基于报告基因的PPAR-α激动剂筛选体系的建立

目的基于PPAR-α受体的信号传递通路和利用双萤光素酶报告基因分析方法,建立稳定的PPAR-α激动剂体外筛选体系。方法 pcDNA3.1-PPAR-α、pGL3-PPRE-luc及pRL-CMV共转染293T细胞后,设0,0.1,1,10,50μmol·L-1非诺贝特不同浓度点进行干预后,测定每浓度点重复5个样本。对转染优化试验数据,比较均值大小选取最佳结果;对不同转染组之间的差异性比较,采用t检验和方差分析。结果浓度为0.1,1,10,50μmol·L-1非诺贝特干预组相对诱导率分别为：0.82,1.29,1.72,1.94,表现有统计学差异（P〈0.05）。结论成功建立基于PPAR-信号通路及双萤光素酶报告基因分析方法的PPAR-α激动剂筛药系统。     

基于报告基因的PPAR-α激动剂筛选体系的建立

目的 基于PPAR-α受体的信号传递通路和利用双萤光素酶报告基因分析方法,建立稳定的PPAR-α激动剂体外筛选体系。方法 pcDNA3.1-PPAR-α、pGL3-PPRE-luc及pRL-CMV共转染293T细胞后,设0,0.1,1,10,50 μmol·L^-1非诺贝特不同浓度点进行干预后,测定每浓度点重复5个样本。对转染优化试验数据,比较均值大小选取最佳结果;对不同转染组之间的差异性比较,采用t检验和方差分析。结果 浓度为0.1,1,10,50 μmol·L^-1非诺贝特干预组相对诱导率分别为：0.82,1.29,1.72,1.94,表现有统计学差异(P<0.05)。结论 成功建立基于PPAR-信号通路及双萤光素酶报告基因分析方法的PPAR-α激动剂筛药系统。     

毒蕈胆碱M_1受体激动剂的高通量筛选模型

目的　建立毒蕈碱样胆碱M1 受体激动剂的高通量筛选模型 ,以此模型进行M1 受体激动剂筛选。方法　将M1 受体基因质粒 (M1 /pCDNA3 1 )与报告基因质粒 (3×CRE/ 3×MRE/SRE LUC)按 1∶5的比例共转染HEK2 93 ,建立了一个稳定的M1 受体激动剂报告基因筛选细胞株。配体与细胞表面M1 受体结合后 ,激活相应的信号通路 ,调节报告基因的表达 ,通过测定荧光酶素报告基因表达水平的变化 ,评估配体激活M1 受体的生物活性。结果　通过对筛选条件 ,如细胞数目、荧光素酶表达时间、底物浓度的优化 ,建立了可靠的筛选方法 ,并对多种抗衰老中药水提物进行了筛选 ,找到 3种对M1 受体有活性的中药。结论　该系统能准确、稳定、有效地应用于M1 受体激动剂的高通量筛选     

基于报告基因检测的β3肾上腺素受体激动剂筛选模型的建立与应用

目的：建立基于双荧光素酶报告基因检测的β3肾上腺素受体（β3-AR）激动剂筛选模型,并用于β3-AR激动剂的筛选。方法：应用免疫细胞化学法鉴定β3-AR在β3-CHO细胞上的稳定表达,并将pCRE-luc质粒与pRL-TK质粒共同瞬时转染β3-CHO细胞,建立一种基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型。通过检测报告基因萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值,来间接反映配体对β3-AR的激动活性。并以β-AR激动剂异丙肾上腺素刺激对模型的有效性进行验证,在此基础上以此模型对20种新化合物的β3-AR激动活性进行筛选。结果：β3-CHO细胞经免疫细胞化学法鉴定有特异性受体蛋白表达。通过将两个报告基因质粒转染该细胞后,与加入溶剂对照相比,加入异丙肾上腺素可显著促进荧光素酶报告基因的表达,表明该模型有效、可靠。以此模型从20个化合物中初筛出8个活性较强的β3-AR激动剂。结论：本研究建立了基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型,并以此模型筛选发现了几个活性较强的β3-AR激动剂。     

