卵巢透明细胞腺癌的DNA损伤应答反应

目的研究卵巢透明细胞腺癌的发生与DNA损伤应答之间的关系。方法对14例新鲜卵巢组织标本(正常卵巢组织3例,低分化卵巢肿瘤6例,透明细胞腺癌5例),采用X射线(2Gy)照射制备组织DNA损伤模型,分别对其进行组织冷冻切片,采用免疫荧光和Western免疫印迹方法检测DNA损伤应答反应。结果在X射线照射前,与正常卵巢组织细胞相比,透明细胞腺癌中存在大量内源性DNA损伤,X射线照射后组蛋白2A变体(H2AX)表现过度磷酸化,而损伤修复能力正常。p53结合蛋白1(53BP1)的激活与磷酸化的H2AX(γH2AX)不能共定位。结论卵巢透明细胞腺癌中DNA损伤异常激活,提示DNA损伤应答信号转导网络存在缺陷。     

DNA-PKcs在DNA双链断裂应答过程中对H2AX磷酸化起主导作用

目的 研究在DNA双链断裂(double strand break,DSB)情况下,DNA-PKcs和ATM在磷酸化H2AX中所发挥的作用.方法 在HeLa细胞中,以高效的DNA双链断裂诱导剂新制癌菌素(neocarzinostatin,Ncs)诱导DSB形成,Western blot分析H2AX磷酸化的时间,剂量依赖及其去磷酸化的动态变化.DNA-PKcs抑制剂NU7026及ATM抑制剂Ku55933分别作用细胞,Western blot检测其对H2AX磷酸化的影响.以α-satellite序列为对象,γ-H2AX CHIP检测DNA-PKcs或ATM抑制前后H2AX磷酸化情况,得出定量数据.结果 γ-H2AX生成呈Ncs作用时间及剂量依赖过程.Ncs短时间作用后,γ-H2AX能够去磷酸化恢复.抑制DNA-PKcs明显影响γ-H2AX生成,而抑制ATM使得γ-H2AX生成高峰延迟.CHIP显示抑制DNA-PKcs后其DNA富集倍数仅为抑制前的27％,而抑制ATM后其富集倍数为抑制前的63％.结论 DNA-PKcs可能在DNA双链断裂应答过程中对H2AX磷酸化起主导作用.     

单细胞电泳检测放射诱导人淋巴细胞DNA损伤

单细胞电泳(SCG)具有快速、灵敏和简便等优点,并可检测出单个细胞DNA的损伤程度,这对研究具有高度组织和细胞特异性的肿瘤方面有特殊意义。通过延长SCG技术的标准碱化时间,可以检测出更低剂量放射诱导的人淋巴细胞DNA单链断裂和碱基损伤,使这一技术更加敏感,在低剂量放射作用研究方面有应用价值。     

自噬参与促进AFB1致肝细胞DNA损伤的修复进程

目的探讨黄曲霉毒素B1(AFB1)肝毒性修复进程中细胞自噬的作用。方法以经50μmol/L AFB1预处理24 h的永生化人正常肝L02细胞建立模型,检测AFB1处理撤除不同时间点的细胞DNA双链损伤指标γH2AX蛋白和自噬标志物LC3-Ⅱ蛋白的表达水平;采用免疫荧光法检测AFB1撤除后细胞中γH2AX蛋白荧光焦点和自噬体形成情况;在AFB1撤除后联合应用自噬抑制剂3-MA进行干预实验,检测细胞内γH2AX蛋白的表达水平。结果L02细胞中γH2AX蛋白的动态表达在AFB1处理撤除12 h后达到最高,并在24 h后逐渐降低;自噬蛋白LC3-Ⅱ和自噬体的形成在AFB1处理撤除后逐渐增强;3-MA可明显减缓AFB1撤处理后细胞内γH2AX蛋白的降低进程。结论细胞自噬参与了AFB1诱导肝细胞毒性损伤的修复进程,与促进DNA损伤的修复有关。     

