结核杆菌含信号肽的Mtb8．4真核表达质粒的构建及鉴定

目的 对结核杆菌新抗原一带信号肽的Mtb8．4(MS)进行基因克隆，构建其真核表达质粒并加以鉴定。方法 采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增出带信号肽的Mtb8．4(MS)目的基因，经HindⅢ和EeoR Ⅰ消化后，与pcDNA3.1( )载体进行连接重组。结果 pcDNA3．1( )-MS真核表达质粒构建完成后，用限制性内切酶消化、PCR及DNA测序等多种方法进行鉴定，证实其构建成功。结论pcDNA3．1( )-MS真核表达质粒的成功构建，为进一步研究该质粒的免疫保护效果，了解信号肽序列在MS蛋白表达和分泌过程中所起的作用及制备相应的结核病DNA疫苗奠定了基础。     

含信号肽的Mtb8.4/hIL12嵌合基因真核表达质粒的构建及在COS-7细胞中的表达

[目的]克隆结核分枝杆菌含信号肽的Mtb8.4（MS）/hIL12嵌合基因,导入真核表达载体pCI-neo,并在COS-7细胞中进行表达。[方法]首先以pcDNA3.1（＋）-含信号肽的Mtb8.4（pMS）为模板,经聚合酶链反应（PCR）扩增出MS-linker基因,与pCI-neo载体进行连接重组,构建成pCI-neo-MS-linker（pMSL）重组质粒,然后以pORF-hIL12质粒为模板,经PCR扩增出hIL-12基因,将hIL-12基因与pMSL质粒进行连接重组,构建成MS/hIL12嵌合基因真核表达质粒,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等多种分子生物学方法进行鉴定;重组嵌合质粒转染COS-7细胞后,用RT-PCR方法鉴定MS/hIL12嵌合基因在转录水平的表达情况。[结果]MS/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒经证实构建成功;转染COS-7细胞后,MS/hIL12嵌合基因在转录水平成功表达。[结论]MS/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒的成功构建及在COS-7细胞中的成功表达,为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病MS/hIL12嵌合基因疫苗奠定了基础。     

结核杆菌含信号肽的Mtb8.4/hIL12嵌合基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：克隆含信号肽的Mtb8．4（MS）／hIL12嵌合基因，构建其真核表达质粒，并进行鉴定。方法：以peDNA3．1（＋）-含信号肽的Mtb8．4（pMS）质粒为模板，经聚合酶链反应（PCR）扩增出MS-linker基因，与pCIneo载体进行连接重组，构建成pCI-neo-MS-linker（pMSL）重组质粒，然后以pORF-hIL12质粒为模板，经PCR扩增出hIL12基因，将hIL12基因与pMSL质粒进行连接重组，构建成MS／hIL12嵌合基因真核表达质粒，用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等方法进行鉴定。结果：MS／hIL12嵌合基因重组真核表达质粒经证实构建成功。结论：MS／hIL12嵌合基因重组真核表达质粒的成功构建，为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病MS／hIL12嵌合基因疫苗奠定了基础。     

潜伏活性的人可溶性TNFⅠ型受体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：采用基因工程技术，将转化生长因子B前体相关蛋白（LAP）通过基质金属蛋白酶（MMP）水解部位与人可溶性TNFI型受体（hsTNFRI）连接，构建pcDNA3，1／LAP-MMP-hs TNFRI融合蛋白真核表达载体，获得LAP-MMP-hsTNFRI融合蛋白。方法：将编码MMP水解部位氨基酸的正反义DNA序列退火形成互补双链后定向克隆插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），得到pcDNA3．1／MMP重组体；将TGF-β1的LAP段和hsTNFRI与MMP水解部位连接，获得pcDNA3．1／LAP-MMP-hsTNFRI真核表达载体。测序鉴定后，脂质体介导重组质粒转染COS-7细胞，通过RT-PCR检测融合基因的表达。结果：酶切及测序结果证实pcDNA3．1／LAP-MMP-hsTNFRI重组载体构建成功，转染后RT-PCR结果表明重组质粒在COS-7细胞中得到有效表达。结论：成功构建了融合蛋白真核表达载体pcDNA3，1／LAP-MMP-hsTNFRI，并获得融合基因的瞬时表达，为进一步研究融合蛋白在子宫内膜异位症中的靶向治疗奠定了实验基础。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型gD糖蛋白在真核细胞中的表达