基于报告基因和干扰素-α信号通路的药物筛选模型的建立

目的　建立基于报告基因和干扰素 α(Interferon α)信号通路的药物筛选模型,用于筛选具有IFN α样活性的小分子化合物。方法　构建带有ISRE(IFN αstimulatedresponseelement)靶序列和报告基因的诱导性表达载体,并将其转染入血管内皮细胞 (ECV304 )中,筛选报告基因碱性磷酸酶(SEAP)表达受IFN α诱导的阳性克隆。选取相关的细胞因子干扰素 β、干扰素 γ和生长因子甲状旁腺素(PTH)进行模型特异性考察。结果　ECV304细胞中SEAP的表达受IFN α的诱导并呈现剂量依赖关系,IFN α的最高诱导表达率是IFN β最高诱导表达率的 9 0倍、IFN γ的 8 8倍、PTH的 9 1倍,具有相对特异性。IFN α对ECV304细胞无增殖作用。本方法的Z' 因子为 0 8,说明此模型具有很好的稳定性。结论　本模型的SEAP基因表达水平能够被其特异性配体强诱导表达,利用此模型在 96孔板上用化学发光法测定SEAP基因的诱导表达水平可筛选具有IFN α样活性的小分子化合物。     

基于报告基因的雌激素受体α亚型配体筛选模型的建立和应用

目的　建立基于报告基因的雌激素受体α亚型配体的筛选模型,用此模型对收集到的化合物进行筛选,以发现具有新结构的雌激素受体配体。方法　构建诱导性表达载体并转染入ERα ⁺HepG2细胞中,筛选报告基因CAT表达受雌二醇诱导的阳性克隆。采用ELISA法检测化合物对CAT表达的影响,体外细胞存活实验对化合物进行功能性检测。结果　ERα ⁺HepG2细胞中CAT的表达受雌二醇的诱导并呈现剂量依赖关系。化合物三羟基二苯乙烯诱导CAT表达的最大活性为雌二醇的1.75倍。结论　利用此模型通过测定CAT基因的诱导表达水平可筛选得到新结构的雌激素受体配体。     

维甲酸受体为靶点的高通量药物筛选细胞模型的建立维甲酸受体为靶点的高通量药物筛选细胞模型的建立

目的建立绿色荧光蛋白(GFP)标记的以维甲酸受体为靶点的高通量药物筛选细胞模型，用于筛选治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)、银屑病、痤疮以及肿瘤的新型药物。方法用分子生物学的方法，构建含有8个串连维甲酸受体应答元件(RARE)并连接报告基因E-GFP的重组载体。将体外培养的细胞株用该重组载体进行稳定转染，然后进行单克隆培养，最终挑选出敏感、高效、稳定表达的单克隆细胞，用于筛选针对维甲酸受体的小分子有机药物。结果建立了高效的药物筛选细胞模型。此模型筛选方法简便，适用范围广，灵敏度高，结果稳定。结论挑选出的细胞株作为药物筛选模型可用于大规模高通量药物筛选。     

5-羟色胺1A受体激动剂高通量筛选模型的建立

目的为发现5-羟色胺1A(5-HT1A)受体的激动剂,通过报告基因活性检测的方法建立高通量筛选(HTS)细胞模型。方法将带有人源5-HT1A受体的真核表达质粒pcD-NA3.1(pcDNA3.1-h5-HT1AR)与带有报告基因pCRE-luc的pcDNA3.1质粒(pcDNA3.1-pCRE-luc)共转染到工具细胞中,通过对工具细胞选择、共转染质粒比例、化合物孵育时间及阳性化合物选择等条件进行探索和优化,建立了稳定表达人源5-HT1A受体并可用于该受体激动剂筛选的细胞模型(HEK293-h5-HT1AR)。结果①根据瞬转实验中信号值的高低,模型采用HEK293细胞作为工具细胞;②根据瞬转实验中的信噪比,发现pcDNA3.1-h5-HT1AR:pcDNA3.1-pCRE-luc的最佳比例为1∶3;③对化合物孵育时间进行优化,选择的最佳孵育时间为6 h;④阳性化合物的选择过程中,实验研究了5-HT.HCl,Flibanserin,8-OH-DPAT以及Lorcaser-in(APD356)4个已报道有5-HT1A受体激动活性的化合物,结果表明APD356在该体系中最适合作为阳性对照化合物。⑤该细胞株连续培养12代,信号稳定。结论通过对一系列实验条件进行选择和优化,建立了一个稳定表达人源5-HT1A受体的细胞模型,该模型可用于高通量5-HT1A激动剂的筛选。     

