蛋白激酶C对腹膜间皮细胞己糖激酶活性的调控

目的研究蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）对腹膜间皮细胞（peritoneal mesothelium cell,PMC）己糖激酶（hexokinase,HK）活性的调节作用,以及HK活性与PMC对葡萄糖摄取的相关性。方法大网膜取自雄性SD大鼠,胰蛋白酶-EDTA消化法用于PMC的原代培养及传代,细胞角蛋白抗体的间接免疫荧光染色用于PMC的鉴定;6-磷酸葡萄糖脱氢酶耦联比色法检测HK活性,观察PKC激活剂——佛波酯（PMA、PDD）及经典型PKC（classical PKC,cPKC）抑制剂——Goe6976对HK活性的影响;比色法检测培养液内葡萄糖的消耗量作为细胞对葡萄糖净利用指标。结果原代培养的PMC24h贴壁,5～8d融合,形成铺路石样外观,细胞角蛋白在胞浆阳性表达。PMA对HK活性的诱导呈时间和剂量依赖性,并增加了PMC对葡萄糖的净利用。0．01、0．1及1μmol／L的PMA作用24h后,HK活性分别提高30．7％、59．9％及99．1％（P〈0．05）。1μmol／L的PMA作用于PMC,6h后HK活性开始上调,24h时达到高峰（分别为21．3％和100．4％,P〈0．05）,培养液内的葡萄糖基本消耗一半（2mmol／L,P〈0．05）。0．1μmol／LPDD对HK活性的诱导与1μmol／L的PMA作用相似,PDD的结构相似物4α—PDD对HK活性无上述作用。G66976抑制了PMA对HK活性的诱导。10、20、30、40及50Ixmol／L的Goe976预处理PMC30min,再予1μmol／LPMA培养24h,HK活性分别抑制了14．6％、26．8％、34．2％、44．2％及54．9％（P〈0．05）。结论PKC使HK活性上调,增加了细胞对葡萄糖的净利用,可能与长期腹膜透析后PMC对葡萄糖的吸收加速有关;cPKC抑制剂对HK活性的阻断可能成为提高腹膜透析超滤的有效途径之一。     

d-α-生育酚对高糖诱导的人腹膜间皮细胞己糖激酶表达的调节作用

目的探讨d-α-生育酚对高糖诱导的人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelium cell,HPMC)己糖激酶(hexokinase,HK)及其同工酶表达的调节作用。方法胰蛋白酶消化法分离培养HPMC,免疫细胞化学染色及扫描电镜对培养细胞进行鉴定。第3代HPMC分为正常对照组(0．1％葡萄糖,相当于5．5 mmol／L)、高糖组(0．5％、1．0％、1．5％、2．5％、4．25％的葡萄糖)及d-α-生育酚干预组。培养24 h后,利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶耦联比色法和温度敏感实验检测HK及其同工酶的活性;免疫细胞化学染色检测HK蛋白的细胞内定位;Western印迹及逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)法分别检测HK蛋白及mRNA的表达。己糖激酶法检测培养液内葡萄糖的消耗量作为细胞对葡萄糖净利用指标。结果角蛋白和波形蛋白在HPMC的胞质呈阳性表达,扫描电镜可见细胞表面有丰富的微绒毛。1．5％、2．5％及4．25％葡萄糖组,HK总活性上调,与正常对照组(20．6±2．5)U／g蛋白比较,相对活性分别为115．4％、129．1％及155．2％,并以HKⅡ增加为主(P<0．05)。50 mmol／L d-α-生育酚干预组,HK总活性下调,是2．5％葡萄糖组的82．1％(P=0．001),其中HKⅡ受抑为主;d-α-生育酚干预后HPMC对葡萄糖的净利用由(25．3±3．9)mmol／L降至(17．3±2．1)mmol／L(P= 0．018)。正常状态下,HKⅡ蛋白在胞质呈棕色淡染;随葡萄糖浓度的增加(葡萄糖≥1．5％),HKⅡ在核周积聚、浓染,呈珠链样;d-α-生育酚预处理后,HKⅡ在核周的积聚变淡。HKⅡ蛋白及mRNA的表达与HKⅡ活性同步。结论d-α-生育酚抑制了高糖对HKⅡ活性、蛋白及mRNA表达上调的作用,并减少HPMC对葡萄糖的净利用;可能成为增加腹膜透析超滤的手段之一。     

