红车轴草提取物对小鼠T淋巴细胞体外活化的抑制作用

探讨红车轴草提取物(Trifolium pratense Leguminosae extract,TLE)对小鼠T淋巴细胞的体外活化的影响。无菌条件下制备小鼠淋巴细胞悬液;双色荧光抗体染色结合流式细胞术分别分析TLE对小鼠T淋巴细胞在刀豆蛋白A(ConA)或佛波醇酯(PDB)刺激下的体外分化抗原CD69、CD25、CD71表达的影响。终质量浓度为20、30、40 mg/L的TLE对小鼠T淋巴细胞在ConA或PDB刺激下的体外分化抗原CD69、CD25、CD71表达具有明显的抑制作用(P<0.01)。TLE对ConA或PDB刺激的不同时期的小鼠T淋巴细胞的体外活化具有明显的抑制作用。     

槲皮素对小鼠T细胞体外活化的抑制作用

目的:通过分析槲皮素对淋巴细胞早期活化标记物CD69表达的影响,探讨其对T淋巴细胞体外活化抑制作用的机制。方法:分离小鼠淋巴结细胞,加入多克隆刺激剂及槲皮素共同培养,分别于2、6、24h收获细胞,进行双色免疫荧光标记,以流式细胞仪对T细胞的CD69分子表达情况进行分析并计算抑制率。结果:槲皮素(终浓度10μmol/L)对未受刺激的T细胞CD69表达百分率无明显影响,而经佛波醇酯(PDB)及刀豆蛋白A(ConA)活化同时加入槲皮素的T细胞CD69表达百分率在2h、6h及24h均显著下降(P＜0.01)。槲皮素对PDB的抑制率随作用时间延长而明显下降,对ConA的抑制率平缓而持久。结论:槲皮素对PDB、ConA活化的T淋巴细胞均显示明显的抑制效应,表明该药可能作用于T细胞活化信号传递通路蛋白激酶Cθ或其下游部位,并且,这种抑制效应表现出一定的可逆性。     

喜树碱对小鼠T淋巴细胞活化、增殖以及细胞周期的影响

目的： 研究喜树碱（CPT）对刀豆蛋白A(ConA)介导的小鼠T淋巴细胞体外活化、增殖及细胞周期的影响。方法：以ConA刺激小鼠T淋巴细胞，建立小鼠T淋巴细胞活化、增殖的模型，以不同浓度的CPT作用于该模型，流式细胞术检测T细胞早期活化标志CD69分子的表达；以活体染料羧基荧光素乙酰乙酸（CFDA-SE）染色流式细胞术分析CPT 在Con A刺激下小鼠淋巴细胞的增殖相关指数（PI）；以碘化丙啶染色流式细胞术分析细胞周期的分布情况。 结果： ConA作用6 h后流式细胞术分析显示CD69的表达率为（58.88±0.55）%，不同浓度的CPT组（10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L）CD69的表达率分别为（55.48±0.98）%、（54.67±1.05）%、（50.40±0.82）%、（42.47±1.32）%，均可明显抑制CD69的表达(P<0.01)；ConA刺激48 h后流式细胞术分析显示，不同浓度的 CPT 组（10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L）的增殖指数（PI）明显低于对照组(P<0.05)；细胞周期分析显示刺激48 h后不同浓度的CPT组（10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L）均出现明显的凋亡峰（apoptosis peak，AP），sub-G1期、G₀/G₁期细胞的比率明显高于ConA刺激组(P<0.01)。结论：CPT可明显抑制ConA刺激的T淋巴细胞的活化、增殖，同时使淋巴细胞阻滞于G₀/G₁期。     

下调Notch3对小鼠T淋巴细胞体外活化增殖及NF-κB的影响

研究siRNA下调Notch3对小鼠T淋巴细胞体外增殖的影响,并初步探讨其免疫调节机制。从小鼠脾脏分离制备T淋巴细胞悬液;将化学合成的靶向Notch3基因的siRNA在Lipofectamine 2000介导下转染小鼠淋巴细胞;通过Westernblot检测各组细胞中Notch3蛋白水平的变化;以不同浓度的Notch3 siRNA作用于该小鼠T淋巴细胞模型,流式细胞术检测CD3~+T细胞早期活化标志CD69分子的表达;MTT检测Notch3-siRNA对小鼠淋巴细胞增殖的抑制作用;EMSA检测NF-κB活性。在淋巴细胞体外培养试验中,转染Notch3 siRNA可以明显降低小鼠淋巴细胞内Notch3的表达,下调Notch3可以显著抑制刀豆蛋白A(ConA)诱导的T细胞CD69的表达;同时下调Notch3对小鼠淋巴细胞的增殖有抑制作用;而且发现下调Notch3能明显抑制ConA诱导的NF-κB活化。实验结果提示,下调Notch3信号可通过抑制NF-κB活化对小鼠T淋巴细胞活化与增殖发挥抑制作用。     