基于COL1A1启动子的抗肝纤维化药物高通量筛选模型的建立及应用

为了有效筛选潜在的抗肝纤维化药物,本实验室建立了基于COL1A1启动子的高通量筛选细胞模型。该细胞模型在TGF-β1的刺激下,激活COL1A1启动子及荧光素酶报告基因的表达,而该激活作用可以被候选化合物抑制。作者首先构建COL1A1启动子和荧光素酶报告载体p GL4.17的重组质粒。采用双荧光素酶报告基因检测系统对该启动子的活性进行检测,发现重组质粒比对照组荧光素酶活性高15.98倍。该质粒转染到人肝星状细胞株LX2中,用无限稀释法得到单克隆细胞株,并利用活体成像仪筛选出稳定表达COL1A1启动子的单克隆细胞株LX2-COL。经TGF-β1诱导后检测该单克隆细胞株LX2-COL对候选化合物(S1~S7)的反应性,其中S7对启动子活性抑制作用最强。Real-time RT-PCR和Western blotting验证了经该细胞模型筛选得到的化合物S7能够抑制Ⅰ型胶原m RNA和蛋白水平的表达。结果表明,该细胞模型的建立能够实现对潜在的抗肝纤维化化合物的高通量筛选。     

基于报告基因和PPARγ信号通路的药物筛选模型的建立

目的　建立基于报告基因和PPARγ(peroxisomeprolif erator activatedreceptorγ)信号通路的药物筛选模型,用此模型筛选具有胰岛素增敏活性的小分子化合物。方法　五种细胞分别进行瞬时转染,将含有目的片段PPRE(peroxisomeproliferatorresponseelement)和报告基因荧光素酶(Luc)的质粒及表达PPARγ的质粒共转染到细胞中,通过测定荧光素酶活力来考察马来酸罗格列酮对PPARγ信号通路的影响,选取诱导表达倍数最高的细胞株建立模型。用其他类型核受体激动剂对此模型进行特异性考察。结果　293T细胞中,荧光素酶的表达受马来酸罗格列酮的诱导倍数最高,可达4 9倍,并呈现一定的剂量依赖关系,Z′因子为0 .72。而其他各类核受体激动剂的诱导表达率均在1倍左右。马来酸罗格列酮在转染剂量范围内无促进细胞增殖的作用。结论　马来酸罗格列酮对共转染报告基因质粒和表达PPARγ质粒的293T细胞Luc的表达具有较强的诱导作用,此模型具有较好的特异性和稳定性,适用于建立筛选PPARγ激动剂的高通量筛选模型。     

LXR激动剂3β-羟基-5α、6α仪环氧胆酸甲酯对血管内皮细胞ABCA1、LXRα表达的影响

目的初步研究LXRα激动剂3β-羟基-5α、6α环氧胆酸甲酯(Methyl 3β—hydroxy-5α、6α-epoxycholanate MHEC）对体外培养的人ECV-304血管内皮细胞ABCA1mRNA、LXRαmRNA表达的影响，探寻血管内皮细胞中LXR途径激活的机制及意义，并为国产LXR激动剂MHEC作为临床药物应用的可能性提供实验依据。方法以ECV-304血管内皮细胞株为研究对象，应用RT-PCR方法栓测LXR激动剂MHEC作用前后细胞ABCAlmtLNA、LXRαmRNA表达的变化，应用免疫组化S-P法检测MHEC对ECV-304细胞ABCA1蛋白表达的影响。结果MHEC能够显著上调血管内皮细胞中ABCA1、LXRα基因的表达，并呈时间和剂量依赖性。实验证实血管内皮细胞中存在LXRα基因的自身激活机制。结论MHEC是一种强力有效的LXR激动剂，能以剂量和时间依赖的方式上调血管内皮细胞中ABCA1和LXRα基因的表达。     

核受体PXR、CAR、LXR和FXR作为代谢性疾病治疗靶点的研究进展

PXR、CAR、LXR 和FXR 是核受体家族的重要成员,在体内广泛分布,经配体活化后调控众多机体代谢相关的酶、转运蛋白和信号途径,在糖异生、脂类代谢及其胆汁平衡中扮演着重要的角色。通过主要介绍核受体家族主要成员PXR、CAR、LXR和FXR 在糖异生、脂类代谢以及胆汁平衡中的调控作用,从而可能为糖脂代谢和胆汁平衡紊乱相关代谢性疾病的药物治疗提供新依据。     