目的：构建真核表达质粒pcDNA3／gD，并在体外COS-7细胞中进行表达。方法：体外PCR扩增出gD糖蛋白基因，克隆入真核表达质粒pcDNA3中。PCR、酶切和测序证实插入的gD基因正确后，转染COS-7细胞，用原位ELISA鉴定表达蛋白。结果：构建了pcDNA3／gD真核表达质粒，经原位ELISA证实，转染，COS-7细胞表达的gD蛋白能和gD单克隆抗体ID3和DL11结合，证明该蛋白具有天然gD蛋白的抗原性。结论：柯建的重组真核表达质粒pcDNA3／gD能够在COS-7细胞中表达。     

结核分支杆菌抗原ESAT-6真核表达质粒在COS-7中的表达

目的 探讨结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT—6基因真核表达重组质粒在真核细胞(COS—7)中的表达。方法 用LipofectAMINE^TM2000介导真核表达重组质粒pcDNA3．1( )—ESAT—6转染真核细胞COS—7，72h后，通过RT—PCR和Western Blotting试验鉴定ESAT—6基因在COS—7中的表达。结果 通过RT—PCR从转染了pcDNA3．1( )—ESAT—6的006—7中检测到目的基因mRNA的转录；Western Blotting试验鉴定在转染pcDNA3．1( )—ESAT—6的COS—7的细胞裂解上清液中有ESAT—6基因的表达蛋白。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ES—AT—6真核表达重组质粒能够在真核细胞COS—7中表达ESAT—6蛋白，为进一步研究其特性及为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下了基础。     

单纯疱疹病毒II型gD糖蛋白在真核细胞中的表达

目的:构建真核表达质粒pcDNA3/gD,并在体外COS-7细胞中进行表达。方法:体外PCR扩增出gD糖蛋白基因,克隆入真核表达质粒pcDNA3中。PCR、酶切和测序证实插入的gD基因正确后,转染COS-7细胞,用原位ELISA鉴定表达蛋白。结果:构建了pcDNA3/gD真核表达质粒,经原位ELISA证实,转染COS-7细胞表达的gD蛋白能和gD单克隆抗体ID3和DL11结合,证明该蛋白具有天然gD蛋白的抗原性。结论:构建的重组真核表达质粒pcDNA3/gD能够在COS-7细胞中表达。     

帕金森病PINK1蛋白真核表达载体pcDNA3．1-myc／PINK1的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建帕金森病PINK1基因真核表达载体pcDNA3．1-mye／PINK1,检测其转染COS-7细胞后的表达。方法用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增PINK1全长cDNA,该基因片段两端设计了EcoR I和BamH I限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将PINK1的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1-myc—his（-）B上,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术将所构建的载体导入COS-7细胞中,体外培养,于转染48h后利用RT—PCR和Western Blotting方法检测目的基因的表达情况。主要观察指标：（1）PINK1基因cDNA扩增产物检测。（2）pcDNA3．1-myc／PINK1重组体酶切鉴定。（3）Western—blotting。结果经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,PCR获得的片段与GenBank中登记的PINK1序列完全相同;pcDNA3．1-myc／CHIP酶切片段的长度与理论大小相符;转染48h后的COS-7细胞可检测到PINK1蛋白的表达。结论PINK1蛋白真核表达载体构建成功,在COS-7细胞中可获得表达。     

HO-1真核表达质粒的构建及在肾小管上皮细胞中的表达

[目的]构建HO-1基因真核表达质粒,转染大鼠肾小管上皮细胞,检测其在细胞中的表达效果.[方法]从大鼠肾组织中提取总RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增大鼠HO-1基因片段,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )中,运用脂质体将重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1转染大鼠肾小管上皮细胞,通过RT-PCR和Western blot分析HO-1基因细胞转染及表达的效果. [结果]成功构建了HO-1基因真核表达重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1.RT-PCR及Western blot分析显示,HO-1基因能转染大鼠肾小管上度细胞并在细胞内有效表达. [结论]HO-1基因真核表达重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1的成功构建及其在肾小管上皮细胞中的有效表达为深入研究其生物学作用奠定了基础.     