通痹灵对多克隆刺激剂作用下小鼠T细胞CD69表达影响的血清免疫药理评价

目的：应用血清免疫药理方法探讨通痹灵对T细胞体外活化的影响，以进一步揭示通痹灵的免疫调节分子机理，为临床用药提供理论依据。方法：分离小鼠淋巴结细胞，分别与CHX、5％CHX血清、CsA、5％CsA血清、5％通痹灵血清预孵后加入多克隆刺激剂继续培养，总计培养24h后收获细胞，进行双色免疫荧光标记，以流式细胞术对T细胞的CD69分子表达情况进行分析。结果：5％通痹灵作用下ConA活化的T细胞CD69表达百分率为（54．67±6．69）％，与相应对照［（64．35 ±10．13）%］比较有显著差异（P<0．05）；药物作用下PDB活化的T细胞CD69表达的百分率为（80．99±6．18）%，与相应对照［（79．68±4．17）％］比较无显著差异（P>0．05）。结论：通痹灵含药血清选择性地抑制ConA刺激的T细胞活化，而对PDB刺激的T细胞活化无影响；推测抑制类风湿关节炎疾病启动与发展中异常的T细胞活化，是通痹灵治疗类风湿关节炎重要机制之一；。     

放线菌酮对小鼠T细胞活化影响的血清免疫药理评价

目的:利用淋巴细胞的早期活化标记物CD69的表达,探讨CHX对T淋巴细胞体外活化的影响。方法:分离小鼠淋巴结细胞,分别与放线菌酮(CHX)、CHX血清预孵1h,加入多克隆刺激剂继续培养,总计培养24h后收获细胞,进行双色免疫荧光标记,以流式细胞术对T细胞的CD69分子表达情况进行分析。结果:在CHX(终浓度10μmol/L)、CHX血清作用下,ConA活化的T细胞CD69表达百分率依次为(12.33±4.75)%、(20.39±6.32)%,与相应对照[分别为(64.67±3.00)%、(64.35±10.13)%]比较均有显著差异(P＜0.01);相应的,药物作用下PDB活化的T细胞CD69表达的百分率依次为(13.07±11.05)%、(6.10±4.91)%,与相应对照[分别为(84.79±6.87)%、(79.68±4.17)%]比较均有显著差异(P＜0.01)。结论:CHX(10μmol/L)、5%的CHX血清对ConA、PDB活化的T淋巴细胞均显示了强烈的抑制效应,证明T细胞活化过程中CD69的表达存在蛋白质的从头合成,对"CD69表达中CD69分子可能储存于细胞浆及其表达的发生并不需要蛋白质的从头合成"这一观点提出质疑。     

茴香霉素在小鼠淋巴细胞增殖和活化中的作用

目的研究茴香霉素在小鼠淋巴细胞增殖和活化中的作用。方法以活体染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色，建立了在多克隆刺激剂刀豆蛋白A（ConA）刺激下评价小鼠淋巴细胞增殖的模型，通过流式细胞术及MTT法分析茴香霉素在不同剂量下对淋巴细胞增殖的作用；采用碘化丙锭染色分析茴香霉素对ConA或佛波醇酯（PDB）加离子霉素（Ion）刺激的小鼠淋巴细胞周期变化的作用；利用荧光标记的单克隆抗体双染技术结合流式细胞仪检测茴香霉素对小鼠CD3^＋淋巴细胞早期及中期活化标志分子CD69和CIY25表达的影响。结果随着茴香霉素浓度从1．0ng／ml逐渐增至25．0ng，ml，ConA对淋巴细胞的促增殖作用逐渐减弱，以10．0ng，ml和25．0ng，ml茴香霉素的抑制作用最为明显，呈剂量依赖关系（r=-0．96，P〈0．01）。进一步发现，1．0—25．0ng/ml茴香霉素能够使ConA或PDB加Ion诱导的淋巴细胞停滞于G0/G1期，阻止其进入S期，且阻止作用随上述浓度的增加而增强，呈明显剂量依赖关系（r=-0．97，P〈0．01和r=-0．98，P〈0．01）。据此选用最佳剂量10．0ng/ml，茴香霉素能够明显抑制淋巴细胞表面分子CD69和CIY25的表达（P均〈0．01）。结论茴香霉素能明显抑制小鼠淋巴细胞的增殖和活化。     

