穿透支原体P35蛋白细胞粘附活性研究

目的研究穿透支原体（Mpe）P35蛋白的细胞粘附活性。方法IPTG诱导pQE31/p35原核表达载体在E.coli 中表达,用Ni-NTA Spin亲和纯化,Western blot鉴定表达产物。通过间接免疫荧光试验（IFA）、竞争抑制试验研究rP35对HeLa细胞的粘附活性。结果pQE31/p35在E.coli 中表达出分子量约35 kDa的蛋白质,Western blot鉴定其为特异性rP35蛋白。IFA发现rP35对HeLa细胞无明显的粘附活性;竞争抑制试验表明rP35不能抑制Mpe粘附HeLa细胞。结论P35可能不是Mpe的主要粘附分子。     

穿透支原体P35蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的为研究穿透支原体(Mpe)35 kD脂质相关膜蛋白(P35)的生物学活性,构建其原核细胞表达载体,并在大肠杆菌(E.coli)中表达.方法 PCR扩增p35基因片段,克隆至pQE31载体, 用PCR介导的突变将p35基因中两个“TGA”终止密码子定点突变为“TGG”,使其在E.coli中编码表达色氨酸.IPTG诱导pQE31/P35在E.coli 中表达目的蛋白rP35,经Ni-NTA Spin亲和纯化, Western blot分析鉴定表达产物. 结果 PCR扩增出约1kb的DNA片段,克隆至pQE31载体,筛选到阳性克隆pQE31/P35,测序分析 p35基因中两个“TGA”终止密码子成功突变成“TGG”. IPTG诱导pQE31/p35在E.coli 中表达分子量约37.4 kD的蛋白质,Western blot分析鉴定其为rP35. 结论构建的pQE31/p35原核表达载体,在E.coli中成功地表达rP35.     

弓形虫表面抗原P35重组蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 构建弓形虫R0H株表面抗原P35基因重组表达质粒P35／pGEX-2T，并在大肠杆菌JMl09中进行表达、纯化及鉴定。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从弓形虫CDNA库中扩增出编码P35抗原的基因片段，克隆入表达载体pGEX-2T，并在大肠杆菌JMl09中融合表达，经GSTmp^TM亲和层析柱纯化出P35重组融合蛋白，以SDS-PAGE电泳鉴定纯度、Western-blot鉴定抗原性。结果成功构建了重组表达质粒P35／pGEX-2T，融合表达产物的分子质量约为70kDa；该蛋白抗原能为谷胱甘肽S转移酶(GST)单克隆抗体及弓形虫感染的兔血清所识别。结论弓形虫表面抗原P35在大肠杆菌中有效表达，纯化蛋白有良好的免疫活性。     

IL-35亚基EBI3、P35对系统性硬化症小鼠肺部和皮肤炎症及肺纤维化的影响

目的：研究白细胞介素（IL）-35亚基对系统性硬化症（SSc）小鼠肺部和皮肤炎症及肺纤维化的影响。方法：将24只雌性BALB/c小鼠随机分为4组：正常对照组、SSc模型组、SSc+EB病毒诱导的基因3抗体（SSc+EBI3 mAb）组和SSc+IL-12A P35抗体（SSc+P35 mAb）组,除正常对照组外,其余各组小鼠注射博来霉素构建SSc模型。造模后,SSc+EBI3 mAb组和SSc+P35mAb组分别腹腔注射100μL的EBI3 mAb、P35 mAb。采用苏木精—伊红（HE）染色观察小鼠皮肤和肺组织炎症病理改变,Masson染色观察肺纤维化程度,免疫组化法检测皮肤和肺组织α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清IL-35、IL-6、IL-10水平。结果：与对照组相比,SSc模型组小鼠皮肤厚度增加,肺纤维化评分、皮肤和肺组织炎症评分、血清IL-35水平及皮肤和肺组织α-SMA表达水平均升高,血清IL-10水平降低（均P<0.05）。与SSc模型组比较,SSc+EBI3 mAb组和SSc+P35 mAb组小鼠皮肤厚度增加,血清IL-...     