单细胞凝胶电泳法检测HBV患者外周血淋巴细胞DNA损伤

目的 探讨乙型肝炎病毒与DNA损伤的关系以及不同感染模式慢性乙型肝炎患者（大三阳和小三阳患者）DNA损伤情况.方法 应用单细胞凝胶电泳（SCGE）技术检测对照组和不同感染模式慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞DNA的损伤情况,采用彗星分析软件对实验结果进行淋巴细胞损伤率、彗星尾长（Tail Extent）、彗星尾DNA百分含量（Tail %DNA）、彗星尾惯量（Tail Inertia）、Olive尾距（Olive Tail Moment）等指标进行分析.结果 经SCGE技术后得HBV感染与DNA损伤断裂关系有统计学意义（P〈0.05）;大小三阳组间DNA损伤断裂有统计学差异（P〈0.05）. 小三阳组经SCGE技术后所得彗星图像可见有少量彗星尾.大三阳组经SCGE技术后所得彗星图像可见有明显彗星尾.慢性乙型肝炎组外周血淋巴细胞DNA损伤与对照组比较彗星尾长、尾惯量在统计学上有显著性差异（P〈0.05）;不同感染模式的乙型肝炎外周血淋巴细胞DNA损伤比较,尾长、尾DNA百分含量和尾惯量在统计学上有统计学差异（P〈0.05）.结论 HBV感染可能造成外周血淋巴细胞DNA损伤,且不同感染模式的损伤情况不同.     

电离辐射对沉默ATRX的HeLa细胞DNA损伤修复的影响

目的：靶向沉默宫颈癌HeLa细胞中α-地中海贫血/精神发育迟滞综合征X染色相关蛋白（ATRX）,检测电离辐射对ATRX、γH2AX和Rad51蛋白表达及γH2AX和Rad51焦点数的影响,探讨ATRX参与辐射后HeLa细胞DNA损伤修复的作用。方法： 3条ATRX-shRNA和阴性对照（Control-shRNA）的慢病毒载体转染293T细胞,收集慢病毒并感染HeLa细胞,利用puromycin筛选获得稳定沉默ATRX的细胞系,分别命名为shA₁-HeLa、shA₂-HeLa、shA₃-HeLa和shCon-HeLa,采用Western blotting法检测沉默ATRX效率以及电离辐射后ATRX、γH2AX和Rad51蛋白的表达,采用免疫荧光技术观察shCon-HeLa和shA₁-HeLa组中γH2AX和Rad51焦点并计数其数量。结果： shCon-HeLa细胞中可见ATRX蛋白表达,而shA₁-HeLa、shA₂-HeLa和shA₃-HeLa细胞中均无ATRX蛋白表达,表明沉默效率较高。在2和8 Gy剂量照射后1、6和24 h,shCon-HeLa组ATRX蛋白表达量逐渐升高,24 h时表达量最高,且8 Gy照射后1、6和24 h表达量均较高。4 Gy照射后0~6 h,与shCon-HeLa组比较,shA₁-HeLa组γH2AX焦点数在1 h明显升高（P<0.05）,而后逐渐降低,但在6 h焦点数仍明显高于shCon-HeLa组（P<0.01）;Rad51焦点数与γH2AX焦点数变化相一致,与shCon-HeLa组比较,shA₁-HeLa组Rad51焦点数在1 h明显升高（P<0.05）,在6 h时shA₁-HeLa焦点数仍明显高于shCon-HeLa组（P<0.01）。4 Gy照射后0~16 h,shA₁-HeLa组细胞中γH2AX和Rad51蛋白表达量均较shCon-HeLa组增加。结论：成功获得稳定沉默ATRX的HeLa细胞模型,电离辐射可诱导ATRX蛋白表达量增加,且沉默ATRX的HeLa细胞中γH2AX和Rad51焦点数及蛋白表达量均高于对照组,提示ATRX参与了辐射诱导的DNA损伤修复过程。     

