酶联免疫吸附试验检测乙脑病毒抗原的研究Ⅰ实验方法的建立(摘要)

本文采用酶联免疫吸附试验(ELISA)双夹心法,通过影响因素、实验条件的研究,建立了检测乙脑病毒抗原的实验方法。 通过测定,最适条件是包被抗体(差速离心提纯抗原免疫豚鼠抗乙脑病毒IgG)和第二抗体(差速离心抗原免疫家兔抗IgG)浓度为10μg/ml,羊抗兔酶结合物浓度1:30000,抗原抗体作用时间2小时,温度37℃。曾用鱼精蛋白-硫乙二醇半提纯乙脑病毒抗原免疫     

抗丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的制备及免疫组织化学研究

目的 制备丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体并进行免疫组织化学研究。方法以大肠杆菌表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白为固相抗原,利用抗原抗体亲和性结合的原理,从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验(ELISA)和DNA序列分析,获得HCV核心蛋白的人源单链抗体;用该抗体对7721转染全长HCV cDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV核心蛋白抗原进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明,制备的HCV核心蛋白人源单链抗体能与HCV核心蛋白抗原特异性结合;免疫组化结果表明,该抗体能够特异性识别HCV核心蛋白抗原,与正常肝细胞无交叉反应。结论此法制备单链抗体方法简便,周期短,可为HCV核心蛋白病原的检测提供新的检测手段。     

SARS-CoV S蛋白抗原表位多肽的设计合成与免疫反应

目的通过生物信息学与合成多肽方法,寻找SARS-CoV S 蛋白的抗原表位,为抗SARS多肽疫苗的深入研究提供试验依据.方法利用网络共享软件对与S蛋白抗原性相关的参数进行预测分析,从而设计S蛋白的抗原表 位多肽;将合成的抗原表位多肽免疫家兔,用ELISA法检测产生的抗体.结果 ELISA法检测发现,设计合成的2个抗原表位多肽片段(残基348-380,434-470)在家兔体内均能诱导抗体产生.结论设计合成的2个抗原表位多肽片段中包含SARS-CoV S蛋白的抗原表位,免疫家兔后能产生特异性抗体.     

两种酶联免疫法检测SARS病毒特异性抗体的比较

严重急性呼吸综合征 (severeacuterespiratorysyndrome,SARS)是由新型冠状病毒引起的以呼吸道传播为主的急性传染病。目前用于检测SARS病原抗体的酶联免疫吸附 (ELISA)法是世界卫生组织 (WHO)推荐的临床检测抗体的主要方法。ELISA法测抗体又分为间接法和双抗原夹心法 ,本文就这两种方法的检测情况进行了比较。1　材料与方法1 1　血清标本　按常法分别抽取 2 0例健康人 ,2 0例发热非SARS患者和 87例住院不同时期的SARS患者静脉血 ,2h内离心分离血清 ,— 2 0℃冻存 ,1周内检测抗SARS病毒特异性抗体。1 2　试剂　间接ELISA法使…     

定量检测肝细胞生成素Cn的双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的 建立定量检测肝细胞生成素Cn (HPPCn)的双抗体夹心ELISA方法.方法 利用杂交瘤方法获得8个抗HPPCn单克隆抗体(mAb),并行SDS-PAGE和Western印迹对纯化抗体特性进行鉴定.利用镀金芯片法对8个抗体进行配对检测.通过方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体的最适工作浓度.以纯化的HPPCn抗原为标准品建立标准曲线.结果 得到了8株稳定分泌抗人HPPCn抗体的杂交瘤细胞株,分别为Ab 65-29-6,Ab_3-3-3,Ab_9-34-1,Ab_4-8-12,Ab_7-8-10,Ab_2-30-23,Ab_1 1-11-12和Ab_12-27-23.8个抗体均能够特异结合HPPCn抗原,其中Ab_65-29-6与细胞中HPPCn结合的特异性最好.经抗体配对检测证实最佳配对组合为:Ab_2-30-23和Ab_4-8-12.包被抗体Ab_2-30-23和识别抗体Ab 4-8-12的最适工作浓度为2.5 μg/ml,最适稀释度为1∶2000,标准曲线检测的线性范围为5.0～60 ng/ml.结论 制备了可特异性检测人HPPCn蛋白的单克隆抗体,并建立了一种可用于定量检测人HPPCn的双抗体夹心ELISA方法.     

