HIV-1 Tat真核表达载体的构建及在内皮细胞的表达

目的:构建HIV-1 Tat真核表达质粒,为研究Tat在HIV-1致病机制中的作用奠定实验基础。方法:以pCV1(tat and rev)质粒为模板,用PCR方法扩增HIV-1 Tat基因,克隆至p cDNA3.1( )表达载体,酶切及测序鉴定重组体。重组质粒转染ECV304细胞,用RT-PCR、转染HIV-1 LTR荧光报告基因的方法检测tat基因的表达及活性。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建pcDNA3.1( )-Tat重组质粒。重组体转染ECV304细胞,建立稳定表达细胞株,应用RT-PCR可检测到Tat基因mRNA的表达;荧光仪检测Tat蛋白可明显促进荧光素酶在ECV304细胞内的表达。结论:成功构建HIV-1Tat真核表达载体,并建立了HIV-1 Tat内皮细胞稳定表达细胞株。     

含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体构建与表达Tat蛋白功能检测

目的：构建含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体及评价表达Tat蛋白的功能。方法：使用HindⅢ将HIV-1 Tat101蛋白编码基因从pEV质粒中切出，插入到表达质粒LZRSpBMN—Z中，构建成重组反转录病毒表达质粒IZRS-Tratl01。采用磷酸钙转染法将重组质粒LZRS-Tat101转染进含反转录病毒erw、gal和pol编码基因的包装细胞phoenix(φNX)中，嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。免疫组化(IHC)染色检查Tat在临时转染和稳定转染删x细胞中的表达水平。收集临时转染和稳定转染包装细胞分泌的病毒上清，并分别感染293细胞，Western blot检测Tat在293中表达。与此同时，收集感染293细胞培养上清，加入到HL3T1细胞(HELa—HIV-1-LTR／CAT报告基因)中，共培养72h后收集细胞，提取蛋白作CAT活性检测。结果：①含Tat101基因重组反转录病毒表达质粒转染包装细胞后，Tat在临时转染φNX中表达水平显高于在稳定转染中的水平；②临时转染病感染293细胞，Tat在感染细胞中得到了表达，且分泌至上清中的Tat蛋白能够激活靶细胞HL3T1中HIV-1的LTR启动子，使得其下游的CAT基因得到表达。结论：重组IZRS-Tat101反转录病毒能够在其感染靶细胞中表达Tat蛋白，且表达蛋白具有转录激活功能。     

HIV-1 HXB2株Tat蛋白在大肠杆菌中的分段表达及免疫原性分析

目的研究对人类免疫缺陷病毒Ⅰ型HXB2株调控蛋白Tat原核表达产生影响的区域和Tat蛋白重要的抗原表位。方法用PCR方法获得Tat(1-48aa)、Tat(22-72aa)和Tat(38-101aa)DNA片段,构建其原核表达质粒pET32a-Tat(1-48aa)、pET32a-Tat(22-72aa)和pET32a-Tat(38-101aa),并转入E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达及纯化,SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物。采用间接ELISA方法用兔抗pET32a-Tat抗血清对三种肽段进行免疫原性分析。结果成功构建了pET32a-Tat(1-48aa)、pET32a-Tat(22-72aa)和pET32a-Tat(38-101aa)质粒,分别表达出相对分子质量(Mr)为23×103、23×103和25×103的融合肽段,其浓度分别为4.26、3.35和5.11mg/ml。间接ELISA结果表明三种融合肽段与兔抗pET32a-Tat抗血清均呈特异性结合反应,其抗体滴度分别为1:128000、1:32000、1:64000,而抗血清与pET32a蛋白仅有较弱结合。结论半胱氨酸富集区(22-37位氨基酸)对Tat蛋白的原核表达有较显著影响;Tat蛋白的N端区、碱性区和C端区是其重要的抗原表位,其中N端区的免疫原性最强。     

