮基质片法培养角膜基质细胞,不需用酶,且具有简便、可靠、不易污染、成功率高等明显优势,为角膜基质细胞的培养提供了新的途径,值得推广。     

单纯疱疹病毒性角膜炎的免疫学

单纯疱疹病毒性角膜炎 (herpes simplex keratitis,HSK)是世界范围内角膜盲的最常见原因。单纯疱疹病毒 (herpes simplexvirus,HSV)不仅可直接导致角膜的感染性破坏 ,而且还可通过免疫病理机制诱导某些难以处理的疾病 ,如基质型角膜炎。1　免疫学机制1 .1　动物模型　目前 ,已有数种 HSK的动物模型 ,比较常用的是兔模型和小鼠模型。兔模型比较理想 ,因为兔眼球大小与人类相似易于观察 ;另外 ,存在有自发性病毒释放和疾病复发现象。而小鼠模型则缺乏病毒的自发性释放和疾病的复发 ,但在感染后经过一段时间才发生角膜的炎症反应 ,该特征类…