HBV表面抗原和核心抗原联合负载的HBV相关性肝癌患者树突状细胞功能研究

目的 研究HBV相关性肝癌(HCC)患者单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)联合负载HBV表面抗原(HBsAg)和HBV核心抗原(HBcAg)后表型和功能的变化.方法 从20例HBV感染相关性HCC患者外周血单个核细胞(PBMC)中诱导出未成熟的MoDC(imaDC),HBcAg与HBsAg联合负载后用"细胞因子鸡尾酒"(IL-1β、ID-6、TNF-α和PGE2)促成熟,流式细胞仪检测成熟MoDC的表型,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测MoDC分泌的细胞因子,酶联免疫斑点(Elispot)实验检测MoDC诱导自身T细胞分泌IFN-γ的频率,五聚体染色法检测MoDC诱导自身T细胞产生HBV特异性CD8 T细胞的能力.结果 HBsAg和HBcAg联合负载的成熟MoDC(scDC)表面分子表达水平比imaDC显著增加,其中HBsAg、抗-HBe、抗-HBc三项阳性(简称为1-4-5阳性组)的患者MoDC表面分子明显高于HBsAg和抗-HBc两项阳性(简称为1-5阳性组)的患者;scDC分泌IL-12和IL-10水平明显高于用无关蛋白负载的对照组(conDC),1-4-5阳性组患者MoDC分泌的IL-12水平明显高于1-5阳性组;1-4-5阳性组的scDC诱导自体T细胞分泌IFN-γ的频率明显高于conDC;有4例HLA-A2 的1-4-5阳性组患者的scDC诱导自体T细胞产生HBVcorel8-27特异性CD8 T细胞.结论 HBsAg和HBcAg联合负载可以逆转HBV相关性HCC患者MoDC受损的功能,增强1-4-5阳性组MoDC;诱导自体T细胞特异性应答的能力.1-4-5阳性组患者的MoDC功能强于1-5阳性组患者.     

血清抗脑抗体定量方法的建立与应用

抗脑抗体(antibrainantibody,ABAb)是针对脑组织抗原的自身抗体,见于精神分裂症、癫等。目前抗脑抗体的测定多采用人脑、兔脑组织匀浆粗提抗原进行间接血凝、补体结合试验和间接酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法[1～3]。我们从胎牛脑组织中,用pH7.8的Tris缓冲液(含10ml/LTritonX-100及10g/L脱氧胆酸钠,简称TDOC缓冲液)提取,亲和层析技术纯化脑组织抗原(B-Ag),并制备兔抗B-Ag抗血清,建立了定量检测ABAb的ELISA,结果满意。1　对象和方法1.1　对象　经临床确诊精神分裂症住院患者197例(均符合精神分裂症CCMD-2-R诊断标准),男145…     

厦门地区女性不孕患者860例免疫性不孕抗体检测结果分析

目的探讨抗精子抗体(ASAb)、抗卵巢抗体(AOAb)、抗子宫内膜抗体(AEAb)和抗心磷脂抗体(ACLAb)与女性不孕的关系。方法采用酶联免疫吸附实验ELISA和化学发光法对860例女性不孕患者和780例有生育史妇女进行4种血清免疫性抗体检测。结果女性不孕患者ASAb阳性率为10.70%,ACLAb阳性率为7.56%,AEAb阳性率为9.53%,AOAb阳性率为5.93%,4种抗体的阳性率明显高于对照组(P<0.05)。结论血清免疫不孕抗体与女性不孕密切相关,对免疫性不孕的诊断和治疗具有重要的指导意义。     

兔抗鼠单克隆乙型肝炎核心抗体独特型的研究

自从提出免疫网络学说以来,抗独特型(anti-idio-type,简称抗Id)的研究受到重视。我们用小鼠单克佳抗-HB_c(MC抗-HB_c)IgG及其Fab片段免疫家兔进行特异性抗Id制备。为了连续观察免疫过程中动物产生抗Id的状况,建立了两种特异检测抗Id的方法,即ELISA中和法和抗原-抗体结合抑制法,来测定一系列稀释的待检兔血清中抗Id水平。前法系在待检兔血清中加入正常Balb/c小鼠(NBM)IgG中和掉抗同种型和同种异型抗体从而单独检出抗Id,如不加中和抗原即可检出抗鼠IgG/Fab的总抗体水平;后法是将待检标本与酶标记Id抗体共同温育,如标本中存在抗Id即可抑制Id抗体与抗原HB。Ag的结合。用兔抗鼠IgG做对照试验证实上述两法可以排除抗同种型和同     

抗人IgK和Igλ链单克隆抗体的制备及临床初步应用

用初乳和血清IgA免疫Balb/c小鼠的脾细胞与SP_2/O和NS-1瘤细胞融合,以ELISA双抗原夹心法检测获得5株杂交瘤细胞。其中3株(1D1、5C3、11A7)分泌抗人游离和结合型λ轻链;2株(4G12、14A6)分泌抗人游离和结合型K轻链。4G12与结合型K链反应比游离K链好。这些细胞株在长达1年的培养中仍能稳定分泌特异性单克隆抗体,经液氮冻存10个月后杂交瘤细胞仍保持原有的特性。用固相抗原竞争ELISA试验表明,两个抗K链McAb是针对不同的抗原位点,而3株抗λ链则针对相同的抗原位点。用于检测副蛋白和本周氏蛋白具有很好的特异性和敏感性。把McAb4G12-HRP和1D1-HRP混合,用于检测-EB病毒早期抗原(EA)和壳抗原(VCA)抗体被证明是满意的,同时试用于抗核抗体的检测也获得了初步的结果。     

