DNA条形码等分子鉴定技术与动植物类中药材的鉴定

中药材鉴定是控制中药质量、确保用药安全与效果的首要环节。DNA分子鉴定是从基因层面上进行中药材鉴别的手段,准确率高。DNA分子鉴定包括电泳技术、免疫技术、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列(ISSR)及DNA条形码等,以DNA条形码应用最为广泛。DNA条形码是基因组中相对较短的、可用于物种鉴定的特异性基因片段。植物类中药材的条形码多选用核基因和叶绿体基因DNA片段,如叶绿体psbA-trnH基因、内转录间隔区(ITS)、叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基(rbcL)和RNA转录体Ⅱ型内含子剪切酶基因(matK)等;动物类中药材的条形码多来自核基因和线粒体基因DNA,主要有线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(COⅠ)、核糖体RNA(rRNA)和线粒体细胞色素b基因(CytB)等。综述动植物类中药材DNA分子标记与鉴定技术应用进展,并探讨DNA条形码在药用动植物类中药材鉴定中存在的局限性及发展前景,为中药质量控制提供参考。     

中药DNA条形码分子鉴定技术的应用与展望

中药材品种广泛,存在多基原的情况,质量差异较大,使临床用药安全性和有效性难以得到保证。因传统中药鉴定方法的局限性,对准确鉴别多基原中药材带来了一定的挑战。为了保证中药临床用药安全有效可控,中药鉴定学已成为最重要的研究课题之一,也是当前中医药事业急需解决的关键技术要求。DNA基因鉴别是从基因层面对中药材进行快速、准确的鉴定,包括DNA分子标记法、核酸探针杂交法和DNA条形码技术,其中DNA条形码技术应用最为广泛。DNA条形码是利用标准的DNA片段对物种进行鉴定的技术,2015年版《中国药典》收载了DNA条形码技术指导原则,建立了动物类采用细胞色素C氧化酶亚基I(COI)序列为主,转录间隔区间(ITS)2为辅;植物类采用ITS2/ITS为主,叶绿体psb A-trn H为辅的中药材鉴定体系。该技术的广泛应用为中药鉴别提供更高效快速的方法,并且有效地应用于多基原中药材的鉴别中,使中药品种混乱现象得到极大改观。文章首先对DNA条形码技术的原理、目的及意义、标准片段的选择进行介绍,着重阐述该技术在中药鉴定中的应用以及存在的局限性,并提出展望,以期为中药材的鉴定研究提供参考。     

基于DNA条形码技术的中药材木通种子鉴定研究

目的:利用核糖体内部转录间隔区2(ITS2)及叶绿体psbA-trnH序列对中药材木通种子进行鉴定,建立其种子DNA条形码鉴定方法,保障中药材木通种子的准确性。方法:收集木通种子样品15份,通过提取DNA、聚合酶链式反应(PCR)扩增、双向测序,获取其ITS2及psbA-trnH序列。基于BLAST分析、邻接(NJ)系统发育树构建进行物种鉴定分析。结果:共获得4种类型ITS2序列,2种类型psbA-trnH序列。ITS2及psbA-trnH均可区分木通与川木通、关木通,但ITS2序列可以区分木通与三叶木通、白木通,psbA-trnH序列无法区分木通与三叶木通、白木通。结论:DNA条形码技术可用于木通种子及其易混伪品的鉴定。     

基于DNA条形码及SSR技术鉴定风藤和山蒟

目的 研究海风藤原植物风藤和山蒟的分子鉴定方法。方法 提取31份来自全国各地药材植物及不同医药企业生产饮片的基因组,对psbA-trnH、matK、petA-psbJ等叶绿体基因片段以及核糖体间隔序列ITS进行PCR扩增测序及进化树构建。从叶绿体基因组的简单重复序列中筛选4对特异性引物,对其扩增产物进行毛细管电泳分析。结果 所有样品的psbA-trnH序列高度一致,其它DNA条形码的序列均有一定差异。进化树的聚类分析结果 matK和petA-psbJ片段相近,且与SSR分子标记结果一致,但与ITS聚类结果有差异。结论 matK和petA-psbJ片段对风藤和山蒟的鉴别能力优于ITS和psbA-trnH,DNA条形码和SSR分子标记法均可为中药材海风藤的种质资源鉴定提供分子依据。     