基于报告基因的胰岛素受体蛋白酪氨酸激酶激动剂细胞筛选模型的建立

目的建立用于大规模筛选胰岛素受体蛋白酪氨酸激酶(IRTK)激动剂的细胞模型。方法将含有编码胰岛素受体(IR)基因、转录激活因子5B(STAT5B)基因和STAT5应答元件调控的荧光素酶基因的质粒瞬时共转染仓鼠卵巢(CHO)细胞,人肝癌细胞HepG2和小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12,将具有较高的胰岛素诱导表达荧光素酶活性的细胞经G418筛选,获得具有胰岛素诱导表达荧光素酶活性的细胞克隆。RT-PCR检测外源基因的表达的稳定性。荧光素酶活性分析和MTT法检测胰岛素处理后荧光素酶诱导表达的量效关系,以及AG1024和AG490处理后胰岛素诱导荧光素酶表达的特异性。并在96孔板上优化荧光素酶的检测条件。结果共转染的CHO细胞较HepG2和C2C12表现出更高胰岛素诱导的荧光素酶活性,经G418筛选得到一株具有较高诱导表达率的细胞克隆。RT-PCR表明,该细胞克隆表达外源胰岛素受体和STAT5B。该细胞中荧光素酶的诱导表达对于胰岛素具有剂量依赖性。IRTK抑制剂AG1024能阻断胰岛素诱导荧光素酶的表达,而Jak激酶抑制剂AG490无此作用。在96孔板上的荧光素酶的优化检测条件为:接种量每孔15×103个细胞,受试物诱导表达8h,Promega荧光素酶检测试剂按推荐量进行4倍稀释使用。结论在转基因CHO细胞中,IRTK的激活能灵敏、特异地诱导荧光素酶的表达。因此,该细胞模型可用于IRTK激动剂的高通量筛选。     

基于报告基因的雌激素受体β亚型激动剂细胞筛选模型的建立

目的建立基于报告基因和雌激素受体β(estrogen receptor β，ERβ)亚型信号通路的药物筛选模型，以期发现ERβ亚型激动剂。方法构建带有雌激素应答序列(estrogen responsive element，ERE)靶序列和报告基因的诱导性表达载体pTAL-ERE-SEAP，并将其转入人胚肾(HEK293)细胞中，筛选报告基因分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase，SEAP)表达受雌二醇(17β-estradiol，E₂)诱导的阳性克隆。选取相关核受体配体进行模型的特异性考察，同时考察模型的稳定性及时效量效关系，以及免疫细胞化学染色鉴定转染后ERβ的表达情况。利用此模型对本实验室样品库中的2 622个化合物进行筛选。结果转染pTAL-ERE-SEAP的HEK293细胞中，SEAP报告基因的表达受E₂的诱导并呈剂量与时间依赖关系，E₂对阳性克隆细胞无增殖作用，本模型的Z′因子值为0.7，免疫细胞化学染色结果表明，转染后ERβ表达、地塞米松以及其他配体的诱导表达率低。结论利用此模型通过测定SEAP报告基因的诱导表达水平可筛选ERβ亚型激动剂。     

谷胱苷肽转移酶抑制剂高通量筛选模型的建立和初步应用

谷胱苷肽 - S-转移酶 -π( GST-π)的活性在某些类型的癌症患者中有显著的升高并且在癌症细胞对抗癌药物抗药性的形成过程中起着重要的作用。抑制过量表达的 GST-π酶的活性将有助于克服肿瘤细胞的耐药性 ,因此 ,GST-π被认为是一个潜在的药物作用的靶位点。为了筛选新的抗癌药物的增敏剂 ,我们建立了一个 GST-π酶抑制剂的高通量筛选模型 ,该模型以 CDNB和 GSH为底物 ,在 96 -孔板上通过对 340 nm处吸光度的变化来检测样品对 GST-π酶的抑制活性。经过初筛和复筛 ,从 4 80 0个微生物发酵提取物中筛选到10个阳性样品 ,阳性率为 0 .2 %。     