艾滋病痴呆综合症患者体内HIV-1 tat基因的克隆及原核表达

目的     探讨艾滋病痴呆综合症（AIDS dementia complex,ADC）患者体内外周和中枢不同组织部位的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）反式激活因子（tat）第一外显子基因序列的变异并对其进行表达,用于研究HIV-1 Tat变异对其神经毒性的影响。方法     从ADC病例尸检标本的脾脏（spleen,SPL）、脑膜（meninges, MG）和基底核（basal ganglia,BG）3个部位的组织中提取基因组DNA,用PCR方法扩增出tat第一外显子基因,并将其插入到pGEM-T克隆载体中,测序证实为HIV-1 tat基因,BioEdit软件对测序结果进行比对。将克隆载体双酶切,回收目的基因,并将其连接到pGEX-KG表达载体中,将重组表达质粒pGEX-KG-tat转化BL21大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,表达产物用SDS PAGE和Western blot进行检验和鉴定。结果    成功克隆了HIV-1 tat第一外显子基因,序列比对发现外周和中枢部位的Tat氨基酸序列不同;构建了pGEX KG-tat重组表达载体,并在原核细胞中高效表达了谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合Tat蛋白,SDS PAGE和Western blot分析表明,所表达的蛋白为Tat蛋白。结论     ADC患者外周和中枢不同组织部位的HIV-1 tat第一外显子基因所编码的Tat蛋白氨基酸序列存在变异,在原核细胞中对其进行了高效表达,为Tat蛋白的神经毒性研究奠定了基础。     

HIV-1Tat蛋白改变血脑屏障结构和功能的研究进展

HIV-Tat蛋白是人类免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)基因编码的一种被称为反式转录激活因子,是HIV转录和复制所必须的一个很重要的调控蛋白.艾滋病痴呆以及艾滋病相关性脑炎的患者其血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)都受到不同程度的损伤,其中HIV-1 Tat蛋白起到了非常重要的作用.然而HIV-Tat蛋白改变血脑屏障结构和功能并不清楚,本综述主要讨论HIV-1 Tat蛋白对血脑屏障结构和功能的影响.     

HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体的构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的 构建HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体,并在大肠杆菌E.coli B121(DE3)中进行高效表达和纯化.方法 应用PCR拼接的方法将首轮合成Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸,22～37位氨基酸)移位至缺失半胱氨酸富集区的Tat(AC)的N末端,获得其突变体序列(Tat(CN)DNA),构建其原核表达质粒pET32a-Tat(CN),并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化,经SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物,纯化后的产物用间接ELISA进行鉴定.结果 构建了pET32a-Tat(cn)突变体,pET32a-Tat(CN)融合蛋白在大肠杆菌中表达水平为5.17 mg/nd,相对分子质量为31 ku.间接的ELISA结果表明,pET32a-Tat(CN)能与Tat兔抗血清呈特异反应.结论 成功构建了HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区移位至TatN端的突变体,并能在大肠杆菌中高效表达,其纯化的蛋白pET32a-Tat(CN)很好地保留了与HIV-1 Tat兔抗血清的免疫反应性,为HIV-1 Tat的疫苗基础研究提供了一有价值的研究结论.     

HIV-1 Tat蛋白改变血脑屏障结构和功能的研究进展

［摘要］HIV-Tat 蛋白是人类免疫缺陷病毒-1 型（HIV-1）基因编码的一种被称为反式转录激活因子,是HIV 转录和复制所必须的一个很重要的调控蛋白．艾滋病痴呆以及艾滋病相关性脑炎的患者其血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）都受到不同程度的损伤,其中HIV-1 Tat蛋白起到了非常重要的作用．然而HIV-Tat 蛋白改变血脑屏障结构和功能并不清楚,本综述主要讨论HIV-1 Tat蛋白对血脑屏障结构和功能的影响     