P53、P21WAF1、Cyclin E与乳腺癌临床病理指标的关系

目的:通过检测P53蛋白、P21WAF1蛋白、Cyclin E在乳腺癌中的表达及其与临床病理指标的关系,探讨乳腺癌的生物学特性,分析它们在乳腺癌的发生、转移中所起的作用.方法:应用免疫组化S-P法检测88例乳腺癌石蜡包埋标本中P53、P21 WAF1、Cyclin E的表达情况.结果:有淋巴结转移组P53的阳性表达率76.92%高于无淋巴结转移组的阳性率36.73%.淋巴结转移组P21WAF1的阳性表达率23.08%明显低于无淋巴结转移组的阳性率46.94%. Cyclin E在乳腺癌Ⅱ～Ⅲ级中阳性表达率55.07%明显高于Ⅰ级中阳性表达率26.32%, 有淋巴结转移组Cyclin E的阳性表达率71.79%高于无淋巴结转移组的阳性率30.61%.结论:P53、P21WAF1、Cyclin E与乳腺癌的发生、发展有关,可作为判断患者淋巴结转移及推断预后的指标.     

大鼠食管上皮细胞色素P450 2E1和谷胱甘肽S转移酶的初步研究

细胞色素Ｐ４５０和谷胱甘肽Ｓ转移酶是二组参于抗肿瘤药物和致癌剂代谢的重要酶系。利用免疫组织化学技术，对甲基苄基亚硝胺（ＮＭＢｚＡ）诱发的大鼠食管肿瘤动物模型中Ｐ４５０２Ｅ１和ＧＳＴα，ＧＳＴπ和ＧＳＴμ在食管上皮细胞中的分布和定位进行初步研究。结果显示大鼠食管上皮细胞出现不同程度的Ｐ４５０２Ｅ１和ＧＳＴ，特别是ＧＳＴμ的表达。后者与细胞的增生状况有明显的关系。在非上皮性组织中未见到Ｐ４５０２Ｅ１和ＧＳＴ的表达。证实了大鼠食管上皮Ｐ４５０２Ｅ１和ＧＳＴ表达的存在及其与细胞形态学变化的关系，有助于加深对食管癌变中的Ｐ４５０和ＧＳＴ酶功能变化作用的了解。     

ALT与HCV核心抗原及HCV—RNA相关性研究

目的研究ALT与HCV核心抗原、HCV—RNA间关系。方法对81例HCV—RNA阳性标本检测HCV核心抗原和ALT水平。结果81例HCV—RNA阳性标本检出HCV核心抗原阳性32例,灰区26例,ALT水平超过临床参考值56例,ALT检测水平与HCV核心抗原阳性程度呈正相关性。结论HCV—cAg仅与HCV—RNA复制密切相关,与复制水平无关。HCV核心抗原可联合HCV抗体检测提高血液标本HCV感染检出率,结合ALT可以评测感染状态。     

DAAs治疗HIV/HCV共感染患者HCV的疗效分析

目的 观察HIV/HCV共感染患者使用DAAs治疗HCV的疗效及安全性.方法 53例患者根据HCV基因分型结果 1 b、6 a亚型使用Sofosbuvir+Ledipasvir治疗, 3 a、3 b亚型及不能分型使用Sofosbuvir+Daclatasvir治疗, 诊断肝硬化患者均加用利巴韦林, 疗程均为12周.结果 53例患者均完成抗HCV治疗, 总体DAAs治疗SVR率98.1% (52/53) 失败率1.9% (1/53) ) , 无肝硬化患者DAAs治疗SVR率100% (41/41) , 肝硬化患者DAAs治疗SVR率91.7% (11/12) , 失败率8.3% (1/11) .DAAs治疗患者ALT、AST水平均较治疗前下降 (P<0.05) , 治疗后患者CD4水平较治疗前有所提高 (P<0.05) .主要不良反应有:消化道症状12例 (22.6%) , 恶心、呕吐6例 (11.3%) , 腹泻4例 (7.6%) , 轻度皮疹1例 (1.9%) , 血清总胆红素升高5例 (9.4%) .结论DAAs治疗HIV/HCV共感染患者HCV的总体SVR率高 (98.1%) , 适应症广泛肝硬化患者也可使用, 可有效改善患者肝功能及CD4水平.全口服、疗程短、安全性高, 毒副反应轻微、患者耐受性好.     

