沉默CDC25A基因后肝癌裸鼠移植瘤组织中差异表达基因的筛选

目的：探讨应用基因芯片技术筛选出可能受细胞分裂周期因子25A（cell division cycle 25A,CDC25A）调控的基因, 阐 明并验证CDC25A对肝癌相关基因的表达具有调控作用。方法：本课题组前期通过siRNA干扰技术沉默人肝癌HepG2细胞中 CDC25A的表达并成功构建了肝癌裸鼠移植瘤模型。基于上述研究成果,在本研究中应用Affymetrix基因表达谱芯片技术进一 步筛选沉默CDC25A后肝癌移植瘤组织中的差异表达基因,并进行GO及KEGG分析,应用qPCR对部分差异表达基因进行验 证。结果：通过芯片技术筛选出沉默CDC25A基因的肝癌移植组织中的差异表达基因188个,其中上调基因78个、下调基因110 个。这些差异表达基因主要涉及细胞增殖、细胞凋亡、蛋白复合物结合、细胞外间隙等方面,参与黏着斑、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）受体相互作用等通路的改变。qPCR对部分差异表达基因验证的结果显示,HIPK2 mRNA表达上调,微纤丝关联 蛋白5（microfibrillar-associated protein 5,MFAP5）和细胞周期蛋白D1（cyclin D1,CCND1）mRNA表达下调,与芯片检测结果一 致。结论：应用人基因表达谱芯片技术成功筛选出沉默CDC25A后肝癌裸鼠移植瘤组织中的差异表达基因,为探究CDC25A影 响肝癌细胞生长提供了支持线索。     

肝癌的肝移植治疗

自从Starzl 1963年施行第一例临床肝移植以来,原发性肝癌一直是肝移植的适应证。随着近年来外科肝移植技术的发展,术前影像学定位和手术前后辅助化疗及新辅助化疗方案的实施,肝癌肝移植的预后大为改观。现就肝癌肝移植的适应证及手术前后的治疗作以下介绍: 1 肝癌肝移植的现状及适应证 肝癌的肝移植治疗一直存有争议。Ringe等一组肝癌肝移植病例报告显示,只有20％病人能获得较长时间的生存,大部分病人2年内死于肝癌的复发和转移,并证实免疫抑制剂的使用可加速肿瘤的生长。我国于70～80年代共施行肝移植57例,其中各种肝癌占52例,3个月生存率仅为28.5％,最长者生存264天,也死于肿瘤复发。但临床上发现一些“意外肝癌”(移植前未发现肝癌而在移植中发现有早期肝癌)病人行肝移植后3年生存率可达70％,接近于非肝癌的肝移植患者。lwatsuki等报告一组“意外肝癌”,移植术后无一例肿瘤复发,术后生存4个月到13年不等。这种“意外肝癌”的良好预后提示肝癌仍然是肝移植的适应证。随着新的影像学方法如螺旋CT、血管造影CT及碘油造影CT出现,使肝癌的术前定位及对是否有转移的判断更为准确。术前对肝癌的分期进行正确评价,选择小肝癌病例进行肝移植,使预后明显改善。Bismuth等对一     

结直肠癌肝转移特定基因miRNA芯片甄别

目的:筛选结直肠癌(colorectal cancer,CRC)肝转移miRNA对应的特定基因。方法:收集10例CRC患者肿瘤组织标本,其中同时伴肝转移者5例,无远处器官转移5例。应用miRNA芯片方法对两组样本的miRNA表达差异情况进行研究,并通过实时定量RT-PCR对miRNA的芯片表达差异进行验证,再利用软件预测靶基因。结果:总RNA提取的质量分析显示,每份样品总RNA的A260/A280为2.11～2.15。电泳结果显示,每份样品的总RNA均有清晰的28S和18S条带,RNA完好无降解,质量符合miRNA芯片的质量要求。肝转移组较非转移组筛选出6种CRC表达失调的miRNA,其中上调的为miR-224、miR-1236和miR-622,下调的为miR-155、miR-342-5p和miR-363,miR-224的差异信号值最高(>500)。芯片实验显示,hsa-miR-224在肝转移组呈现显著性上调,P=0.038 2;而hsa-miR-155在肝转移组却呈现显著性下调,P=0.043 2。miR-224的表达倍数在肝转移CRC组织中较非转移组表达上调(Fold change=2.47),P=0.016 6。结论:可调控CRC肝转移的特定基因miR-224的筛选,可作为早期诊断治疗的新手段。     