Tat和TAR对人免疫缺陷病毒HIV-1基因表达的调控研究

目的为了寻找能够阻断HIV-1复制的方法,探索控制HIV-1蔓延的第二代基因治疗的新途径。方法采用自身引物一模板PCR得到了含有TAR核心序列( 11到 47)的多聚TAR-Core DNA同向串联体。结果所有这些抗性基因策略均能对病毒的复制产生较好的抑制作用。结论 TAT蛋白序列中氨基酸的替换使活性改变,与其三维结构的变化间有一定的相关性。     

HIV-1基质蛋白P17的原核表达与纯化

目的 :HIV- 1p17基因在大肠杆菌中高效表达并纯化目的蛋白。方法 :1PCR法扩增的 HIV-1p17基因片段克隆至 p ET2 8c质粒 ;2重组质粒分别在大肠杆菌 BL 2 1、BL 2 1(DE3)、BL 2 1(DE3) plys S及 HMS174 (DE3)中表达 ;3用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化目的蛋白 ;4用酶联免疫法和免疫印迹法检测纯化蛋白的特异性。结果 :重组质粒在 BL (DE3)中表达量最高 ,目的蛋白表达量占全菌体裂解物的32 % ,纯化后其纯度达 95% ,纯化蛋白可与 p17Mc Ab和 HIV- 1阳性血清发生特异反应。结论 :带有HIV- 1p17片段的重组质粒 p ET2 8c在大肠杆菌 BL2 1(DE3)中获得高效表达 ,蛋白表达量可满足其免疫、生物活性的进一步研究 ;用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化蛋白 ,方法简便 ,蛋白丢失少 ,纯度高 ;纯化的重组蛋白 HIV- 1p17可用来临床早期诊断 HIV- 1感染者 ,同时可预测患者的临床进程。     

Construction and identification of recombinant lentiviral vector containing HIV-1 Tat gene and its expression in 293T cells

Objective： To construct a lentiviral vector expressing HIV-1 Tat and identify its expression in 293T cells. Methods： The gene fragment of HIV-1 Tatlol was subcloned to lentiviral transfer vector pHAGE-CMV-MCS- IZsGreen, which was named pHAGE-Tat. Then the constructed pHAGE-Tat was used to co-transfect the packing 293T cells, together with the packaging plasmids pMD2.G and psPAX2. The packaged viral particles designated LV-Tat were used to infect the 293T cells and the viral titer was calculated. The expression of HIV-1 Tat in 293T cells was confirmed using RT-PCR and western blot. Results： The recombinant lentiviral vector was successfully constructed and could express HIV-1 Tat in 293T cells. The virus titer was 5.73×10^6 ifu/ml. Conclusion： The successfully constructed recombinant lentiviral vector makes a strong foundation for further exploring the possible role of HIV-1 Tat in the development of prostate cancer.     

HIV-1 Ta填核表达载体的构建及在Huh-7细胞中表达

目的构建1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)反式激活因子(Tat)基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pCDNA3.1( ),构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入人体肝癌细胞系Huh-7细胞。RT-PCR检测其基因转录情况,Westernblot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pCDNA3.1-tat,RT-PCR和Westernblot方法证实该质粒能在Huh-7真核细胞中有效表达HIV-1Tat目的蛋白质。结论成功构建了HIV-1Tat基因的真核表达质粒载体,并在Huh-7细胞中表达,为在Huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。     