己糖激酶在原代培养腹膜间皮细胞的表达

目的 :探讨大鼠腹膜间皮细胞 (peritonealmesothelialcell,PMC)的原代培养方法及其己糖激酶 (hexoki nase ,HK)的表达。方法 :胰蛋白酶 EDTA消化法进行PMC的分离、培养 ,6 磷酸葡萄糖脱氢酶 (G6PDH)偶联比色法检测其HK总活性。结果 :PMC的原代及传代细胞 5～ 8d即可达到融合 ,其HK的基础活性为 (4.80± 0 .39)U/g蛋白。结论 :改良的胰蛋白酶消化法是进行PMC原代培养的一种可靠的实验方法。PMC有较强的HK活性 ,参与了腹膜透析时对葡萄糖吸收和利用方面的调节 ,可能对透析超滤有较大的影响     

高糖对大鼠腹膜间皮细胞葡萄糖转运蛋白1调节作用的研究

目的：观察高糖对体外培养的大鼠腹膜阐皮细胞（PMC）细胞膜上葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）含量的调节作用。方法：体外培养的Wistar大鼠PMC置于不同糖浓度培养液中；流式细胞仪定量检潮细胞膜上CLUT1的含量。生化分析便检测PMC对葡萄糖的撮入。结果：随着细胞外葡萄糖浓度增加，细胞膜上GLUT1的表达增加。同时伴有PMC对葡萄糖的转运坩加（P〈0．05）。结论：葡萄糖以浓度依赖方式上调PMC细胞膜上CLUT1的蛋白表达夏PMC对葡萄糖转运的增加导致PMC爱损。     

高糖和脂多糖对腹膜间皮细胞中骨桥蛋白的表达及其所致纤维化的影响

目的观察高糖、脂多糖(LPS)单独及联合作用对大鼠腹膜间皮细胞(RPMC)中骨桥蛋白(OPN)的表达及其所致纤维化的影响。方法将培养的RPMC分为正常对照组,不同浓度葡萄糖组(1.5%,2.5%,4.25%,24 h),高糖(2.5%)作用不同时间组(8,12,24,34,48 h),不同浓度LPS组(50,100μg/mL),LPS(50μg/mL)作用不同时间组(8,12,24,34,48 h)及联合作用组(2.5%葡萄糖+LPS 50μg/mL,24 h)。采用细胞免疫组织化学法检测OPN在RPMC内的表达情况,Real-time RT-PCR技术检测OPN和转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA的表达。结果高糖、LPS单独及联合作用均可刺激RPMC的OPN表达增加,呈剂量及时间依赖性,2者联合作用时OPN表达量较高糖、LPS单独作用时增高,差异有统计学意义(P<0.05)。高糖、LPS单独及联合作用均可导致TGF-β1表达增加,作用8 h时表达水平升高,12 h降低,24 h达到高峰,48 h仍存在,与0 h组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论高糖及LPS通过上调OPN的表达引起腹膜损伤,导致腹膜纤维化,2者联合作用时通过影响OPN的表达加速了腹膜透析合并腹膜炎过程中腹膜纤维化的病理进程。     

高糖对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响

目的：通过观察高糖对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响,从多元醇通路的角度探讨高糖造成腹膜间皮细胞损伤的可能机制。方法：采用人的网膜作为细胞来源,胰蛋白酶-EDTA消化法进行人腹膜间皮细胞的分离、培养,间接免疫荧光法对第二代细胞进行鉴定。第2-3代细胞同步后用于实验。观察葡萄糖浓度及其作用时间对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响。应用紫外分光光度计记录NADPH在340nm处吸光值的下降表示醛糖还原酶活性。结果：①醛糖还原酶活性随葡萄糖浓度的增加而显著增加。②随着葡萄糖作用时间的延长,醛糖还原酶活性逐渐增加。结论：高糖以时间及剂量依赖的方式使腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性增加。     