棘霉素对肝癌SMMC7721细胞凋亡相关基因影响的研究

目的:探讨棘霉素诱导肝癌SMMC7721细胞的凋亡作用及对转录因子Twist、p53、Survivin和hTERT(人端粒酶)基因的影响.方法:采用MTT法测定棘霉素对肝癌细胞的生长抑制率;半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测与肝癌的发生和转移密切相关的转录因子Twist,与细胞增殖和凋亡联系紧密的p53、Survivin和hTERT的mRNA表达水平的改变;利用Western blot方法分析棘霉素治疗后上述基因的蛋白表达情况.结果:体外实验证实,棘霉素浓度＞10.0 ng/mL各组对细胞的生长抑制均显著增加,P<0.05,随棘霉素药物浓度增加,细胞抑制率明显增大.棘霉素抑制肝癌细胞株SMMC7721的作用呈剂量-时间依赖性. RT-PCR 方法证实,随着棘霉素剂量的增加,肝癌SMMC7721细胞株中Twist、Survivin和hTERT mRNA表达水平逐渐下调,P<0.01,p53 mRNA表达水平微弱上调,P<0.05.Western blot检测显示,Twist、 Survivin和hTERT蛋白的表达量呈递减趋势,P<0.01,p53蛋白的表达微弱上调,P<0.01.结论:随着棘霉素剂量的增加,细胞凋亡率显著增加.棘霉素能够抑制与肝癌生长密切相关基因的Twist、Survivin和hTERT mRNA表达,促进p53 mRNA表达上调,相应蛋白的表达呈下调和上调.棘霉素可能通过抑制肝癌细胞的生长、转移和促进肝癌细胞的凋亡起到抑制肿瘤生长的作用.     

不同转移潜能骨肉瘤细胞差异表达基因的筛查

目的: 研究不同转移潜能骨肉瘤细胞差异表达的基因,筛选骨肉瘤转移相关的基因。方法: 分别提取低转移骨肉瘤细胞株M6和高转移骨肉瘤细胞株M8细胞总RNA,采用cDNA基因芯片筛查M6和M8细胞差异表达的基因,杂交信号用Generation Ⅲ array扫描,结果用Imagequant 5.0软件分析。选择基因芯片筛选到的典型差异表达基因用实时定量PCR进行验证。结果: M6和M8骨肉瘤细胞株差异表达的基因共有330个,其中与低转移组（M6）相比,在高转移组（M8）中显著性上调表达的基因有178个,下调表达的基因有152个。其中发生非常显著性上调表达的基因43个,发生非常显著性下调表达的基因49个。差异基因主要包括与细胞增殖相关的基因,提示与M8细胞增殖受抑相关;其次是与基因表达调控及信号转导相关的基因,提示这些基因和肿瘤转移有关联性。结论: 基因芯片方法对于筛选骨肉瘤转移相关基因有独特的优势,MG63细胞M8亚株中筛查到显著性上调的基因43个,显著性下调的基因49个,与骨肉瘤的转移有关。     

应用基因芯片技术筛选肝癌相关基因

目的:本研究利用基因芯片技术筛查肝癌组织中特异表达的基因,为深入研究肝癌的发生、发展提供线索,为肝癌的药物治疗提供指导.方法:选取5例人肝癌组织标本和3例人正常肝组织标本,Trizol法提取组织总RNA,RNeasy Mini kit进行纯化.使用One-Cycle cDNA Synthesis Kjt反转录成cDNA,Sample Cleanup Module kit纯化双链cDNA,VT Labeling Kit体外转录合成并纯化生物素标记cRNA,与人基因组U133+2.0基因芯片杂交.Scanner 3000 7G扫描仪获取基因表达的荧光信号强度值,用预先选定的内参照基因进行均衡和修正,Microarray SuiteVersion5.0软件分析杂交信号的强度和比值,应用SAM统计分析结果,按照常规标准q-value(%)＜5%,fold change≥2或≤0.5筛选出表达差异明显的基因.结果:与正常肝组织相比,肝癌组织存在967个共同差异表达的基因,包括562个上调基因,405个下调基因,其中有58个基因变化倍数大于2倍以上,包括35个上调基因和23个下调基因,与肝癌的发病与进展具有一定相关性,其中包括凋亡相关基因、细胞周期调节相关基因、信号传导相关基因、转录调控相关基因等发生异常改变.结论:基因表达谱芯片可以快速筛选与肝癌发生和进展相关的多个环节上起重要作用的基因,对于肝癌的基础研究和药物治疗具有指导作用,为肝癌的临床诊断、预防、易感性预测和治疗提供分子标记和靶基因,为建立个体化治疗方案和预后评估提供帮助.     