基于DNA条形码的中药材种子种苗鉴定研究——以重楼为例

目的:以重楼为例,探讨DNA条形码技术在中药材种子种苗鉴定中的应用,为中药材种子种苗基原物种鉴定提供技术参考。方法:采用DNA条形码技术,建立重楼中国药典物种标准条形码数据库,通过序列比对、遗传距离比较和系统NJ树构建,研究DNA条形码在种子种苗鉴定中的应用。结果:云南重楼和七叶一枝花种内遗传距离分别小于种间遗传距离,ITS条形码可有效鉴别正品重楼及其混伪品的种子种苗。结论:DNA条形码技术是中药材种子种苗鉴定的有效手段,应用前景广阔。     

山矾属药用植物DNA条形码序列筛选研究——以GenBank数据为例

目的:筛选出适合山矾属植物的DNA条形码序列。方法:基于GenBank数据库中下载的43种山矾属部分药用植物的核糖体基因片段和3个叶绿体基因片段,利用遗传距离法及分子系统学进行DNA条形码分析。结果:选取的4个序列片段中,变异位点及信息位点大小均为:ITSpsbA-trnHmatKrbcL,但4个候选序列均没有明显的Barcoding Gap,其中ITS序列在种间的变异较大,而在种内的变异较小,较符合理想DNA条形码要求。通过对ITS序列进行聚类分析,其中邻接法鉴定成功率为83.87%,贝叶斯法鉴定成功率为80.65%。结论:本研究推荐ITS序列作为山矾属植物的DNA条形码候选序列,psbA-trnH作为补充序列。     

植物叶绿体ycf15基因应用于药用植物鉴定的前景展望

叶绿体普遍存在于绿色植物中,ycf15基因位于叶绿体基因组IR区,长度一般为250~550 bp,高度保守,目前对该基因研究较少。就有限的研究成果来看,其独特的序列结构及其显现的丰富多样的遗传信息不仅具有一定的物种鉴定意义,而且在植物系统进化分析研究中有较大的潜力。同时,ycf15基因具有保守性高、片段长度较小、无需克隆测序等特点,在进一步构建中药材鉴定DNA条形码中具有独特优势。从ycf15基因的结构特点、物种鉴定与系统学意义几方面进行梳理并展望其在药用植物鉴定中的应用前景。     

中草药DNA条形码物种鉴定体系介绍

正中药材品种混乱及真伪鉴定方法欠缺严重影响中医药疗效与安全,为了解决中药行业重大需求,陈士林研究团队通过近10年的公关完成了11000余种4万余份试验样品的DNA条形码研究和大量筛选试验,在国际上首次验证约220 bp的核基因组序列ITS2具有理想的鉴定效率,明显优于国际生命条形码联盟推荐的400~800bp叶绿体序列rbcL和matK联合条形码,特别适合于中药材等存在DNA降解的材料,被公认为中草药鉴定的最优条形码。相关研究被Nature China选为中国最佳研究亮点推介,首篇论文已被引用近800     

中药材DNA条形码分子鉴定指导原则

随着中药材DNA条形码分子鉴定方法研究的深入与普及,国家药典委员会讨论通过在《中国药典》增补本中列入中药材DNA条形码分子鉴定指导原则,该指导原则通过对大样本量中药材进行DNA条形码分子鉴定研究,建立以ITS2为核心,psbA-trnH为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系和以COI为主、ITS2为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系.该文介绍了中药材DNA条形码分子鉴定指导原则及其起草说明,并对该原则在中药材鉴定方面的应用前景进行展望.     

黄精属药用植物DNA条形码鉴定研究

目的：评价DNA条形码候选序列对黄精属药用植物的鉴定能力。方法：对44份黄精属样品应用通用引物扩增其叶绿体rbcL、matK、psbA-trnH及核ITS2和ITS序列,分析其种内种间变异和barcoding gap,应用BLAST和Nearest Distance方法计算物种鉴定效率。结果：ITS2和ITS序列通用引物扩增效率低,叶绿体matK序列获得率最低,rbcL最高,三条序列种内与种间变异均较小,无明显的barcoding gap。基于BLAST和Nearest Distance方法计算,三条叶绿体序列对黄精属药用植物的鉴定效率均较低。结论：DNA条形码候选序列psbA-trnH、matK及rbcL不适用于黄精属药用植物的鉴定,叶绿体全序列或通过叶绿体全序列筛选合适的DNA片段可能是该属药用植物分子鉴定的方向。     