Aβ25-35诱导PC12细胞周期紊乱及对P53和Cyclin D1基因表达的影响

目的:探讨Aβ25-35诱导体外去血清培养的PC12细胞周期变化及对P53和Cyclin D1基因表达的影响。方法:PC12细胞同步于G0期,采用终浓度为0-45μmol/L或浓度为25μmol/L Aβ25-35处理PC12细胞,用MTT比色法分析细胞存活率;流式细胞仪检测分析细胞周期的改变;RT-PCR和Western blot从mRNA及蛋白水平检测P53和Cyclin D1基因的变化。结果:随着Aβ25-35剂量的增加,PC12细胞存活率降低(P<0.01);流式细胞仪分析表明去血清培养24 h可使约90%PC12细胞停滞于G0/G1期,25μmol/L Aβ25-35诱导组8,16,24 h与对照组比较,S期百分率明显增加(P<0.01),16 h后细胞凋亡率明显增加(P<0.01),可见明显的亚二倍体峰(Ap峰);P53 mR-NA表达和P53蛋白表达降低、Cyclin D1 mRNA表达和Cyclin D1蛋白表达增高。结论:Aβ25-35降低去血清培养的PC12细胞存活率,诱导同步化于G0/G1的PC12细胞重新进入细胞周期,并阻滞于S期,同时出现凋亡,可能与下调P53的表达,上调Cyclin D1的表达有关。     

人L-ficolin基因重组蛋白的表达及功能研究

目的:构建人L-ficolin基因的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:用PCR方法从质粒pCDNA3-L-ficolin中扩增L-ficolin cDNA片断,并将该片断插入pGEX-KG原核表达载体中,以进行插入基因的融合表达,表达后再用Thrombin切除GST以得到单纯的L-ficolin蛋白,SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定,并以细菌侵袭试验检测所得蛋白的生物学活性。结果:酶切结果证实,成功地构建了pGEX-KG-L-ficolin原核表达载体,并使之在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的分子质量(Mr)与预期值相一致。原核表达的L-ficolin蛋白具有调理吞噬作用,促进吞噬细胞吞噬细菌的能力,L-ficolin调理吞噬能力呈剂量依赖关系,并显著高于对照蛋白。结论:成功地构建了重组表达载体pGEX-KG-L-ficolin,经过Thrombin作用后得到的L-ficolin蛋白具有生物学活性,为进一步研究人L-ficolin的功能奠定了基础。     

细胞色素P4502E1基因多态性与胃癌的关系

目的 探讨人体代谢亚硝胺的重要同功酶细胞色素Ｐ４５０２Ｅ１（ＣＰＹ２Ｅ１）基因多态性与胃癌危险性的关系。方法 应用病例对照分子流动病学研究方法，采用聚合酶链和限制性片段长度多态性技术，对福建省胃癌主 长乐市９１例原发性胃癌病例和９４例人群对照的ＤＮＡ进行ＣＰＹ２Ｅ１基因型检测和分析。结果ＣＰＹ２Ｅ１的Ｃ１／Ｃ２和Ｃ２／Ｃ３基因型在胃癌病例和对照中分别为３６．２６％和２４．４７％，Ｆｉｓｈｅｒ‘ｓ精     

P14ARF和E2F1在结直肠肿瘤中的表达及意义

目的:观察P14ARF、E2F1蛋白在结直肠肿瘤的表达,明确其对肿瘤发生及侵袭发展的影响.方法:应用免疫组化方法检测尸检正常结直肠组织6例,结肠腺瘤30例,不伴淋巴结转移(无LNM)结直肠癌35例,伴有淋巴结转移(有LNM)结直肠癌30例,后者再分为手术切缘组织、结直肠癌组织、淋巴结转移癌组织,共6组的P14ARF、E2F1蛋白表达情况,采用半定量和图像分析定量测定含量.结果:①结直肠正常黏膜组织、腺瘤组织、癌组织P14ARF、E2F1的表达阳性率逐渐减少,差异存在统计学意义(P<0.05).②P14ARF、E2F1在伴有淋巴结转移、肝转移的癌组织内表达阳性率与不伴转移的癌组织之间差异无统计学意义(P>0.05).③P14ARF、E2F1蛋白表达在不同临床病理特征的关系之间差异无统计学意义(P>0.05). 结论:①P14ARF、E2F1具有抑制癌发生作用,蛋白异常仅是结直肠癌癌变早期事件,与淋巴结、远处器官转移等侵袭活动无关,与临床病理特征无关.②P14ARF、E2F1相互协同抑制细胞生长和诱导凋亡,因而可以作为治疗结直肠癌的新靶点.     

