Generation and analysis of 113 adult stage Schistosoma japonic um (Chinese strain) expressed sequence tags

目的：运用表达序列标签（Expressed Sequence Tag,EST）技术快速、节约、有效地获得有关日本血吸虫（中国大陆株）成早表达基因的知识。方法：随机挑取日本血吸虫（中男大陆株）成虫cDNA库单个重组克隆进行部分测序以获得EST,获得的EST通过BLAST程序同EMBL寄生虫数据库和GeneBank数据库进行比较及同源性分析。结果：本研究共随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库单个重组克隆314个,获得了132个有EST价值的序列,其中113个成功在GeneBank dbEST中登录。7.6％有EST价值的序列为日本血吸虫已知序列,4.5％为日本血吸虫同源序列。曼氏血吸虫或其他生物的同源序列占有EST价值的序列的23.5％,未知序列占57.6％。通过同源性分析,发现了几个令人感兴趣的基因,另外,大多数同源序列具有看家基因功能。结论：EST方法具有快速、有效地获得有关日本血吸虫（中国大陆株）成虫表达基因的知识的价值。     

日本血吸虫表达序列标签的获取和分析

目的 运用表达序列标签(expressed sequence tag，EST)技术，从日本血吸虫成虫cDNA文库中分离、鉴定和分析表达基因序列，为日本血吸虫病的防治提供候选疫苗和药物靶点。方法 构建日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行测序，将获取的EST登录GenBank，并进行生物信息学分析。结果 随机挑取382个阳性克隆进行测序，获得149个EST(登录号分别为：CA747382～CA747391，BU917055～BU917058，CA305307～CA305309，BU581980，BU582400～BU582403，BU666906和(A946548～CA946666)，同源性比较发现，部分序列与血吸虫的生活史的不同阶段和不同性别序列有一定的同源性。结论 EST技术有助于快速、经济地获取和研究日本血吸虫表达基因。     

日本血吸虫新基因的发现及其功能的初步预测

本文运用表达序列标签（expressed sequence tags,EST）法筛选日本血吸虫（中国大陆株）成虫cD-NA文库,获得50个日本血吸虫EST片段,经过测序后将EST序列送入EMBL和NCBI、Genbank进行同源性分析并登录。为寻找新的抗血吸虫疫苗候选分子、化疗药物及具有我国自主知识产权的血吸虫功能基因奠定工作基础。     

日本血吸虫核苷二磷酸激酶基因的获得和序列分析

目的 从日本血吸虫(Schistosorna japonicum,Sj)成虫cDNA文库中筛选日本血吸虫新基因，为日本血吸虫病的防治提供药物靶标或候选疫苗。方法 筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行DNA测序，再对新基因序列进行步移法测序获取全长cDNA，并利用生物信息学技术对其进行分析。结果 获得了1个编码日本血吸虫核苷二磷酸激酶新基因的cDNA序列(AY226980)，全长594bp，编码157个氨基酸，编码蛋白与人类或鸽、鸡、鼠及果蝇的核苷二磷酸激酶高度同源。结论 利用表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术三者相结合，成功获得了编码日本血吸虫核苷二磷酸激酶基因的cDNA序列。     

日本血吸虫（大陆株）成虫基因表达谱的研究

报告作1998年至2000年有关日本血吸虫（大陆株）成早基因表达谱研究的结果，主要扬：已测定551条EST，其中519条EST已送入国际基因数据库（GenBank/dbEST），并获得了GenBank的登录号。经同源整合后，519长EST序列归类为388个基因序列，其中，24条（6.19％）为日本血吸虫已知基因序列；18条（4.64％）EST与曼长血吸虫已知基因序列同源，90条（23.19％）EST与其它生物的已知基因序列同源，同源基因包括精氮酸酶、酰胺酸酶、微纤维蛋白、肌动蛋白、细胞色素C氧化酶、二硫异构酶、加长因子、热激蛋白70、Y盒结合蛋白和抗凋亡因子等。其余的256条（65.98％）EST在Gen-Bank中未发现有已知基因的同源序列。将非日本血吸虫同源序列EST或未检索到同源序列的EST初步定义为日本血吸虫亲基因/未知基因序列EST，共364条。已克降日本血吸虫精氮酸酶基因、Y-盒结合蛋白基因和抗凋亡-1因子3个新基因的全长cDNA，其GenBank的登录号分别为AF402615、AF367371和AF333765。本研究结果丰富了血吸虫基因组数据，并为进一步筛选日本血吸虫疫苗候选基因或药物靶位提供了科学依据。     