HIV-Ⅰ CN54株gagprotease基因嵌合脊髓灰质炎病毒cDNA质粒的构建和表达研究

目的 构建HIV-1 CN54株gagprotease基因嵌合脊髓灰质炎病毒cDNA的表达质粒，并鉴定、检测基因及其表达。方法 用PCR技术获得人免疫缺陷病毒CN54株的gagprotease基因，并使其两端带上合适的酶切住点，将其定向插入到包含脊髓灰质炎病毒cDNA的表达质粒pSVA14中，替代其部分结构基因，构建HIV基因嵌合缺陷性脊髓灰质炎病毒基因组的表达质粒。经筛选、鉴定后用脂质体转染技术将新构建的质粒转入Hela细胞内，用Western Blot方法检测目的基因在Hela细胞内的表达。结果 PCR技术扩增所得的人免疫缺陷病毒CN54株gagprotease基因经琼脂糖凝胶电泳、DNA测序证实成功获得，未引入突变碱基，筛选、鉴定证明gagprotease基因被正确定向插入到脊髓灰质炎病毒的cDNA序列之中，Western Blot检测到gagpro-tcase基因正确表达了相关蛋白。结论 成功构建了表达人免疫缺陷病毒CN54株gagprotease基因的缺陷性脊髓灰质炎病毒基因组嵌合质粒，为利用脊髓灰质炎病毒作人免疫缺陷病毒基因的表达载体奠定了基础，此研究对开发以脊髓灰质炎病毒为艾滋病的疫苗载体有重要意义。     

密码子优化的HPV16 L2E7基因在大肠杆菌中高效表达

目的提高HPV16L2E7融合基因在大肠杆菌中的表达水平,为中试研究提供高表达量的疫苗候选株。方法根据大肠杆菌偏爱密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对L2E7全基因进行密码子优化,将分段合成的基因分部插入到pET9a中,经酶切和测序鉴定无误后转化BL21(DE3 )中,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。表达的融合蛋白进行SDS-PAGE胶和Western blot鉴定。同时还进行梯度实验分别对诱导的温度、时间和IPTG诱导时菌体浓度进行优化,并对蛋白的纯化方案进行摸索。结果优化后的pET9aSL2E7AB在大肠杆菌中得到高效表达,诱导条件优化后的目的蛋白占全菌60%左右。结论成功得到了具有较高表达水平的疫苗候选株。     

HIV-1 Tat通过抑制启动子活性调控MCAK基因表达

目的验证HIV-1Tat对有丝分裂着丝点关联驱动蛋白MCAK基因表达的调节作用并探讨其分子机制。方法利用表达Tat的人横纹肌肉瘤细胞(TE671)模型及原核表达纯化的Tat蛋白,通过Northern印迹法和蛋白印迹技术验证HIV-1 Tat对MCAK基因表达的抑制作用。PCR扩增MCAK基因各启动区片段,与荧光素酶报告质粒相连接,并转染到TE671细胞,通过荧光素活性分析法检测DNA片段启动活性,确定MCAK基因的活性启动区域。进一步通过HIV-1Tat与MCAK启动区作用,分析Tat对启动子活性的调控作用。结果Northern印迹和蛋白印迹结果证实Tat蛋白对MCAK转录、翻译水平的表达都有强烈的抑制作用;荧光报告质粒检测系统分析表明MCAK的核心启动区存在于-399～+1bp区域,且其启动子活性在Tat存在的情况下受到明显的抑制。结论HIV-1 Tat能作用于MCAK基因启动区-399～+1bp区域,导致MCAK启动子活性降低,从而抑制MCAK基因的表达。     

抗菌肽GLL-37在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化

目的:研究抗菌肽GLL-37的原核表达及产物纯化。方法:将人工合成的编码2个串联GLL-37的基因片段克隆入原核表达载体pGEX-2T中,构建表达载体pGEX-2T/GLL-37,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-GLL-37-M-GLL-37,产物经Glutathione Sepharose4B亲和层析分离纯化后,再经CNBr切割,阳离子交换层析,得到纯化的重组GLL-37。并采用微量稀释法测定重组GLL-37对6种革兰氏阴性和阳性菌的最低抑菌浓度。结果:在大肠杆菌中成功表达和纯化了具有完全抗菌活性的重组GLL-37,其产量为8.5mg/L的培养物。结论:通过原核表达可高效、低成本地获得具有生物活性的重组GLL-37。