潜伏活性的人可溶性TNFⅠ型受体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:采用基因工程技术,将转化生长因子β前体相关蛋白(LAP)通过基质金属蛋白酶(MMP)水解部位与人可溶性TNFⅠ型受体(hsTNFRⅠ)连接,构建pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ融合蛋白真核表达载体,获得LAP-MMP-hsTNFRⅠ融合蛋白。方法:将编码MMP水解部位氨基酸的正反义DNA序列退火形成互补双链后定向克隆插入真核表达载体pcDNA3.1( ),得到pcDNA3.1/MMP重组体;将TGF-β1的LAP段和hsTNFRⅠ与MMP水解部位连接,获得pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ真核表达载体。测序鉴定后,脂质体介导重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR检测融合基因的表达。结果:酶切及测序结果证实pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ重组载体构建成功,转染后RT-PCR结果表明重组质粒在COS-7细胞中得到有效表达。结论:成功构建了融合蛋白真核表达载体pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ,并获得融合基因的瞬时表达,为进一步研究融合蛋白在子宫内膜异位症中的靶向治疗奠定了实验基础。     

家居色彩心灵表情

人们对家居色彩的选择，往往只注意搭配和谐、讲究情调，而很少把家居色彩与身心健康联系起来，其实色彩对身心健康的影响是很大的。家居布置时选择适合的“快乐”色彩，会有助于松弛由工作生活压力而绷紧的神经，让在外奔波、疲惫的心灵得到家居色彩的滋润、调养。[编者按]     

卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒构建与表达

[目的]构建大鼠源卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒,进行表达。[方法]以卡氏肺孢子虫DNA为模板,应用PCR扩增MSG基因片段,连接至pGEM-T Easy载体,再克隆至PCDNA3.1( )载体。构建的重组表达质粒经酶切、PCR鉴定后转染至COS-7细胞,并进行大量增殖。RT-PCR验证转染基因的表达。[结果]重组表达质粒PCDNA3.1( )/MSG经酶切及PCR鉴定结果表明构建成功。RT-PCR结果显示MSG基因片段成功转染至COS-7细胞,并在其中进行基因表达。[结论]成功构建了PCDNA3.1( )/MSG重组质粒,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究打下基础。     

EVALUATION OF BARRIERS TO EXPRESSION

For the child or young person diagnosed as having a 'communication disorder', his linguistic disabilities almost always result in major social and educational difficulties. We are all aware of the seriousness of these difficulties, and have probably found that they present us with problems almost as daunting as those which face the child. Our primary concern is the management of the person with the disorder. Put in very broad terms, our aim is to remediate, facilitate and habilitate an individual's communicative performance, so that he is enabled both to achieve efficient social interaction and to realize his intellectual potential. However, in order to devise an appropriate management policy that is to change and improve communicative performance, one must have detailed knowledge of the present status of this behaviour and information about relevant related abilities. Evaluation is therefore a very necessary prerequisite to management.     

人乳腺珠蛋白基因真核表达载体的构建及其表达

[目的]构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础.[方法]利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序分析后,克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM.将重组载体用脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达.[结果]成功扩增hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达.[结论]hMAM基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据.     