日本血吸虫thioredoxin基因的克隆和表达

目的 结合分子生物学和生物信息学方法筛选鉴定日本血吸虫新基因。方法 从日本血吸虫(Schistosoma japonicum，大陆株)成虫cDNA库中获取表达序列标签(expressed sequence tag，EST)，用电子拼接的方法延伸序列，用NCBI提供的BLAETx程序和Genbank数据库进行同源性分析以筛选基因；设计特异性引物从日本血吸虫成虫mRNA中扩增筛选基因并预测和分析；扩增产物克隆到原核表达载体并表达。结果 筛选出日本血吸虫Thioredoxin全长基因并对其进行了序列分析，克隆全长cDNA至PET原核载体并表达成功。结论 结合EST、电子延伸和传统的分子生物学方法是高效筛选S.jiaponicum功能基因的有效策略。     

日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因的体外扩增及克隆

为了构建日本血吸虫（中国大陆株)Sj16基因原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Sj16。根据曼氏血吸虫Sm16基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库中扩增Sj16基因;将Sj16基因定向克隆入pGEX-4T-1;转化感受态BL21/DE3菌;用酶切,PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆。结果表明,从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因。结果提示,成功构建日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Sj16,为进一步研究Sj16基因功能打下基础。     

日本血吸虫尾蚴（中国大陆株）表达序列标签的获取及同源性分析

目的：了解日本血吸虫尾蚴cDNA文库中基因的基本情况,为新基因的筛选鉴定提供依据。方法：日本血吸虫尾蚴cDNA文库中的噬菌体侵入大肠杆菌BM25．8后环化成质粒。筛选出转入质粒的菌株。提取质粒DNA,用质粒上的一段测序引物序列进行一次性测序,得到一个表达序列标签（EST0。通过BLASTx及BLASTn公共数据库经编辑分析的EST序列进行同源性比较。经过分析编辑后的新EST序列,以编写好的程序和E-mail方式递交,以获得GenBank登录号,通过对同源性比较结果的总结,对该文库的基本情况进行分析。结果与结论：在测出的58个EST中有3个核苷酸序列与日本血吸虫已知基因高度同源,有2个核苷酸序列与曼氏血吸虫较高度同源,有7个EST的蛋白质序列与其他物种有较高同源性而核苷酸序列同源性很低,有27个EST的蛋白质核苷酸序列同源性都很低。     

日本血吸虫(大陆株)成虫基因表达谱的研究

报告作者 1998年至 2 0 0 0年有关日本血吸虫 (大陆株 )成虫基因表达谱研究的结果 ,主要包括 :已测定 5 5 1条EST ,其中 5 19条EST已送入国际基因数据库 (GenBank/dbEST) ,并获得了GenBank的登录号。经同源整合后 ,5 19条EST序列归类为 388个基因序列 ,其中 ,2 4条 (6 19%)为日本血吸虫已知基因序列 ;18条 (4 6 4 %)EST与曼氏血吸虫已知基因序列同源 ,90条 (2 3 19%)EST与其它生物的已知基因序列同源 ,同源基因包括精氨酸酶、酰胺酸酶、微纤维蛋白、肌动蛋白、细胞色素C氧化酶、二硫异构酶、加长因子、热激蛋白 70、Y盒结合蛋白和抗凋亡因子等。其余的 2 5 6条 (6 5 98%)EST在Gen Bank中未发现有已知基因的同源序列。将非日本血吸虫同源序列EST或未检索到同源序列的EST初步定义为日本血吸虫亲基因 /未知基因序列EST ,共 36 4条。已克隆日本血吸虫精氨酸酶基因、Y 盒结合蛋白基因和抗凋亡 1因子 3个新基因的全长cDNA ,其GenBank的登录号分别为AF4 0 2 6 15、AF36 7371和AF33376 5。本研究结果丰富了血吸虫基因组数据 ,并为进一步筛选日本血吸虫疫苗候选基因或药物靶位提供了科学依据。     