丙型肝炎病毒HCV E1区基因在真核细胞中的表达及表达产物的初步应用

目的:建立丙型肝炎病毒包膜区基因的真核表达载体,并对表达产物进行鉴定,同时测定表达产物与抗HCV阳性血清的反应情况。方法:用限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ从原核表达载体pMSCVE1中切下HCVE1区的基因片段,并将其克隆到真核表达载体PcDNA3.1中,阳性克隆经SmaⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定后,用磷酸钙共沉淀法将其转染入小鼠骨髓瘤细胞SP2/0中,同时利用WesternBlot方法对表达产物进行鉴定;测定表达产物与20份抗HCV阳性血清标本和10份抗HCV阴性的血清标本的反应性。结果:经酶切过夜后从原核表达载体上切下的基因片段与经过同样双酶切的真核表达载体PcDNA3.1连接,阳性克隆经SmaⅠ和XbaⅠ酶切后产生了预期大小的354bp的片段。经磷酸钙转染,产生了具有对G418抗性的细胞克隆,经WesternBlot方法用抗HCVE1区合成肽抗原的单抗检测表达产物,产生了特异的反应;并证实该表达产物与HCV患者的血清有特异反应。经WesternBlot证实在抗HCV阳性血清中有35%(7/20)可与表达产物产生特异的反应;阳性细胞经3个月传代后,仍可检测到HCVE1的表达产物。结论:此项研究所建立的能够表达HCVE1基因细胞系表达产物可与阳性血清发生特异性反应,该细胞系的建立为进一步研究抗HCVE1抗体的临床意义及进行有关HCV核酸免疫的研究创造了条件。     

肝细胞色素P450 2E1在大鼠非酒精性脂肪肝发生中的作用

目的研究大鼠非酒精性脂肪肝肝细胞色素P450 2E1表达变化及其在脂质过氧化反应中的作用.方法Wistar大鼠40只,随机分为正常对照组和高脂饮食诱导脂肪肝组,用免疫组织化学和Western blot方法测定肝细胞色素P450 2E1表达变化,酶学测定丙二醛含量.结果脂肪肝大鼠丙二醛含量较正常对照组增高,以高脂饮食8、12周为甚(P＜0.05),肝细胞色素P450 2E1表达亦明显增强(P＜0.01).结论肝细胞色素P450 2E1表达变化与脂肪肝引起的肝脏损害以及脂质过氧化反应程度密切相关.     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E1研究进展

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染而引起的严重威胁人类健康的传染病，目前还没有研制成功有效的疫苗。HCV—E1包膜糖蛋白是HCV的结构蛋白之一，具有重要的受体结合位点和抗原表位，在病毒感染和宿主免疫过程中起着十分重要的作用。其分子和功能特性的研究对HCV预防和治疗的研究有重要意义。近年来，有关E1蛋白在机体的免疫应答及其在疫苗研制方面的作用取得了一定的进展，本文就此做一综述。     

人源细胞色素P450 2E1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的: 人源细胞色素P450 2E1(cytochrome P450 2E1, CYP2E1)基因的克隆及其表达?方法:采用RT-PCR方法对我国汉族人CYP2E1基因进行了克隆,并利用pET-32a(+)原核表达载体进行了表达?结果:经过酶切与测序鉴定表明扩增的CYP2E1基因含有完整的编码序列,除该基因编码区第1 263位核苷酸发生C→T的突变(未引起氨基酸发生突变)外,其他核苷酸与氨基酸序列与GenBank中登录发表的人CYP2E1基因完全相同?SDS-PAGE分析结果显示该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)后在BL21(DE3)大肠杆菌中成功表达?结论:该基因的成功表达为开展临床前药物安全性评价与药物代谢分析的后续工作打下了基础?     

中药对细胞色素P450 2E1影响的研究进展

细胞色素P450 2E1(CYP2E1)不仅参与药物代谢，还能催化许多前毒物和前致癌物的活化过程。近年发现许多中药能抑制或诱导CYP2E1活性，从而导致有益的和不利的药物相互作用。以近年国内外文献报道以及相关研究为依据，综述了中药有效成分、提取物和单复方对CYP2E1的影响，以及CYP2E1介导的中药药物相互作用，并对其影响机制进行简要介绍。以期为中药的临床合理使用，提高其有效性和安全性提供参考。