中药DNA条形码鉴定体系及研究方向

近年来,中药DNA条形码分子鉴定得到快速发展,加快了中药鉴定标准化的进程。通过中药DNA条形码鉴定研究,我国首次提出将ITS2序列作为药用植物鉴定的通用条形码序列,并建立以ITS2为核心、psbA-trnH为补充序列的植物类药材DNA条形码鉴定体系和以COI序列为核心、ITS2为辅助序列的动物类药材DNA条形码鉴定体系,为中药DNA条形码鉴定的发展奠定了坚实基础。本文结合课题组研究工作就构建中药DNA条形码鉴定体系进行了综述,包括中药DNA条形码序列的筛选确定、中药DNA条形码鉴定流程和中药DNA条形码鉴定数据库系统构建,并介绍了中药DNA条形码鉴定的研究方向。     

景天属药用植物DNA条形码研究

目的：评价DNA条形码候选序列对景天属药用植物及其混伪品的鉴别能力,探索景天属药用植物鉴定的新方法。方法：使用ITS2、rbcL、matK和psbA-trnH序列的通用引物对景天属药用植物进行PCR扩增和测序,通过比较各序列的扩增效率、种内和种间变异的显著性,以及Barcoding gap,采取BLAST 1和Nearest Distance 方法评价不同序列的鉴定能力。结果: ITS2序列在采集的景天属几种药用植物中扩增成功率为100%,其种内种间变异差异、Barcoding Gap较psbA-trnH、rbcL序列具有更明显的优势,而且纳入网上48个样品33个种的数据后鉴定成功率仍达到100%。结论：ITS2序列能够准确鉴定景天属药用植物,并将其与常见混伪品区别开,ITS2可推荐为景天属首选的DNA条形码序列。     

唇形科常见药用植物DNA条形码的鉴定研究

目的筛选出适合唇形科常见药用植物的DNA条形码序列。方法通过对33种唇形科常见药用植物的核糖体ITS序列和40种唇形科常见药用植物的叶绿体matK基因进行PCR扩增和测序,用MEGA 6.0软件计算其种间、种内的Kimura2-parameter(K2P)距离及各序列变异位点,评估序列的条形码间距(barcoding gap),采用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统聚类树。结果 ITS序列长度为620~698 bp,平均(G+C)量为62.8%,叶绿体matK基因序列长度为859~932 bp,平均(G+C)量为34%,ITS序列与matK基因都有明显的barcoding gap,但matK基因的barcoding gap要小于ITS序列,从聚类分析来看,matK基因能更好地鉴定唇形科不同物种。结论推荐matK基因序列作为唇形科植物鉴定的优选序列之一。     

基于DNA条形码技术鉴别4种龙胆科"地格达"类蒙药基原植物

目的:建立一种快速、准确和标准化的龙胆科“地格达”类蒙药材的DNA条形码鉴别方法,为“地格达”类蒙药材的分子鉴定提供依据.方法:对蒙药地格达类药用植物进行通用引物PCR扩增,PCR扩增产物直接测序,并对序列进行分析.结果:测得4种“地格达”的rbcL,ITS,trnH-psbA和matK全长序列,4种序列长度的范围为388 -940 bp,rbcL,ITS,matK序列都可以将其鉴别出来.结论:tmH-psbA序列不适合用于4种“地格达”的鉴别,ITS序列可作为地格达类蒙药材一种良好的分子标记.通过DNA条形码鉴别方法可对4种龙胆科“地格达”进行准确、可靠、有效的分子鉴别.     