日本血吸虫尾蚴(中国大陆株)表达序列标签的获取及同源性分析

目的 了解日本血吸虫尾蚴ｃＤＮＡ文库中基因的基本情况,为新基因的筛选鉴定提供依据。方法 日本血吸虫尾 蜘ｃＤＡＮ文库中的噬菌体侵入大肠杆菌ＢＭ２５．８后环化成质粒。筛选出已转入质粒的菌株。提取质粒ＤＮＡ,用质粒上 的一段测序引物序列进行一次性测序,得到一个表达序列标签（ＥＳＴ）。通过ＢＬＡＳＴｘ及ＢＬＡＳＴｎ公共数据库经编辑分 析的ＥＳＴ序列进行同源性比较。经过分析编辑后的新ＥＳＴ序列,以编写好的程序和Ｅ－ｍａｉｌ方式递交,以获得ＧｅｎＢａｎｋ 登录号。通过对同源性比较结果的总结,对该文库的基本情况进行分析。结果与结论 在测出的５８个ＥＳＴ中有３个核 苷酸序列与日本血吸虫已知基因高度同源,有２个核苷酸序列与曼氏血吸虫较高度同源,有７个ＥＳＴ的蛋白质序列与 其他物种有较高同源性而核苷酸序列同源性很低,有２７个ＥＳＴ的蛋白质及核苷酸序列同源性都很低。     

日本血吸虫新基因BBC1的获得和分析

目的 从日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新的蛋白基因，为日本血吸虫病的防治提供候选疫苗和药物靶点。方法 构建日本血吸虫成虫cDNA文库，挑取重组阳性克隆进行测序，对部分序列进行步移法测序获取全长cDNA，并进行生物信息学分析和登录。结果 获得了1个日本血吸虫新基因一BBC1基因(AY220747)，长623bp，编码184个氨基酸，其编码蛋白的理论分子量为60．8kDa，等电点为5．13。结论 步移法测序和生物信息学技术相结合有利于发现日本血吸虫新基因。     

Characterization of cDNA from the miracidial antigen family of Schistosoma japonicum (Chinese strain)

Objective To identify the egg antigens related to the formation of hepatic granulomas and fibrosis of Schistosomiasis japonica.Methods The egg cDNA library of Schistosoma japonicum (S. japonicum) was constructed and screened by immunological methods with the pooled sera of advanced schistosomiasis patients. The inserted foreign DNA fragments of positive clones were sequenced. The sequence data were analyzed using Wdnasis 2.5 and compared with Genebank data using blast software.Results Eighty-one clones containing recombinant DNA fragments were obtained from the egg cDNA library of S. japonicum by immunological screening. The DNA sequences of all clones belonged to the miracidial antigen family. The longest cDNA fragment was 1604 bp, which contained an open reading frame of 351 bp, which encoded a protein of 1 2913.35 daltons.Conclusion The cDNA sequence of the miracidial antigen of S. japonicum (Chinese strain) was obtained for the first time.     