Forskolin对佛波醇酯类刺激的小鼠体外T淋巴细胞行为的影响

目的 分析Forskolin对佛波醇酯多克隆刺激剂(phorbol 12,13-dibutyrate,PDB)联合离子霉素(ionomycin,Ion)刺激的小鼠CD3+T淋巴细胞体外增殖和周期的影响,在此基础上进一步研究Forskolin对单纯PDB刺激的小鼠CD3+T淋巴细胞早期活化标志CD69分子和中期活化标志CD25分子的影响,从而阐明其作用机制.方法 无菌分离小鼠淋巴结并制备单个淋巴细胞悬液,与不同浓度的Forskolin孵育48h后,运用羧基荧光素已酰已酸(CFDA-SE)染色技术和碘化丙锭(PI)染色技术结合流式细胞术、CRLLQuest 和ModFitLT软件,分别榆测Fomkolin对PDB+Ion刺激下小鼠CD3+T淋巴细胞增殖和周期的影响;与不同浓度的Forskolin孵育2 h、10 h,运用流式细胞术结合双色荧光抗体染色技术检测Fomkolin对PDB诱导下的小鼠CD3+T淋巴细胞CD69分子和CD25分子表达的影响.结果 Forskolin(10-7、10-6、10-5 mol·L-1)均能明显抑制PDB+Ion刺激的小鼠CD3+T淋巴细胞的增殖并将细胞阻滞在G0/G1期;同时也能明显抑制单纯PDB刺激下的CD3+T细胞早期和中期活化,且呈明显的量效关系.结论 提示Forskolin在CD3+T细胞活化过程中信号转导的某个环节上有抑制作用,从而通过抑制T淋巴细胞的活化,发挥免疫抑制作用,是一种潜在的免疫抑制剂.     

染料木黄酮对小鼠T细胞体外活化及增殖的影响

目的:研究染料木黄酮(Gen)对T细胞体外活化及增殖的影响,并探讨其机制。方法:利用荧光标记的单克隆抗体染色结合流式细胞术,检测多克隆刺激剂佛波醇酯(PDB)或刀豆蛋白(ConA)刺激下小鼠T细胞表达活化抗原CD69、CD25的百分率;以羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)标记技术结合流式细胞术,分析PDB＋Ion(Ionomycin)或ConA刺激下T细胞增殖相关指数。结果:Gen对ConA刺激组T细胞CD69、CD25表达有明显抑制作用(P＜0.05),且呈剂量依赖关系,而对PDB刺激组T细胞CD69及CD25表达的抑制需要较高浓度(＞50μmol/L);Gen无论对ConA或PDB＋Ion刺激组T细胞增殖均有显著抑制作用(P＜0.01),且均呈剂量依赖关系。结论:Gen可明显抑制多克隆刺激剂诱导的T细胞体外活化及增殖,其作用机制可能是抑制早期活化相关蛋白酪氨酸激酶活性。     

蛋白酶体抑制剂对T淋巴细胞增殖活化的影响

目的：探讨蛋白酶体（proteasome）抑制剂LAC（lactacystin）和β-LAC（β-lactacystin）对外周血T淋巴细胞增殖、活化的影响。方法： 以植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）作为刺激剂，经流式细胞仪检测T淋巴细胞增殖（BrdU掺入率），检测CD3+CD25+/CD3+及CD3+CD69+/CD3+细胞比例, 同时用RT-PCR检测蛋白酶体11S调节蛋白PA28及细胞因子IL-2 mRNA的表达。结果： （1）对预先活化的T淋巴细胞，LAC和β-LAC降低 T淋巴细胞BrdU掺入率（P＜0.05）；（2）LAC和β-LAC不影响T淋巴细胞CD69的表达（各时点，P＞0.05），而显著抑制T细胞表面抗原CD25表达（48 h、72 h，P＜0.05）；（3）与对照组相比，LAC和β-LAC明显下调T淋巴细胞PA28、IL-2 mRNA的表达(48 h、72 h，P＜0.05)。结论： LAC和β-LAC能够显著抑制T淋巴细胞增殖，这一效应与其抑制T淋巴细胞表面早期活化抗原CD25表达,下调PA28、IL-2 mRNA的表达有关。     