基因工程技术制备抗IL-2蛋白抗体Fab片段及其鉴定方法的建立

目的利用基因工程技术制备人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab抗体片段,并鉴定其抗原结合活性及特异性。方法用固相化的IL-2蛋白从人天然噬菌体抗体库中筛选出表达抗IL-2蛋白Fab抗体片段的阳性克隆,酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性。结果成功筛选并表达了抗IL-2蛋白的Fab段抗体,在SDS-PAGE中形成47kD的条带,Western blot证明为抗人Fab段抗体;ELISA证实该抗体片段具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与牛血清白蛋白、IL-4无交叉反应。结论成功表达并鉴定了人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab片段,构建了一种制备基因工程抗体的有效途径,为基因工程抗体在肿瘤免疫治疗方面的临床应用研究奠定了基础。     

赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备及直接竞争酶联免疫吸附法的建立

目的 建立快速且灵敏的赭曲霉毒素A(OTA)直接竞争酶联免疫吸附检测(cdELISA)方法.方法 采用OTA与卵清蛋白(OVA)偶联作为抗原免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合、克隆筛选,获得鼠抗OTA的杂交瘤细胞株;以ELISA方法测定抗体效价并鉴定抗体的IgG及亚类;用辣根过氧化物酶(HRP)标记OTA,建立cdELISA方法.结果 获得了3株稳定分泌高效价抗OTA单克隆抗体的杂交瘤细胞株(S-17-8、S-212-7和S-225-11),3株重链均为IgG1亚型,轻链为κ亚型;建立了cdELISA检测方法,检测下限为0.5ng/ml.结论 以抗OTA单克隆抗体和OTA-HRP为基础,建立了灵敏且省时的检测OTA的cdELISA方法,为进一步OTA快速筛查提供了条件.     

抗环瓜胺酸肽抗体和葡萄糖-6-磷酸异构酶抗原在类风湿性关节炎中的意义

目的探讨抗环瓜胺酸肽抗体（cyclic citrullinatedpeptide,CCP）和葡萄糖-6-磷酸异构酶抗原（glucose-6-phosphate isomerase,GPI）在类风湿性关节炎中的意义。方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）间接法检测90例RA患者血液中的CCP抗体,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）同样检测90例RA患者血液中的GPI。结果在GPI组Ⅳ期的RA阳性率明显高于Ⅰ期及Ⅱ期～Ⅲ期患者（P〈0.05）,有统计学意义。CCP组在Ⅰ期、Ⅱ期～Ⅲ期和Ⅳ期无统计学意义。GPI在ESR〉100组的阳性率显著高于ESR〈40和40≤ESR≤100组（χ^2=10.045,P=0.007）;抗CCP在各组的阳性率无显著性差异（χ^2=4.432,P=0.109）。结论抗CCP抗体和GPI抗原在RA的诊断中都有重要意义。抗CCP抗体在RA的早期诊断和骨侵蚀方面更有价值,而GPI抗原特异性高于抗CCP抗体和RF,同时,它还能反映关节的炎症程度及RA的活动性。     

碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术的建立及应用

碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP)桥联酶标技术是近10年来发展起来的一种免疫酶标记新技术,它属于不标记抗体桥法,即以APAAP复合物及桥联二抗替代了一般间接免疫酶技术中的酶标抗体。该技术因具有较多的优点,近年来应用逐渐广泛并日益受到重视。然而,建立桥联酶标技术对其中的抗酶抗体纯度要求较高,抗酶抗体与酶结合形成的复合物必须     

双抗体夹心ELISA检测生殖支原体抗原方法的初步建立及临床应用

目的 :建立检测生殖支原体 (Mycoplasmagenitalium ,Mg)抗原的双抗夹心ELISA方法 ,探讨其临床应用的可行性。方法 :采用不同株Mg单抗用ELISA双抗夹心法检测Mg抗原 ,摸索该方法检测Mg抗原的最佳实验条件。对Mg标准株及 10 8份临床标本进行平行测定 ,观察双抗夹心ELISA方法的敏感性和特异性及该方法与PCR检测方法的符合率。结果 :包被单抗量为 2 0 μg ml,酶标记单抗 1∶2 0 0稀释时 ,P N值最大 ;检测Mg抗原敏感度达 2 μg ml;10 8份临床标本PCR检测阳性率 8.2 6 % (10 10 8) ;双抗夹心ELISA法检测阳性率 7.4 1% (8 10 8) ,两者符合率达 89.71%。结论 :建立的双抗夹心ELISA法检测Mg抗原具有快速、敏感、经济、简便易行等优点     