高糖对人腹膜间皮细胞生成活性氧的影响

[目的]研究不同浓度的葡萄糖对人腹膜间皮细胞（human peritoneal mesothelial cells,HPMCs）生成活性氧的影响。[方法]HPMCs体外培养并进行免疫组化鉴定,取第3代细胞用于实验。分别按照不同的实验要求将细胞分组。不同葡萄糖浓度干预组：①空白对照组;②1．5％葡萄糖组;③2．5％葡萄糖组;④4．25％葡萄糖组。不同作用时间组：①空白对照组;②2．5％葡萄糖组。两组细胞分别培养12、24、48h。应用流式细胞仪检测细胞对氧化剂敏感的2．7-二氢二氯荧光素（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein,DCFH）发生氧化所产生的荧光量,从而间接的反映细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的水平,观察随葡萄糖浓度变化及不同作用时间对人腹膜间皮细胞产生活性氧的影响。[结果]（1）与空白对照组比较,高糖干预人腹膜间皮细胞后,其细胞内平均荧光强度明显升高（P〈0．05）,并且随葡萄糖浓度升高而逐渐增高,其中4．25％葡萄糖组最高。（2）与空白对照组比较,随着时间的延长,高糖作用下细胞内平均荧光强度明显升高（P〈0．05）,培养48h其水平最高。[结论]高糖可刺激体外培养的人腹膜间皮细胞ROS的生成。     

罗格列酮对脂多糖作用下及高糖对大鼠腹膜间皮细胞TLR2 mRNA表达的影响

目的观察罗格列酮对脂多糖(LPS)作用下大鼠腹膜间皮细胞(RPMC)toll样受体2(TLR2)mRNA表达的影响;观察高糖对RPMC的TLR2mRNA表达的影响。方法胰蛋白酶法行RPMC的原代培养和传代,经鉴定第3代细胞融合至80%时分组。正常对照组:不同浓度LPS(1,10,100μg/ml)作用8h组;10μg/mlLPS作用不同时间(2,6,12h)组;10μg/mlLPS预孵育2h后,加入罗格列酮(10μmol/L)再作用4h组;不同浓度葡萄糖(1.5%,2.5%,4.25%)作用8h组;2.5%葡萄糖作用不同时间(5,10,20h)组。RT-PCR技术检测TLR2mRNA的表达。结果LPS及高糖均可刺激RPMC的TLR2mRNA表达显著增加,呈剂量依赖性(P<0.05),并且LPS作用下RPMC的TLR2mRNA表达增加在12h内呈时间依赖性(P<0.05),高糖作用下RPMC的TLR2mRNA表达增加在20h内呈时间依赖性(P<0.05);罗格列酮可抑制由LPS刺激导致的TLR2mRNA表达上调(P<0.05)。结论LPS及高糖可上调体外培养RPMC的TLR2mRNA表达,罗格列酮可拮抗LPS对TLR2mRNA的表达上调作用。     

高糖对人腹膜间皮细胞氧化应激的影响

目的研究不同浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞(HPMC)氧化应激的影响。方法HPMC体外培养并行免疫组化鉴定,取第2代细胞用于实验。将不同浓度葡萄糖干预HPMC一定时间后,MTT比色法检测细胞活力;采用活性氧捕获剂双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)孵育细胞,通过流式细胞仪检测细胞内的荧光强度而测得细胞内活性氧(ROS)水平。分析不同浓度葡萄糖及不同作用时间对HPMC细胞活力及ROS水平的影响。结果高糖明显抑制HPMC细胞活力(P<0.05),随着葡萄糖浓度增加及作用时间的延长,抑制率呈上升趋势。高糖干预HPMC后,细胞内的平均荧光强度明显升高。结论高糖导致细胞发生氧化应激,其对细胞的损伤作用可能与氧自由基生成过多及ROS蓄积有关。     

高糖对人腹膜间皮细胞氧化应激的影响

目的 研究不同浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞(HPMC)氧化应激的影响.方法 HPMC体外培养并行免疫组化鉴定,取第2代细胞用于实验.将不同浓度葡萄糖干预HPMC一定时间后,MTT比色法检测细胞活力;采用活性氧捕获剂双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)孵育细胞,通过流式细胞仪检测细胞内的荧光强度而测得细胞内活性氧(ROS)水平.分析不同浓度葡萄糖及不同作用时间对HPMC细胞活力及ROS水平的影响.结果 高糖明显抑制HPMC细胞活力(P＜0.05),随着葡萄糖浓度增加及作用时间的延长,抑制率呈上升趋势.高糖干预HPMC后,细胞内的平均荧光强度明显升高.结论 高糖导致细胞发生氧化应激,其对细胞的损伤作用可能与氧自由基生成过多及ROS蓄积有关.     