糖原磷酸化酶抑制剂高通量筛选模型的建立*

目的:建立糖原磷酸化酶(GPa)抑制剂的体外高通量筛选模型。方法:用梯度离心方法提取大鼠肝脏GPa,以葡萄糖-1-磷酸作为底物,通过测定反应中磷酸根的释放量,间接反映肝脏GPa的活性。通过对反应体系的优化,调整反应条件,建立96孔微孔板的高通量筛选模型,用咖啡因对此模型进行验证,并评价高通量技术参数[Z′-因子(Z-′factor),信号本底比(signal to background,S/B),信噪比(signal to noise,S/N)]。用此模型对5 000个样品(包括合成化合物、天然提取物)组成的随机库进行体外筛选,考察这些样品对GPa的抑制作用。结果:确定反应体系条件是:反应温度25℃,反应时间30 m in,底物浓度0.5 mmol.L-1,大鼠肝脏GPa的用量为250 ng。用此条件测定咖啡因对GPa的抑制曲线,计算其半数抑制浓度(IC50)为(285.3±39.6)μmol.L-1,与文献报道(IC50=240μmol.L-1)基本一致;本模型技术参数Z′-因子=0.79,S/B=0.45,S/N=11.32,表明此模型可以用于高通量筛选。应用此模型筛选得到有活性的化合物9个,其IC50在3.56~45.75μmol.L-1。结论:建立的体外GPa抑制剂高通量筛选模型具有快速、微量、准确的特点,可以作为研究降糖药的工具。     

青霉素高产菌株高通量检测和筛选方法的研究

目的:建立高通量筛选青霉素高产菌株的方法.方法:采用青霉素酶水解青霉素形成青霉噻唑酸,产物与碘液反应,以淀粉为指示剂,青霉素含量与碘液用量呈现良好的线性关系.结果:在室温条件下,不超过10min,可并行检测多个发酵液样品的青霉素含量,该方法简便、迅速、微量并且不受发酵液中其他杂质成分的干扰,也可在10min内对超过200个发酵液样品中的青霉素含量进行相对评估,淘汰90%以上的低效价菌株.结论:提供了高通量筛选青霉素高产菌株的方法.     

基于细胞模型的高通量药物筛选

随着高通量药物筛选发展的需要,细胞模型在药物筛选中发挥了越来越大的作用.本文综述了细胞模型在药物高通量筛选中的应用.主要介绍了该模型基础上的筛选流程、模型分类及其在实际药物筛选中的应用,并对其相关的检测技术进行了阐述,以及对其发展前景进行了分析.     

基于JAK/STAT信号通路的高通量药物筛选细胞模型的建立基于JAK/STAT信号通路的高通量药物筛选细胞模型的建立

目的建立基于JAK/STAT信号通路的高通量药物筛选细胞模型,筛选调节免疫系统、造血系统和抗肿瘤药物。方法构建以串连的多个STAT的DNA结合序列为调控序列,以荧光酶基因作为报告基因的表达载体。通过将该载体分别转入体外培养的不同细胞系中使之稳定表达,建立具有激活STAT活性的药物筛选模型,并利用多个抗过敏和抗肿瘤药物样品进行检测。结果建立多株药物筛选细胞模型,筛选方法简便,操作容易,灵敏度高,结果稳定。结论本细胞株可以用于大规模高通量药物筛选。     

建立以HIF-1α为靶标的高通量筛选防治动脉粥样硬化先导化合物的细胞模型

目的 建立一个高通量筛选防治动脉粥样硬化先导化合物的体外细胞模型。方法 克隆HIF-1α低氧反应元件（hypoxia response element,HRE）至荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Enhancer,构建荧光素酶表达载体pGL3-HIF-1α-HRE,转染人单核细胞THP-1并筛选稳定表达细胞株THP-1-HIF-1α-HRE。结果 Real Time-PCR检测表明低氧培养可以有效上调THP-1-HIF-1α-HRE细胞HIF-1α蛋白表达和荧光素酶活性,而洛伐他汀和姜黄素预处理可以有效抑制低氧引起的THP-1-HIF-1α-HRE细胞内HIF-1α蛋白表达及荧光素酶活性。结论 成功建立了筛选抗动脉粥样硬化的先导化合物体外高通量细胞模型THP1-HIF-1α-HRE。