千斤拔属药用植物DNA条形码鉴定研究

目的筛选一种可准确、高效鉴别千斤拔属Flemingia Roxb.ex Ait.et Ait.f.药用植物的DNA条形码序列。方法对4种14份千斤拔属药用植物的ITS2、rbc L、psb A-trn H序列进行扩增和测序,同时查找NCBI数据库中千斤拔属植物的相应序列,共计7种20份,比较不同序列的扩增效率及测序成功率,并对其进行种内、种间变异分析,barcoding gap检验及NJ聚类图分析,以评估不同序列对千斤拔属植物的物种鉴别能力。结果测序成功率方面,ITS2与rbc L序列对所分析样品的测序成功率为100%,psb A-trn H的测序成功率为85.71%;3条序列中,只有ITS2在barcoding gap检验中具有显著gap;从NJ聚类图来看,ITS2可明显区分千斤拔属植物的不同物种(除F.philippinensis与F.stricta外)。结论 ITS2序列能准确鉴别千斤拔属药用植物,可作为千斤拔药材基原植物鉴定的条形码序列。     

濒危兰科药用植物DNA条形码鉴定

兰科药用植物形态分类困难,此研究采用DNA条形码分子鉴定法从分子水平验证兰科药用植物的传统形态分类。以matK,psbA-trnH和ITS2序列作为DNA条形码对已进行了形态鉴定的49属135种163份兰科药用植物样品进行分子鉴定,经DNA提取,PCR扩增、双向测序及校对拼接后,将得到的序列在GenBank中进行BLAST比对,然后运用MEGA 7.0软件中的Neighbor-joining(NJ)法构建物种系统进化树。结果表明,163份样品均能成功提取DNA;matK,psbA-trnH和ITS2序列的PCR扩增效率分别为100%,100%,98.77%;共获得487条序列,其中345条序列在GenBank数据库中比对到了相应物种的序列,142条为新增序列;运用NJ法构建的兰科药用植物系统进化树中,基于matK序列所构建的物种系统进化树要优于基于psbA-trnH和ITS2序列所构建的系统进化树。matK,psbA-trnH和ITS2序列在鉴定兰科药用植物过程中互为补充,DNA条形码分子鉴定法可用于辅助兰科药用植物的分类鉴定。     

蒲黄、松花粉等花粉类药材及其混伪品的DNA条形码鉴定

目前市场上花粉类药材品种较多,由于在外观形态均呈粉末状,很难区分,加之市场价格较高等因素,故混用和掺伪的情况时有发生,因此花粉类药材的准确鉴定对公众的用药安全显得尤为重要。该研究采用DNA条形码技术,对蒲黄、松花粉及其混伪品的基原植物及药材共60份样本进行研究。通过primer premier 6.0设计出蒲黄ITS2特异性引物PhF-R,其扩增效率高达100%,实验结果表明蒲黄药材的ITS2序列长度为234~249 bp,种内K2P平均距离与同属种间K2P平均距离十分接近,但远小于其与混伪品的种间K2P平均距离;松花粉药材的ITS2序列长度均为247 bp,ITS2序列种内平均K2P遗传距离远小于其与混伪品种间平均K2P距离。利用ITS2序列构建的邻接（NJ）树表明蒲黄、松花粉及其混伪品可明显区分,并呈现出良好的单系性。因此,DNA条形码可对该实验材料准确鉴定,有助于花粉类药材的监管及市场流通。     

应用ITS2条形码及种子形态鉴定柴胡属种子

目的:采用传统形态鉴定方法结合DNA条形码分子检测技术准确鉴定柴胡属种子。方法:收集41份市售柴胡属种子和GenBank数据库中下载15个品种75条核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)序列。利用体视显微镜和游标卡尺进行种子外观形态特征的观察和记录,测定千粒重。提取种子的基因组DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增,双向测序得ITS2序列。基于BLAST法,邻接(NJ)系统进化树法,Kimura双参数模型(K2P)遗传距离法和ITS2序列二级结构进行物种鉴定。结果:不同基原的柴胡属种子在长、宽、横切面及千粒重等方面存在细微的差别;柴胡种子的ITS2序列有2个种内变异位点,3种单倍型,种内最大遗传距离0.009小于种间最小遗传距离0.032;NJ系统进化树中柴胡和狭叶柴胡分别聚为独立一支,具有良好的单系性;ITS2序列二级结构可以弥补NJ树在变种鉴定方面的不足。41份柴胡属种子样品中有30份柴胡,3份狭叶柴胡,5份三岛柴胡,2份藏柴胡及1份小叶黑柴胡。结论:市售柴胡种子存在来源多样、基原混乱的问题。基于ITS2条形码和种子形态鉴定相结合的方法可以准确鉴定柴胡属种子,为制定柴胡种子质量标准,规范柴胡种植,从源头解决柴胡药材质量问题提供科学依据,并为其他药用植物种子或者种子类药材的准确鉴定提供参考。