抗T-2毒素单克隆抗体的制备及特性

目的 :建立敏感、特异和快速的针对T 2毒素的ELISA检测方法 ,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒。方法 :利用B细胞杂交瘤技术 ,建立抗T 2毒素的单克隆杂交瘤细胞株。结果 :用T 2 羊免疫球蛋白 (T 2 GIgG)偶联物免疫 8～ 10周龄雌性BALB/c小鼠后 ,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2 /0融合 ,经过 3～ 4次亚克隆建立了 2个稳定分泌抗T 2毒素抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 2A7和 6E4。将上述 2株杂交瘤细胞分别注入BALB/c小鼠腹腔 ,获得含抗T 2毒素单克隆抗体的腹水 ,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化 ,得到 2A7和 6E4单克隆抗体。两株单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为 6 .4× 10 6和 1.1× 10 7,参考工作浓度分别为1.0× 10 6和 3.2× 10 6。纯化后 2A7抗体的IgG含量为 16 .4g/L ,亲和常数为 8× 10 -8mol/L。 2A7抗体与其他结构类似物无交叉反应 ,具有较高的特异性。结论 :制备了具有高特异性和亲和力的抗T 2毒素单克隆抗体 ,初步建立了针对T 2毒素的ELISA检测方法。     

抗莱氏无胆甾原体单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本文采用浓缩提纯的莱氏无胆甾原体做为抗原,多途径免疫 BALB/C 小鼠,取脾细胞与 SP_2/O-Ag~(14)小鼠骨髓瘤细胞融合,建立了4株分泌抗莱氏无胆甾原体单克隆抗体杂交瘤细胞。分析了杂交瘤细胞的染色体,平均数为103条;制备了腹水抗体,经 APAAP 法(碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶桥联酶标显色技术)和 IFA 法检测,抗体效价在80～320之间;对免疫球蛋白亚类进行了鉴定,其抗体均为 IgM。上述细胞经3～4个月稳定传代后,冻存于液氮中。该单克隆抗体的制备对细胞培养中支原体污染的检出可能有重要意义。     

丙型肝炎病毒NS4A抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

为探索新型治疗方法，制备抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS4A的抗独特型人源单链可变区抗体（抗－Id scFv),采用噬菌体表面展示技术，将抗HCV NS4A单克隆抗体固相包被于Nunc板，应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，随机挑选82个克隆，利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验，对其进行免疫学检测和鉴定，获得与HCV NS4A单克隆抗体结合活性较强的抗－Id scFv阳性克隆，并对HCV NS4A特异性抗－Id scFv的编码基因进行序列测定分析。结果：经过筛选82个克隆中有40株克隆ELISA的吸光度（A450nm)值较高，将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白（BSA）进行交叉反应，确定其中有7株交叉反应较弱，结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果，最后确定1株阳性克隆。提取质粒，进行DNA序列测定，DNA为789bp。本实验结果提示，用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗HCV NS4A的抗－Id scFv，为开展用抗－Id scFv防治丙型肝炎的研究创造了条件。     

双抗体夹心ELISA法检测石头鱼毒素

目的 建立石头鱼毒素neoVTX的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,为该毒素的检测、中毒诊断及治疗提供依据.方法 以过碘酸钠法偶联马抗-HRP,利用双抗体夹心ELISA方法检测neoVTX.结果 该法的线性范围在磷酸盐缓冲液(PBS)中为4～512 ng/ml,线性回归方程为Y=1.676X-1.140(r2=0.9728,n=8,P＜0.0001),在血浆中检测线性范围为4～2048 ng/ml,线性回归方程为y=0.3094X-0.1208(r2=0.9907,n=10,P＜0.0001).牛血清白蛋白、卵清蛋白及人血浆对检测结果无干扰.结论 成功建立了石头鱼毒素的双抗体夹心ELISA检测方法,该法有较高的灵敏度和特异性,适用于溶液中及血浆中微量neoVTX的样品分析.     

日本九州地区医务工作者丙型肝炎病毒感染的调查

为了调查HCV感染以对医务人员的危害,作者在日本宫崎县的四所县医院全体人员和福冈市的开业针炙师中进行了血清学研究。研究采用检测抗-HCV(ELISA、补充RIBA)以及抗-GOR(ELISA)法。 研究组为宫崎县的四所县医院(简称四医院组)中自1980年收集的1097份血清标本,并于1987年和1988年进行了抗-C_(100)和抗-GOR检测;以及福冈市1988年收集的183份开业针炙师(简称针灸师组)的血清标本,并全部进行了抗-C_(100)和抗-GOR检测。对照组为随机选择的宫崎县526名献血者和福冈市710名