Cloning and expression in Escherichia coli of a new gene of Schistosoma japonicum encoding casein kinase Ⅱ beta subunit

Background Nowadays it is now a focus topic in schistosomiasis research to find ideal vaccinecandidates and new drug targets for developing anti-schistosomiasis vaccine. We cloned a new gene, casein kinase Ⅱ beta subunit, of Schistosoma japonicum (S. japonicum) and express it in Escherichia coli (E. coli). Methods The ESTs obtained in our laboratory were analyzed by homologous searching, and a new gene was recognized. The full-length cDNA of the new gene was obtained by joining the 3‘ RACE PCR fragment and the EST clone. To express the new gene, the cDNA was cloned into pGEX-4T-1 vector and then transformed into E. coli JM109. The recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE and Western-blot. Results A 908 bp cDNA was isolated from S. japonicum and identified to be casein kinase Ⅱ beta subunit gene by sequence analysis. The open reading frame of the gene encodes a protein of 217 amino acids exhibiting 75.8%, 75.8%, 73.9%, 68.2%, 51.6% identity to the amino acids sequence of the corresponding genes of Homo sapiens (H. sapiens), Xenopus laevi (X. laevi) , Drosophila melanogaster (D.melanogaster), Caenorhabditis elegan (C. elegan), and Schizosaccharomyces pombe (S. promber) respectively. The predicted molecular weight of the protein was 24. 921 kDa. The new cDNA sequence had been submitted to GenBank, and its accession number is AY241391. This cDNA was subcloned into the pGEX-4T-1 vector and expressed in E coil JM109. The recombinant protein could be recognized by the S. japonicum infected rabbit serum. Conclusion The full-length cDNA sequences encoding S. japonicum casein kinase Ⅱ beta subunitwere firstly sequenced, cloned, and expressed in E coil.     

利用基因芯片技术研究电击伤后心肌组织基因表达谱的改变

目的研究电击伤后心肌组织基因表达谱的改变,筛选与心肌电损伤过程相关的差异表达基因.方法将大鼠心脏电击伤3 h后的心肌组织(电击组)和正常心肌组织(对照组),分别提取总RNA,制备Cy5-dCTP和Cy3-dCTP的标记的cDNA探针,并与BioStar-40基因芯片进行杂交.杂交信号经扫描后,计算机分析基因表达情况.结果电击伤后心肌组织中共有71个基因或EST发生差异表达,其中35个基因或EST表达上调,36个基因或EST(expressed sequence tags)表达下调.这些基因涉及凝血、炎症反应、信号转导及机体自稳态等多个方面,此外还有44个基因或EST的功能是未知的.结论利用基因芯片技术初步筛选出与心肌电损伤过程相关的多个差异表达基因,为揭示心脏电击伤的分子机制提供了依据.     

日本血吸虫中国大陆株琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白的克隆与表达

目的：克隆日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白（sjSDISP）全长编码基因,并对所获基因在大肠杆菌中进行表达。方法：根据基因库中SjSDISP对应的EST（BU804141）以及日本血吸虫成虫cDNA文库载体λgtl1多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物,以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板,采用锚式PCR对SjSDISP基因不完整的3′端和5′端进行扩增、测序,用电子软件拼接成全长cDNA,将其克隆到表达载体pGEX-4T-1上,经琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶消化、PCR和测序鉴定后,选择阳性克隆进行表达及Western印迹分析。结果：获得1071bp全长cDNA,其理论推导为编码278个氨基酸残基的蛋白质。SjSDISP基因在大肠杆菌BL2．中获得良好表达。该融合表达产物相对分子质量约为56kD,且能被日本血吸虫成虫抗原免疫血清特异识别。结论：编码日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白全长cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达获得成功。     

紫外线致弱尾蚴免疫兔血清筛选血吸虫成虫cDNA文库

目的 :寻找照射致弱尾蚴中起免疫保护作用的抗原分子 ,为血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原。方法 :用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)成虫cDNA文库 ,并对阳性克隆的插入基因片段进行PCR扩增及测序分析。结果 :经三轮筛选 ,获 10个阳性克隆 ,其插入的SjcDNA片段大小为 1 5～1.8kb。初步测序获 5个部分序列 ,其中 2个序列分别与Sj动力蛋白轻链 5 (DLC 5 )及Sj线粒体基因明显同源 ,其余 3个序列为未知的新基因片段。结论 :获得的阳性克隆插入基因片段可能为编码抗日本血吸虫感染的抗原基因