人乳头瘤病毒16型E6、E7反义RNA对人宫颈癌SiHa细胞的恶性逆转作用

通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达，探讨反义RNA能否降低E6、E7基因的表达和诱导细胞凋亡。利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞。利用RT-PCR和Western blot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化，利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性，利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡情况。     

RNA干涉抑制宫颈癌HPV16 E6基因的研究

目的采用RNA干涉（RNAi）技术干扰宫颈癌HPV16 E6基因转录,通过体外和体内实验了解其特异性抑制HPV16 E6基因的效率。方法设计合成针对HPV16 E6的小干扰RNA（siRNA）,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过测定转染后不同时间点的细胞凋亡率、HPV16 E6mRNA及蛋白表达变化了解基因抑制的效率。体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型,将E6 siRNA直接注入瘤体,观察肿瘤体积的变化,肿瘤切片HPV16 E6免疫组化染色,观察肿瘤坏死和细胞的凋亡。结果HPV16 E6siRNA转染细胞后24h、48h、5d和9d时凋亡率分别为7．7％、11．8％、37．4％和12．6％。RT-PCR显示转染后24h、48h、5d和9d HPV16 E6 mRNA量减少了77％、83％、59％和41％。Western blot显示转染后的HPV16 E6蛋白表达在24h、48h、5d明显减少,9d时有所恢复;流式细胞仪HPV16 E6蛋白定量测定结果显示,转染后24h、48h、5d和9d蛋白表达抑制率分别为79．7％、80．4％、71．3％和57．4％。体内实验瘤内注射HPV16 E6 siRNA明显抑制肿瘤的生长,HPV16 E6蛋白表达明显受抑,肿瘤组织坏死和细胞凋亡增加,重复给药较单次给药效果更好。结论体内和体外实验均表明RNA干涉HPV16 E6基因的效果具有特异性和高效性。     

RNA干涉（RNAi）抑制宫颈癌细胞SiHa中E7基因表达的实验研究

目的探讨HPV16 E7特异性小干涉RNA（siRNA）表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的抑制作用。方法构建HPV16 E7特异性表达载体,利用脂质粒转染SiHa细胞,用RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白的影响。结果两条siRNA均能有效抑制E7mRNA的转录表达,其中以pshRNA-HPV16 E71作用效果最明显,在转染后72h,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分剐为78．4％和57．6％。结论HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达有抑制作用。     

RNA干扰技术抑制HPV16 E6基因表达对宫颈癌细胞株CaSki增殖的影响

目的观察HPV16 E6小干扰RNA(siRNA)能否抑制宫颈癌细胞生长,并探讨其作用机理。方法化学合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,应用细胞计数的方法测定细胞生长曲线、活细胞率及细胞生长抑制率。运用实时荧光定量RT-PCR、流式细胞术检测转染后不同时间点细胞周期、HPV16 E6、p53、p21 mRNA及蛋白表达的变化。结果转染HPV16 E6 siRNA后,细胞生长明显受到抑制。流式细胞术结果显示并未将细胞阻滞在G1期。实时荧光定量RT-PCR显示,转染24h,E6 mRNA的表达比空白组降低了20.11倍(P<0.05),而p53、p21 mRNA的表达无明显变化。转染48h,E6蛋白表达明显下调,Pp53、P21蛋白表达相应地升高。结论HPV16 E6 siRNA可通过特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复P53蛋白的功能活性而发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用。     

载体介导的RNAi技术抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达

目的 探讨HPV16E7特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞E7基因的抑制作用.方法 构建HPV16 E7特异性siRNA表达载体,利用脂质体转染CaSki细胞,以荧光定量RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白表达的影响.结果 3种表达载体P1、P2、P3均能抑制CaSki细胞E7基因mRNA和蛋白的表达,其中载体P1抑制作用最强,在转染后3周,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分别为92.86%和81.0%.结论 HPV16E7 siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达.     

HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPVl6感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经BamHⅠ和HindIⅡ双酶切后插入相同酶切的pET32a（＋）载体,转染JMl09感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Wlescem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET32（＋）,E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1（＋）空质粒,构建pcDNA3．1（＋）m5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染,最后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT．PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5,在1mmol／LPTG、28℃诱导条件下BL21（DE3）菌体中HPVl6E5．TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/mlG418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和pcDNA3．1（＋）／E5真核表达质粒,HPV16 E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达．这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。     

HPV58 E2 DNA疫苗的构建及免疫原性研究

目的探讨人乳头瘤病毒58型（HPV58）早期基因E2作为DNA疫苗候选抗原的可行性。方法构建HPV58 E2真核重组表达载体pcDNA3/58E2,转染SiHa细胞,利用RT PCR检测HPV58E2 mRNA的转录。pcDNA3/58E2 DNA肌肉注射免疫BALB/C小鼠,ELISA检测小鼠血清中特异性anti HPV58E2 IgG水平。结果RT PCR结果表明,pcDNA3/58E2能够在真核细胞中有效转录HPV58E2mRNA。动物实验表明,质粒pcDNA3/58E2肌肉接种可诱导免疫小鼠产生抗E2特异性抗体。结论本研究成功构建了重组真核表达载体pcDNA3/58E2,并初步证明HPV58 E2 DNA 疫苗有良好的免疫原性。     

利用反义技术抑制人乳头瘤病毒18 E6/E7的表达及其对宫颈癌HeLa细胞增殖凋亡的影响

目的 构建人乳头瘤病毒（HPV）18型E6／E7反义荧光真核表达载体,研究其对宫颈癌HeLa细胞增殖凋亡的影响。方法 以PCR法扩增HPV18型E6／E7区716bp片段并反向克隆到荧光真核表达载体pEGFP-C1,构建重组体pEGFP-HPV18E6E7as（EGFP-18AS）并转染人宫颈癌HeLa细胞。利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western印迹技术检测转染后E6、E7基因在mRNA和蛋白水平的变化;用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测转染后细胞的的增殖活性;用流式细胞仪检测转染后细胞的凋亡率;荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态学改变。结果 转染EGFP-18AS重组体后,HeLa细胞中E6、E7基因的mRNA表达和蛋白合成均明显下调;细胞增殖受到抑制;流式显示细胞G1期明显阻滞;同时在荧光显微镜下经Hoechst染色凋亡细胞出现染色质凝集、边集、碎裂等形态学改变。结论 重组质粒pEGFP—HPV18E6E7as能有效地抑制人宫颈癌HeLa细胞的生长和增殖,诱导其凋亡,证明了反义RNA技术的有效性,为宫颈癌的基因治疗提供了一种新的可能的途径。     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。     

人乳头瘤病毒16型E7抗原表达模型的构建

目的 :构建pEGFP HPV1 6E7表达载体 ,并观察其在肝癌细胞中的瞬时和稳定表达及小鼠肝癌细胞皮下成瘤情况 ,为建立表达HPV1 6E7的实体瘤动物模型奠定基础。方法 :应用基因重组技术 ,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与HPV1 6E7的融合表达载体 ,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析 ,用脂质体转染技术将其转入小鼠肝癌细胞 ,2 4h后RT PCR检测HPV1 6E7mRNA的生成 ,荧光显微镜观察EGFP HPV1 6E7融合蛋白的表达 ,将转染细胞接种小鼠皮下 ,观察成瘤及成瘤后融合蛋白的表达情况。结果 :酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确 ,在转染的小鼠肝癌细胞中检测到HPV1 6E7mRNA的生成和绿色荧光蛋白的表达 ,接种的转染细胞在小鼠皮下可成瘤且可检测到HPV1 6E7mRNA的生成。结论 :pEGFP HPV1 6E7表达载体便于观察转染细胞中EGFP HPV1 6E7融合蛋白的表达情况 ,小鼠肝癌细胞接种小鼠皮下可成瘤 ,成瘤后可检测到HPV1 6E7mRNA的转录     

RNA干扰HPV16 E6基因表达对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响

目的：探讨HPV16 E6小干扰RNA（siRNA）对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响。方法：利用化学合成的方法,合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染SiHa细胞。应用荧光定量RT—PCR和Western—blot检测HPV16 E6mRNA及其蛋白水平的表达。MTT法绘制细胞生长曲线。流式细胞术评价HPV16 E6siRNA对细胞周期的影响。结果：HPV16 E6siRNA转染细胞48h及72h后,细胞内HPV16 E6mRNA及蛋白表达量明显下调,与HPV16 E6阴性对照组及空白组比较[48h（1．85±0．15）vs（2．14±0．13）,（2．29±0．11）;72h（1．82±0．06）vs（2．32±0．14）,（2．35±0．23）],差异有显著性意义（P〈0．01）;MTT显示细胞生长明显受到抑制;流式细胞术‘检测显示,E6siRNA可将细胞阻滞在G1期。结论：HPV16 E6siRNA能抑制SiHa细胞增殖。     