人非小细胞肺癌与外周血淋巴细胞表达LRP的相关性研究

目的 探讨肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein, LRP)在人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)癌组织、癌旁组织和外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes, PBL)中的表达及其相关性.方法 采用S-P免疫组织化学方法检测49例人NSCLC癌组织、癌旁组织和 PBL中LRP的表达及10例正常人PBL中LRP的表达.结果 NSCLC癌组织、癌旁组织和PBL的LRP表达阳性率分别为78.2%、46.4%和66.8%,其中癌组织的LRP表达阳性率明显高于癌旁组织(P＜0.05),且与PBL的LRP表达呈正相关.在各病理类型的NSCLC中,腺癌表达阳性率最高(90.9%),鳞癌次之(55.6%),差异显著(P＜0.01).10例正常人PBL的LRP表达阳性率(20%)显著低于NSCLC患者(P＜0.05). 结论 检测NSCLC患者PBL的LRP表达可间接反映癌组织的LRP表达状况.     

抑郁障碍患者外周血T淋巴细胞及其亚群线粒体损伤的临床意义

目的探究抑郁障碍患者外周血T淋巴细胞及其亚群线粒体损伤检测及其意义。 方法收集72例抑郁障碍患者为观察组,另选取51名同期体检正常者为对照组,采用流式细胞术测定所有受试者外周血T淋巴细胞亚群水平和T淋巴细胞亚群线粒体功能损伤情况,并分析其临床意义。 结果观察组抑郁自评量表(SDS)评分高于对照组(P＜0.05);观察组CD3＋、CD4＋、CD45＋及CD4＋/CD8＋水平均低于对照组(P＜0.05),CD8＋水平高于对照组(P＜0.05);不同类型抑郁障碍患者CD4＋差异有显著性(P＜0.05);Pearson相关检验结果显示,抑郁障碍患者SDS评分与T淋巴细胞亚群CD3＋、CD4＋、CD45＋水平均呈负相关(r＝－0.233,－0.436,－0.347,P＜0.05),与CD8＋水平呈正相关(r＝0.496,P＜0.05)。两组抑制性T细胞(Ts)线粒体损伤比较,差异有显著性(P＜0.05)。 结论抑郁障碍患者T淋巴细胞及其亚群表达存在一定程度的免疫失衡,部分患者出现T淋巴细胞线粒体损伤。     

过敏性紫癜患儿淋巴细胞活化、分泌及雷公藤对其作用

目的　探讨过敏性紫癜(HSP)患儿外周血淋巴细胞(PBLs)活化、分泌状态的变化以及雷公藤内酯醇(TP)对其作用。方法　常规分离PBLs,以流式细胞仪检测CD3、CD2 5抗原表达率,以EILSA法检测白细胞介素-4 (IL - 4 )分泌水平。结果　与健康儿童比较,HSP患儿PBLs培养0、4 8hCD C D 2 5细胞百分率及IL - 4分泌水平均明显升高(P <0 .0 5 ) ;应用TP后,培养4 8hHSP患儿PBLsCD3( )CD2 5 ( )细胞百分率及IL - 4分泌水平均明显降低(P <0 .0 5 )。结论　HSP患儿PBLs活化及分泌水平异常增高,可能参与HSP的发病机制;TP抑制PBLs活化及分泌,可能是雷公藤对HSP作用机制之一。     

甲氨蝶呤对小鼠4种组织器官细胞DNA损伤作用

目的了解甲氨蝶呤(MTX)的作用机制,探测其作用的遗传毒性靶器官。方法用单细胞凝胶电泳技术检测了MTX染毒后脾、骨髓、胸腺和外周血淋巴细胞的DNA损伤情况及其与MTX剂量间的关系。结果腹腔注射1.25～5mg/kgMTX可诱发小鼠4种细胞的DNA单链断裂,核DNA损伤程度与用药剂量呈正相关关系。结论不同脏器细胞对MTX的易感性不同,脾、骨髓、胸腺、外周血淋巴细胞可能是MTX的遗传毒性靶细胞。外周血淋巴细胞在SCGE分析中的拖尾现象可作为用药后组织器官对药物敏感性反映的生物标志。     