通痹灵对于IL-2及其受体α链影响的体内外研究

从体内体外两个方面 ,研究通痹灵对于CIA大鼠关节滑膜原代细胞分泌IL 2 ,以及通痹灵总碱对于IL 2受体α链CD2 5表达的影响。体内实验采用CIA大鼠动物模型。容积法测量足肿胀度 ,原代滑膜细胞培养、放免法检测培养液上清 ,观察通痹灵对滑膜内IL 2的影响 ;体外实验 ,分离大鼠淋巴细胞 ,佛波醇酯 (PDB )或刀豆蛋白 (ConA )体外刺激 ,双色免疫荧光标记 ,流式细胞仪检测 ,观察通痹灵总碱对CD3+CD2 5 +表达的影响。结果是体内实验 ,通痹灵高剂量可明显减轻CIA大鼠的足肿胀度 ,与MTX比较无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,通痹灵高、低剂量可明显抑制CIA大鼠滑膜内IL 2的合成 (P <0 0 1) ;体外实验 ,通痹灵总碱显著抑制ConA刺激下的CD3+CD2 5 +的表达 ,而对PDB加ionomycin没有明显作用。提示通痹灵可以通过抑制IL 2合成及ConA激活的IL 2受体α链CD2 5信号转导通路 ,减轻局部关节的炎症 ,为其用于类风湿性关节炎的治疗提供了实验依据     

连翘提取物对小鼠T淋巴细胞体外活化与增殖的影响

目的:分析连翘(FS)提取物对小鼠淋巴结T细胞的体外活化与增殖的影响,初步探讨其免疫抑制作用机制.方法:无菌分离小鼠淋巴结细胞,加入多克隆刺激剂刀豆蛋白A(ConA)进行刺激,利用荧光标记的单克隆抗体(mAb)染色结合流式细胞术(FCM),检测小鼠T淋巴细胞的表达的活化抗原CD69、CD25、CD71的表达情况;以羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)染色,以FCM分析FS对淋巴细胞体外增殖的影响.结果:终浓度为40、80、160 mg/L的FS均对ConA刺激诱导的T细胞CD69、CD25和CD71的表达有降低作用(P＜0.05).CFDA-SE染色分析显示,上述浓度的FS对ConA诱导的小鼠T淋巴细胞增殖具有抑制作用(P＜0.05).结论:FS对ConA诱导的T细胞早、中、后期活化和体外增殖有抑制作用.     

孕酮对人T淋巴细胞体外活化CD69表达的作用

目的：探讨孕酮（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ,Ｐｒｏｇ）及地塞米松（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ,Ｄｅｘ）对人外周血Ｔ淋巴细胞体外活化ＣＤ６９表达的作用。方法：以女性健康志愿者（１０名）为研究对象,以蛋白激酶Ｃ的刺激剂佛波醇酯（Ｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒ,ＰＤＢ）为Ｔ淋巴细胞的活化剂,采用双荧光染色流式细胞技术。检测ＣＤ３＾＋的Ｔ淋巴细胞表达早期活化表面分子ＣＤ６９的百分率,以观察Ｐｒｏｇ、Ｄｅｘ及Ｐｒｏ０ｇ加上Ｄｅｘ对外周血Ｔ淋巴细胞体外活化的作用。结果：在体外培养条件下,无论单独使用Ｐｒｏｇ还是Ｄｅｘ均地强低剂量ＰＤＢ刺激ＣＤ６９的表达。然而,与单独使用Ｐｒｏｇ或Ｄｅｘ的作用相比。Ｐｒｏｇ加上Ｄｅｘ明显减弱低剂量ＰＤＢ的活化ＣＤ６９的表达。结论：同时使用Ｐｒｏｇ与Ｄｅｘ可明显抑制Ｔ淋巴细胞的体外活化,提示在临床上     

可溶性Jagged 1/Fc嵌合蛋白对小鼠淋巴细胞活化、增殖和周期的影响

目的:研究可溶性Jagged 1/Fc嵌合蛋白在小鼠淋巴细胞活化、增殖和周期中的作用.方法:选择有效剂量为500 μg/L Jagged 1/Fc嵌合蛋白(Jagged 1/Fc),以活体染料/羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色,建立在多克隆刺激剂刀豆蛋白A(ConA)或佛波醇酯(PDB)加离子霉素(Ion)刺激下评价淋巴细胞增殖的模型,通过流式细胞术分析Jagged 1/Fc对淋巴细胞增殖的作用;采用碘化丙锭染色检测Jagged 1/Fc对PDB加Ion刺激的淋巴细胞周期变化的影响;利用荧光标记的mAb双染技术观察Jagged 1/Fc对T细胞早期和中期活化标志CD69和CD25表达的影响.结果:Jagged 1/Fc对ConA刺激或非刺激的CD3 细胞CD69和CD25的表达无明显影响,对ConA或PDB加Ion刺激或非刺激的淋巴细胞的增殖指数也无明显影响,导致非刺激的淋巴细胞sub-G0期细胞百分比增高,S期细胞百分比降低,但并不影响PDB加Ion诱导的淋巴细胞各期的变化.结论:这些结果提示500 μg/L Jagged 1/Fc对小鼠淋巴细胞活化和增殖无明显作用,对PDB加Ion刺激的淋巴细胞周期也无明显影响,但能促进未受刺激的淋巴细胞凋亡,使细胞停滞于GO/G1期,阻止其进入S期.     