siRNA 表达载体抑制宫颈癌SiHa细胞增殖的实验研究

目的 观察HPV16E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响.方法 利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体转染SiHa细胞,通过荧光定量RT-PCR检测E7 mRNA的变化;流式细胞仪检测E7蛋白的变化和细胞周期的分布;MTT法检测细胞增殖的变化.结果 HPV16E7 siRNA表达载体可明显抑制SiHa细胞E7 mRNA和E7蛋白的表达,抑制率分别为92.15%、84.30%;阻滞SiHa细胞由G1期进入S期;抑制细胞的生长.结论 HPV16E7 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达,从而调控肿瘤细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖.     

宫颈癌前病变中△NP63与HPV16 E7表达的研究

目的:研究宫颈上皮内瘤变中△NP63和HPV16 E7 mRNA的表达情况,寻找用于临床评估CIN病变进展趋势的生物学标志物.方法:收集临床71例薄层液基细胞标本,采用SP免疫组化法检测细胞中△NP63的蛋白表达,RT-PCR法检测残留标本中HPV16 E7的mRNA转录情况.结果:1.△NP63定位于异常鳞状上皮细胞和腺细胞,在CIN中表达高于炎症组(P＜0.05);2.HPV16 E7在CIN中表达明显高于炎症组(P＜0.05);3.CIN中△NP63与HPV16 E7的检测结果具有较好的一致性.结论:△NP63可作为CIN的生物学标志物辅助细胞学筛查;△NP63可间接反映HPV16 E7的转录情况,有利于临床评估高危型病毒HPV16的致瘤能力.     

宫颈癌前病变中ΔNP63与HPV16 E7表达的研究

目的:研究宫颈上皮内瘤变中ANP63和HPV16 E7 mRNA的表达情况,寻找用于临床评估CIN病变进展趋势的生物学标志物。方法:收集临床71例薄层液基细胞标本,采用SP免疫组化法检测细胞中ANP63的蛋白表达,RT-PCR法检测残留标本中HPV16 E7的mRNA转录情况。结果:1．ANP63定位于异常鳞状上皮细胞和腺细胞,在CIN中表达高于炎症组(P< 0．05);2．HPV16 E7在CIN中表达明显高于炎症组(P<0．05);3．CIN中ANP63与HPV16 E7的检测结果具有较好的一致性。结论:ANP63可作为CIN的生物学标志物辅助细胞学筛查;ANP63可间接反映HPV16 E7的转录情况,有利于临床评估高危型病毒HPV16的致瘤能力。     

人乳头瘤病毒16型E5蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒115型（HPV16）E5蛋白真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5,分析E5在HeLa细胞及BALB／c小鼠肌肉组织中的表达。方法设计HPV16E5基因引物,PCR扩增E5基因。经Bam-HI、EcoR1酶切后将其连接入pcDNA3．1（＋）,PCR及双酶切筛选阳性克隆并测序。将构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5转染HeLa细胞,利用RT—PCR测定HPV16E5mRNA表达。将6只BALB／c小鼠分为3组,分别取100mgpcDNA3．1（＋）／HPV16E5、100mgpcDNA3．1（＋）、100mLPBS经肌肉注射小鼠,2周1次,共4次;末次接种后第14天取小鼠股四头肌制成石蜡切片,免疫组织化学法检测E5蛋白在小鼠肌肉组织中的表达。结果PCR扩增得到252bpHPV16E5基因片段,DNA测序结果显示E5基因片段正确地连入pcDNA3．1（＋）。构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5在HeLa细胞表达大小为252bp的HPV16E5mRNA。小鼠股四头肌细胞膜被染成棕黄色。结论构建的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5能在HeLa细胞及小鼠肌肉组织中表达HPV16E5蛋白。     