腹透液相关浓度葡萄糖对体外腹膜间皮细胞的影响

目的 研究腹透液相关的三种浓度葡萄糖（1．5％、2．5％、4．25％）对体外培养的腹膜间皮细胞凋亡及其形态的影响。方法 胰蛋白酶消化法从腹膜组织中分离间皮细胞，建立体外培养模型。采用Hoechst 33258荧光染色法及流式细胞仪技术测定体外培养的腹膜间皮细胞在腹膜透析液相关浓度葡萄糖作用下的凋亡率；采用透射电子显微镜技术观察高浓度葡萄糖对体外培养的腹膜间皮细胞形态学的影响。结果Hoechst 33258荧光染色法和流式细胞仪结果显示：与对照组比较，1．5％、2．5％、4．25％葡萄糖均能引起明显的腹膜间皮细胞的凋亡（P〈0．05），三种浓度葡萄糖组间也有显著的差异（P〈0．05），4．25％甘露醇能引起明显的凋亡（P〈0．01），4．25％葡萄糖与4．25％甘露醇比较，前者能引起明显的凋亡（P〈0．05）；与正常对照组比较，1．5％葡萄糖分别作用于腹膜间皮细胞24h、72h、120h，各时间组均出现明显的凋亡（P〈0．05）。腹膜间皮细胞的凋亡率与葡萄糖浓度和作用时间呈正相关（r〉0．7．P〈0.05）。透射电子显微镜观察4．25％葡萄糖作用72h后大鼠腹膜间皮细胞的形态变化：细胞表面的微绒毛倒伏、脱失；细胞质内出现线粒体空泡样变；细胞核内的染色质浓缩、边集；出现凋亡小体。结论 腹膜透析液相关的三种浓度葡萄糖和4．25％的甘露醇均能引起腹膜间皮细胞的凋亡；葡萄糖诱导的腹膜间皮细胞凋亡具有浓度和时间依赖性；葡萄糖引起的细胞凋亡不仅与其渗透压有关，还与葡萄糖代谢有关；葡萄糖引起的细胞形态改变有：腹膜间皮细胞表面的微绒毛倒伏、缺失；细胞质内的线粒体出现空泡样变：细胞核内出现染色质浓缩、边集的改变。     

高糖对大鼠腹膜间皮细胞分泌细胞因子的影响及苦参碱的干预作用

目的：研究高糖刺激下大鼠腹膜间皮细胞分泌肿瘤坏死因子α（TNF‐α）和转化生长因子β1（TGF‐β1）及苦参碱的干预作用,探讨腹膜纤维化发生机制。方法通过体外培养大鼠腹膜间皮细胞（PMCs）,依据加入药物浓度分成5组：2．5％葡萄糖组（n＝15,A组）;低糖苦参碱组（2．5％葡萄糖,n＝15,B组）;4．25％葡萄糖组（n＝15,C组）;高糖苦参碱组（4．25％葡萄糖,n＝15,D组）;对照组（n＝15,E组,仅加不含血清的DM EM‐F12 BM SC培养基）,分别于第24、48、72小时收集培养上清液,采用ELISA法测定各组培养上清液中TNF‐α和TGF‐β1浓度的变化,同时观察各组大鼠腹膜间皮细胞光镜下的表现。结果光镜下,可见E组和B组腹膜间皮细胞小,呈卵圆形或圆形,生长较为密集。A、C、D组腹膜间皮细胞大、呈梭形或多边形,分布较为稀疏;在A组,培养上清液中TNF‐α和TGF‐β1水平较E组无明显统计学变化（P＞0．05）;而在C组,培养上清液中TNF‐α和TGF‐β1水平较E组增加明显,差异有统计学意义（P＜0．05）。在B组和D组中,PMCs分泌TNF‐α和TGF‐β1水平B组较A组减少,差异无统计学意义（P＞0．05）;D组较C组明显下降,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论苦参碱能拮抗高糖致大鼠腹膜间皮细胞分泌TNF‐α和TGF‐β1,从而保护腹膜间皮细胞。     