芹菜素对小鼠T淋巴细胞体外活化和增殖的抑制作用

研究芹菜素(apigenin,AP)对小鼠T细胞体外活化和增殖的影响,探讨其作用机制,以及将其开发为免疫抑制药物的可能。无菌分离小鼠淋巴结细胞,加入不同浓度(25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L和200μmol/L)的芹菜素预孵育4 h,用多克隆刺激剂刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)诱导T细胞活化和增殖,并用MTT法检测该药物浓度对T细胞的毒性作用。荧光标记抗体双染色结合流式细胞术,检测各浓度AP对ConA诱导的小鼠T细胞表达早期、中期和晚期活化抗原CD69、CD25和CD71的影响;以二乙酰羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯(carboxyfluoresceindiacetate-succinim-idyl ester,CFDA-SE)染色结合流式细胞术,检测各浓度AP对ConA诱导的小鼠T细胞增殖的影响,并应用ModFit软件分析其增殖指数(proliferation index,PI)。结果显示,25~200μmol/L AP对ConA诱导的T细胞CD69、CD25的表达有显著抑制作用(P<0.01),且呈剂量依赖关系;25μmol/L和50μmol/L的AP抑制CD71的表达,但高浓度(大于100μmol/L)才有显著抑制作用(P<0.01)。各浓度AP对ConA诱导的T细胞增殖均有显著抑制作用(P<0.01),且呈剂量依赖关系。表明在一定浓度范围内,AP可显著抑制ConA诱导的小鼠T细胞体外活化及增殖,有望通过进一步研究将其开发成免疫抑制药物。     

通痹合剂乙酸乙酯部位调节活化T细胞双信号分子的机制研究

目的:明确通痹合剂抑制T淋巴细胞活化的活性部位,研究其对T细胞双信号分子的影响,阐明通痹合剂免疫调控作用的机制。方法:分离大鼠淋巴细胞,加入通痹合剂不同提取部位,ConA刺激48 h,流式细胞术(FCM)检测CD3阳性细胞表达CD71;加入不同浓度通痹合剂乙酸乙酯部位和甲氨蝶呤(MTX),ConA刺激48 h,FCM检测T细胞表达TCR、CD28和ICOS。结果:ConA刺激后CD3阳性细胞表达CD71显著上调至69.7%,通痹合剂乙酸乙酯部位(TBHJ)可抑制CD3+CD71+表达(32.5%);ConA刺激T细胞表达TCR、CD28和ICOS明显升高,与阴性对照组(Control)有非常显著性差异(P<0.001),TBHJ可明显抑制T细胞表达TCR、CD28和ICOS,尤其抑制ICOS作用较强,呈浓度依赖效应;MTX可明显抑制T细胞表达TCR、CD71。结论:TBHJ可明显抑制T淋巴细胞活化,其对T细胞活化的双信号分子途径均有下调作用,尤其以抑制ICOS明显,提示TBHJ可通过阻断CD28-ICOS第二信号途径,诱导免疫耐受。本研究为通痹合剂治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病提供了实验依据。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA对小鼠淋巴细胞增殖和凋亡的影响

研究辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对小鼠淋巴细胞活化、增殖和凋亡的影响,并对其免疫调控机制进行初步探讨。以MTS检测淋巴细胞的增殖情况;以双色荧光抗体染色技术结合流式细胞术检测SAHA对T淋巴细胞早期活化抗原CD69表达的影响;采用碘化丙锭(PI)染色检测SAHA对淋巴细胞周期的影响;以Annexin V-PE染色分析细胞凋亡;应用免疫印迹检测SAHA对Cleaved caspase-3表达的影响。结果显示,SAHA对Con A刺激的淋巴细胞增殖具有抑制作用,其IC50为0.30±0.06μmol/L;SAHA对淋巴细胞的早期活化抗原CD69的表达具有明显的抑制作用(P<0.05);PI染色、Annexin V-PE染色和免疫印迹结果均显示,SAHA对小鼠淋巴细胞的凋亡具有促进作用,且呈剂量依赖性。研究表明,SAHA可能通过抑制小鼠淋巴细胞的活化、增殖以及促进其凋亡而发挥免疫调控功能。