人乳头瘤病毒16型E5对人宫颈癌SiHa细胞恶性潜能的影响及其机制探讨

通过构建和筛选持续表达HPV16E5的细胞SiHa／16E5,探讨HPV16E5对宫颈癌SiHa细胞的作用及机制。利用pEG—FP—C1构建HPV16型E5的正义全长真核表达载体并稳定转染SiHa细胞;利用RT-PCR和Western印迹技术检测转染前后E5和P21基因的mRNA和GFP＋E5和P21蛋白的变化;利用MTT法检测SiHa细胞稳定转染后的增殖活性;利用软琼脂克隆形成和裸鼠成瘤实验分别在体内外验证了SiHa／16E5细胞的致瘤情况。结果显示：稳定转染携带HPV16全长E5基因的质粒后,SiHa细胞中E5基因的mRNA和相应蛋白表达明显升高,而P21的表达则明显下调;MTT结果显示,稳定转染后细胞的增殖活性与转染空载体细胞和未转染细胞比较明显增高（P〈0．05）;软琼脂克隆形成结果显示：SiHa／16ES细胞组的可隆形成数为（33．4&#177;1．6）,与空质粒对照组细胞（15．1&#177;3．1）及未转染组细胞（16．3&#177;2．5）比较差异有统计学意义（P〈0．05）;裸鼠成瘤实验结果显示,4个实验组在共20d的观察中,siHa／16E5组裸鼠成瘤明显快于其它3个对照组（P〈0．05）。结果提示：HPV16E5可降低宫颈癌SiHa细胞中P21的表达,加强宫颈癌SiHa细胞增殖和成瘤效应。     

人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测在宫颈病变中的诊断价值研究

目的 探索HPV E6/E7mRNA检测在宫颈病变中的诊断价值。方法 收集2016年12月~2017年10月在笔者医院妇科行细胞学和HPV DNA基因分型联合筛查发现疑似宫颈病变并转阴道镜活检的女性病例262例,活检同期均行HPV E6/E7mRNA检测,以宫颈组织病理活检为标准对照。对比3种方法检测宫颈病变HSIL的敏感度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比及受试者工作特征曲线下面积（AUC）,及3种方法在不同病理级别中的检出情况,并分析HPV E6/E7mRNA病毒载量与病变关系。结果 HPV E6/E7mRNA检测宫颈病变≥HSIL的敏感度与HPV DNA基因分型和细胞学相似,特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比均高于细胞学和HPV DNA基因分型;HPV E6/E7mRNA的受试者工作特征曲线下面积（AUC=0.80, P<0.01）高于细胞学（AUC=0.65, P<0.01）和HPV DNA分型（AUC=0.54,P>0.05）的曲线下面积;HPV mRNA和细胞学在不同病理级别中的检出率比较,差异有统计学意义（P<0.01）,HPV DNA基因分型在不同病理级别中的检出率比较差异无统计学意义（P>0.05）;HPV E6/E7 mRNA表达水平与组织病理分级之间的相关关系有统计学意义（P<0.01）,且HPV E6/E7mRNA表达水平与宫颈病理分级间呈正相关（r=0.467）。结论 HPV E6/E7mRNA检测对宫颈病变诊断准确性优于细胞学和HPV DNA分型,在宫颈病变及癌变的筛查中具有一定的临床价值,临床医生应给予关注。     

沉默HPV16 E6基因对人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的 采用RNA干扰抑制人宫颈癌CaSki细胞裸鼠移植瘤中人乳头瘤病毒(human papillomavirus-16,HPV16)E6基因的表达,观察对裸鼠移植瘤的抑制作用.方法 将HPV16 E6特异性的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)真核表达载体转染到人宫颈癌细胞株CaSki细胞中,经G418筛选,RT-PCR检测E6基因的表达;将细胞接种到BALB/c裸鼠背部皮下,同时将该质粒注射到人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的裸鼠中,观察肿瘤出现时间及体积变化;观察肿瘤组织的病理改变.结果 成功筛选到持续表达E6 siRNA的CaSki细胞,经RT-PCR检测该细胞中HPV16 E6基因表达降低;裸鼠成瘤实验结果显示,处理后的CaSki细胞成瘤能力明显降低,抑瘤率为71.4%;注射质粒进行基因治疗后,裸鼠肿瘤生长受到抑制,肿瘤的体积与质量明显低于CaSki细胞组,差异具有显著性(P＜0.05).病理检查结果显示,经pGensil-CH2处理的肿瘤生长不佳,细胞分裂像少见,组织内有较多坏死区域.结论 沉默CaSki细胞中HPV16 E6基因的表达能明显降低宫癌细胞的成瘤作用.