不同运动负荷大鼠主要器官各型NOS表达水平的研究

[目的]检测不同运动负荷时大鼠主要器官如心、脑、股外肌等器官组织NOS各亚型的mRNA表达水平和蛋白表达水平的比较,从基因水平探讨一氧化氮在运动中对机体的影响。[方法]用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测3个器官组织的NOS3种亚型(eNOS、nNOS、iNOS)的mRNA表达。Western blot方法检测各组织的蛋白表达。[结果]RT-PCR检测发现:eNOS、nNOS、iNOS在心肌、脑及股外肌组织中均有mRNA表达。股外肌在中等强度运动时eNOS、nNOS、iNOS的mRNA表达明显高于对照组,股外肌的iNOS的mRNA表达在运动疲劳后则比中等强度运动时明显降低(P﹤0.05)。心肌组织在不同的运动负荷状态下各组织eNOS、nNOS的mRNA表达无明显差异,心肌组织在中等强度和疲劳运动后iNOS的mRNA均明显高于对照组(P﹤0.01)。脑组织在中等强度运动后nNOS、iNOS的mRNA表达明显增强(P﹤0.05),nNOS的mRNA表达在运动疲劳后比中等强度运动时明显降低(P﹤0.05)。Westernblot方法检测:股外肌组织在进行中等强度运动时eNOS nNOS、iNOS蛋白表达均明显强于对照组和运动疲劳组,疲劳组蛋白表达均减弱。脑组织在进行中等强度运动时nNOS、iNOS蛋白表达明显强于对照组,疲劳组nNOS蛋白表达最弱。心肌组织在中等强度和疲劳运动后iNOS蛋白表达增强,疲劳组iNOS蛋白表达最强。[结论]中等强度运动上调eNOS、nNOS、iNOS的mRNA表达和蛋白表达;疲劳运动可导致nNOS、eNOS的mRNA表达和蛋白表达减弱或有减弱趋势。     

HBV/HEV融合基因大肠杆菌表达载体的构建与初步表达

[目的]为构建一个能够表达出乙/戊型肝炎二价疫苗抗原的大肠杆菌高效表达载体。[方法]从乙型肝炎患者血清中提取adr型基因组,采用PCR方法扩增出S基因;从戊型肝炎患者的粪便中提取RNA,采用RT-PCR的方法扩增出ORF2编码区的羧基末端中的414-606aa的基因片段,经过T载体连接;菌落PCR;双酶切;测序鉴定后,将这两部分重组入含有Ω增强子的pTΩ-T7高效的E.coli表达载体中。[结果]构建了pTΩ-T7SE表达载体并且表达出相应的目的蛋白。[结论]该方法为同时预防乙型和戊型肝炎提供了一个较好的途径。     

FHIT在乳腺癌中的表达及意义

目的 探讨乳腺癌中FHIT蛋白的表达状况及其与临床病理特征的关系。方法 采用微波SP免疫组化方法检测FHIT蛋白在62例乳腺癌及正常乳腺组织中的表达。结果 62例乳腺癌组织FHIT表达为58.0％（36／62）、正常乳腺组织为96．8％（60／62），两者比较有显著性差异（p〈0．05）；伴有淋巴结转移的乳腺癌FHIT蛋白的阳性率为36．0％（9／25），无淋巴结转移为73．0％（27／37），两者比较，有显著性差异（P〈0.05）；FHIT蛋白的表达与组织学分级、肿瘤的大小无关（p〉0．05）。结论 FHIT表达可能与乳腺癌的淋巴结转移有关，FHIT表达缺失或降低是判断乳腺癌预后的重要指标。     

YB-1在子宫内膜异位症中的表达

目的探讨YB-1在子宫内膜异位症(EMs)患者血清及子宫内膜组织中的表达及意义,以期将YB-1作为EMs早期诊断和治疗的判定指标。方法采用ELISA法检测EMs组与对照组血清中YB-1的表达水平,采用免疫组化SP法检测两组子宫内膜组织中YB-1的表达情况。结果与对照组(9.64±2.37 ug/L)相比,EMs组患者血清YB-1的平均浓度(14.65±3.91 ug/L)较高,二者相比差异有统计学意义(p<0.05)。免疫组化结果显示YB-1在EMs组患者子宫内膜中主要呈中等强度阳性表达。正常子宫内膜中也可见YB-1的少量弱阳性表达,两组子宫内膜组织中YB-1的阳性表达率相比有明显差异(p<0.05)。结论 YB-1在EMs患者血清及子宫内膜组织中高表达,其不仅可作为EMs细胞内的标志物,也有望成为一个理想的血清学标志物。