缺血性脑卒中患者外周血单个核细胞DNA氧化损伤及修复

目的检测缺血性脑卒中患者急性期和恢复期外周血单个核细胞的DNA氧化损伤及修复情况,与健康者进行比较,以判断缺血性脑卒中患者DNA氧化损伤水平的变化以及DNA氧化损伤水平与病程的关系。方法急性缺血性脑卒中患者36例,于发病3 d内抽取空腹静脉血10 mL进行8-羟基-2’-脱氧鸟嘌呤核苷(8-OhdG)、神经特异性烯醇化酶(NSE)及单个核细胞的彗星率及彗尾DNA百分比的检测,于病程18～21 d抽血2 mL再检测单个核细胞的彗星率及彗尾DNA百分比。同时选取医院门诊体检人群中与研究对象年龄、性别相匹配的健康者20例作为对照。10 mL空腹静脉血中,5 mL分离外周血单个核细胞,提取DNA,将DNA酶解,高效液相色谱—电化学检测方法检测8-OhdG;3 mL双抗体夹心放射免疫法检测血清中NSE;2 mL分离外周血单个核细胞,应用碱性单细胞凝胶电泳的方法检测单个核细胞的彗星率及彗尾DNA百分比,同时对缺血性脑卒中患者的神经功能缺损评分进行比较。结果缺血性脑卒中患者急性期外周血单个核细胞的8-OhdG和NSE含量均较对照组明显升高(P＜0．01),急性期患者外周血单个核细胞彗星率为90．13%±2．22%,彗尾DNA百分比为60．71%±4．18%。较恢复期患者的细胞彗星率60．89%±2．98%、彗尾DNA百分比39．20%±3．61%明显增高(P＜0．01);恢复期患者神经功能缺损评分较急性期患者明显下降(P＜0．01)。对照组血液中单个核细胞彗星率为6．4%±1．61%,彗尾DNA百分比3．37%±0．63%,较缺血性脑卒中患者明显减少(P＜0．01)。结论缺血性脑卒中患者急性期和恢复期外周血单个核细胞存在DNA氧化损伤。     

槲皮素对2型糖尿病患者外周血单个核细胞DNA损伤体外修复的观察

目的观察2型糖尿病(DM)患者氧化/抗氧化状态、外周血单个核细胞(PBMCs)DNA损伤情况及槲皮素的体外修复作用。方法采用单细胞凝胶电泳技术检测39例2型DM合并血管并发症、29例2型DM无并发症患者PBMCsDNA损伤情况(用彗星率表示),与26例健康对照比较。检测受试者血浆总抗氧化能力(TAC)、丙二醛(MDA)及巯基(SH)含量。观察槲皮素对2型DM患者PBMCsDNA损伤的体外修复作用。结果2型DM无并发症组PBMCs彗星率及血浆MDA含量明显高于健康对照组(P均<0.01),血浆SH含量、TAC明显低于健康对照组(P均<0.01);2型DM血管并发症组彗星率及MDA含量高于无并发症组(分别为P<0.01和P<0.05),TAC低于无并发症组(P<0.05)。2型DM无并发症组及血管并发症组患者彗星率与MDA含量呈正相关(r分别为0.446和0.504,P<0.05和P<0.01),与TAC呈负相关(r分别为-0.418和-0.399;P均<0.05)。体外修复显示:10μmol/L槲皮素作用4h显著降低了2型DM患者PBMCs彗星率(P均<0.01)。结论2型DM患者体内存在氧化/抗氧化失衡、DNA氧化损伤,血管并发症组重于无并发症组。氧化应激可能参与了2型DM患者血管并发症的发生发展。     