高浓度葡萄糖损伤人腹膜间皮细胞分子机制的研究

目的：探讨高浓度葡萄糖损伤人腹膜间皮细胞的机制。方法：（1）人腹膜间皮细胞分别经含1．5％、2．5％、4．25％葡萄糖的M199培养基培养48小时后，检测间皮细胞线粒体膜电位（Ψ）、凋亡率、caspase-3活性、bax和bcl-2基因mRNA表达；（2）分别用0．1μmol／L和0．01μmol／L环孢素A（CsA）与4．25％葡萄糖共同作用人腹膜间皮细胞，检测细胞凋亡率和caspase-3活性。结果：（1）随着葡萄糖浓度增加，Ψ丧失的细胞百分率、bax mRNA表达量、caspase-3活性、凋亡率增加（P〈0．05），而bcl-2 mRNA表达量减少；（2）随着葡萄糖浓度增加，bax mRNA的表达量与皿丧失的间皮细胞百分率呈显著正相关（P〈0．01）；bcl-2 mRNA的表达量与Ψ丧失的间皮细胞百分率呈显著负相关（P〈0．01），Ψ丧失的间皮细胞百分率与间皮细胞凋亡率、caspase-3活性呈显著正相关（P〈0．01）：（3）0．1μmol／L CsA组间皮细胞凋亡率和caspase-3活性显著低于高糖对照组（P〈0．05）。结论：（1）高糖可能通过上调bax基因表达和下调bcl-2基因表达，诱导人腹膜间皮细胞线粒体活化、caspase-3活化和凋亡。（2）高糖诱导人腹膜间皮细胞caspase-3活化和凋亡可能依赖于线粒体活化。     

高糖腹透液对腹膜间皮细胞分泌VEGF的影响及氟伐他汀的干预作用

目的:观察氟伐他汀(fluvastatin,Flu)对高糖腹透液(high-glucose peritoneal dialysate,HGPDS)诱导的人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响?方法:体外培养HPMCs,同步化48 h后,分组如下:正常对照组?HGPDS组?HGPDS+Flu组?单纯Flu组?倒置显微镜观察各组细胞形态,RT-PCR法检测各组VEGF的mRNA表达,Western blot检测各组VEGF蛋白的表达?结果:与正常对照组相比,在HGPDS作用下,48 h后细胞由铺路石样转变为长梭形,1 × 10-6 mol/L Flu可部分逆转HPMCs的形态改变?与正常对照组相比,在HGPDS作用下,人腹膜间皮细胞VEGF mRNA及蛋白表达明显增多(P < 0.05),并呈时间依赖性,VEGF mRNA和蛋白分别在HGPDS干预后12 h和48 h达高峰(P < 0.05)?Flu可明显抑制HGPDS诱导的VEGF的表达(P < 0.05),并呈浓度依赖性?结论:适当浓度的Flu可以抑制HGPDS刺激体外培养人腹膜间皮细胞VEGF表达增加?     

高糖对人腹膜间皮细胞增殖及损伤作用的影响

目的研究高糖对人腹膜间皮细胞（HPMC）增殖及损伤作用的影响。方法利用HPMC体外培养模型,HPMC分别经含1.5%、2.5%、4.25%葡萄糖的1640培养基培养6、12、24、48 h后,以四甲基偶氮多胍（MTT）法,测定HPMC增殖程度,采用自动生化仪检测培养液中乳酸脱氢酶（LDH）分泌水平。结果不同浓度葡萄与Control组间MTT OD值不同、LDH值亦不同,但时间效应均相近。而不同浓度葡萄糖组间MTT OD值、LDH值均相近、时间效应均相近。结论高糖可抑制HPMC增殖,促进LDH分泌,在腹膜损伤及纤维化进程中起一定作用。     

氟伐他汀对高糖腹透液诱导人腹膜间皮细胞纤维连接蛋白表达的影响

目的:探讨氟伐他汀(fluvastatin,Flu)对高糖腹透液(high-glucose peritoneal dialysate,HGPDS)诱导人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)纤维连接蛋白(fibronectin,FN)表达的影响?方法:体外培养HPMCs,同步化24 h后,分为正常对照组?HGPDS组?HGPDS+Flu组?单纯氟伐他汀组?DMSO对照组,各组分别刺激不同时间后,噻唑蓝(MTT)检测各组细胞的活力,RT-PCR检测FN的mRNA表达,ELISA法检测上清液FN蛋白表达的变化?结果:与正常对照组比较,HGPDS明显抑制细胞活力,HGPDS联合Flu共同培养24?36 h,细胞活力有所恢复,其中,1 × 10-6 mol/L Flu作用24 h,细胞活力改善差异有统计学意义(P < 0.05);与正常对照组比较,HGPDS明显增加人腹膜间皮细胞FN mRNA及蛋白表达(P < 0.05),并呈时间依赖性,其中FN mRNA于6 h达高峰,FN蛋白于24 h达高峰?Flu 可抑制HGPDS诱导的FN的高表达(P < 0.05),并呈浓度依赖性?结论:HGPDS诱导体外培养人腹膜间皮细胞FN表达增加,此作用可被Flu 抑制?