DNA损伤应答通路在高钙磷环境诱导的人主动脉血管平滑肌细胞钙化中的作用

目的 明确DNA损伤应答通路在高钙磷环境诱导的人主动脉血管平滑肌细胞(HVSMC)钙化过程中的作用。方法 将HVSMC培养分为对照组、模型组、共济失调毛细血管扩张突变激酶(iATM)组、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(iPARP)组,培养12 d。茜素红-S染色法定性和邻-甲酚酞法定量检测4组细胞钙化情况,彗星实验检测DNA损伤,Western blotting和免疫荧光方法检测组蛋白γH2AX磷酸化水平,酶联免疫吸附试验检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHDG)水平,NucleoCounterNC-3000^TM高级细胞分析仪分析4组细胞的存活率。结果 光学显微镜和茜素红S染色发现第9天开始,与对照组相比,模型组出现细胞内钙质沉积,第12天钙质沉积明显。对照组与模型组分别在第3、6、9、12天培养状态下Ca²⁺/蛋白比较,结果：(1)不同时间点Ca²⁺/蛋白有差异(F=168.970,P=0.000);(2)模型组与对照组Ca²⁺/蛋白有差异(F=203.040,P=0.000),模型组Ca^2+...     

1，2-二氯乙烷对淋巴细胞DNA的损伤及胆红素的保护作用研究

目的 探讨１，２－二氯乙烷（１，２－ＤＣＥ）对人外周血淋巴细胞ＤＮＡ的损伤作用及胆红素的保护作用。方法 用不同浓度的１，２－ＤＣＥ对人外周血淋巴细胞进行染毒，然后用单细胞凝胶电泳法观察ＤＮＡ链断裂、ＤＮＡ－ＤＮＡ链间交联和ＤＮＡ损伤后的修复能力，同时观察胆红素对１，２－ＤＣＥ所致ＤＮＡ损伤的保护作用。结果 ５０￣２５０μｍｏｌ／Ｌ的１，２－ＤＣＥ均可明显引起淋巴细胞ＤＮＡ的链断裂；５０，１００，２     

干扰素α-2b联合利巴韦林治疗后慢性丙型肝炎患者外周血细胞数量的变化及其临床意义

目的:探讨干扰素α-2b(INF-α2b)联合利巴韦林治疗后慢性丙型肝炎患者外周血细胞数量的变化,阐明影响外周血细胞数量的相关因素。方法:选择343例慢性丙型肝炎患者(有慢性肝炎的症状且抗-HCV和HCV-RNA阳性),均给予药物INF-α 2b 500 万U、隔日1次、皮下注射,利巴韦林 15 mg·kg^-1·d^-1 口服,疗程48周;在基线、2周、12周、24周、36周和48周对患者进行血常规、HCV RNA定量等检测,治疗后60、72和96周进行随访。出现中性粒细胞绝对值数减少、贫血及血小板计数减少的患者依据《2010丙型肝炎防治指南》进行相应治疗或随访观察。结果:治疗过程中中性粒细胞减少症发病率为40.5%(139例),贫血发病率为48.4%(166例),血小板减少症发病率为39.9%(137例)。治疗结束后仍有个别患者出现外周血细胞数量改变。抗病毒治疗过程中,外周血细胞数量减少多出现在治疗开始至12周内。治疗2周内中性粒细胞、血红蛋白和血小板计数即有明显下降,至第12周时同时降到最低值,12周后出现缓慢上升,治疗结束时(48周)虽较12周恢复明显,但仍未达到治疗前水平,60~72周时趋于平稳且恢复到治疗前水平。基线中性粒细胞绝对值、血小板计数、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肝纤维化程度与中性粒细胞减少症的发生及严重程度有关联(P<0.05)。性别与贫血的发生有关联,基线血红蛋白水平与贫血的发生及严重程度均有关联(P<0.05)。性别、基线中性粒细胞绝对值、血小板计数、AST、ALT、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、肝纤维化程度与血小板减少症的发生有关联(P<0.05)。结论:抗病毒治疗2周内慢性丙型肝炎患者外周血细胞数量即有明显下降,12周时降至最低,临床医生应及时对患者进行随访及干预,避免严重不良事件的发生。根据基线性别、外周血细胞水平、肝功能和肝纤维化程度可评估抗病毒过程中患者外周细胞数量是否减少及严重程度。