突变型p53基因与肝细胞癌组织学分级、转移、肿块大小和包膜形成的相关性研究

目的:探讨突变型p53基因与肝细胞癌组织学分级、转移、肿块大小和包膜形成的相关性.方法:随机选择41例肝细胞肝癌患者的癌和癌旁肝组织标本,SP法检测其p53蛋白表达,分析突变型p53基因与肝细胞癌组织学分级、转移、肿块大小和包膜形成的相关性. 结果:p53在癌和癌旁肝组织中阳性表达率分别为43.9%和6.67%, 两者比较,差异显著(P＜0.01);p53蛋白阳性表达率,Ⅲ～Ⅳ级肝癌明显高于Ⅰ～Ⅱ级肝癌,发生转移(血道或淋巴道转移)肝癌明显高于未发生转移(血道或淋巴道转移)肝癌,两者之间比较,差异有显著性意义(P＜0.05);但p53蛋白阳性表达率与肝癌组织大小和其是否有包膜无关(P＞0.05).结论: 突变型p53基因与肝细胞癌组织学分级、转移密切相关, 但与肝癌组织大小和包膜形成无关.     

肝癌再次切除术后肝移植的临床应用价值

目的:探讨肝移植在肝癌再次肝切除术后患者治疗中的合理适应证及其临床价值.方法:回顾性分析10例肝癌再次肝切除术后复发或肝功能衰竭患者肝移植的临床资料和随访结果.结果:肝癌再次肝切除术后患者肝移植围手术期(术后2个月内)死亡率为2/10,手术相关死亡率为1/10.术后并发症发生率为3/10.随访过程中肿瘤复发率为5/8(肺转移2例,肝内转移2例,骨转移1例),肝移植术后肿瘤中位复发时间17个月(3～25个月).4例患者分别于肝移植术后12、37、42和48个月死于肿瘤复发、进展,肿瘤复发诊断后中位生存时间25个月(9～45个月).目前生存4例,分别无瘤生存12、50、50和62个月.首次肝切除到肝移植的中位生存时间为93个月(41.5～147个月);从再次肝切除到肝移植的中位生存时间为60个月(10.5～105个月).结论:肝癌再次切除术后患者肝移植治疗是可行的,但要严格选择恰当的适应证,Milan标准是目前肝癌再次肝切除术后肝移植的理想标准.肝切除和肝移植相结合可使肝癌患者获得长期生存的机会.     

基质金属蛋白酶相关基因表达上调与原发性肝癌的发生发展的关系

目的 应用寡核苷酸芯片技术高通量分析原发性肝癌与癌旁组织以及正常肝组织的基因表达差异,探索与疾病进展相关的靶基因.方法 抽提原发性肝癌患者的癌组织、癌旁组织以及正常肝组织的总RNA,应用芯片实验室(Lab-on-chip)进行RNA质量检测;总RNA纯化后进行逆转录cRNA合成、荧光标记和纯化,将癌组织和正常肝组织、癌组织和癌旁肝组织的cRNA探针分别与Agilent寡核苷酸芯片(21,074探针)进行杂交,洗涤后应用Agilent Scanner获取图像,Feature Extraction软件进行定量分析处理.挑选明显差异表达的基因进行SYBR GreenI染料掺入的荧光realtime RT-PCR验证.结果 (1)癌组织、癌旁肝组织以及正常肝组织的总RNA质量高,反转录cRNA及荧光标记质量好;(2)2倍差异表达基因中,上调基因共420个,下调基因共552个,其中包括上调的基质金属蛋白酶相关基因(MMP)-9、-11和-12;(3)挑选5倍上调基因MMP-12为代表,以β-actin为内对照的real time RT-PCR结果提示,MMP-12在癌、癌旁和正常肝组织中的2-△ct值分别为0.0030、0.0028和0.0020.结论 (1)应用Agilent寡核苷酸芯片高通量、高效率地分析原发性肝癌发生发展过程中的基因表达差异,可以筛选新的治疗靶点;(2)原发性肝癌的发生发展涉及多基因、多步骤,是一个复杂的过程;(3)MMP相关基因表达上调可能涉及原发性肝癌的发生发展过程,确切机制有待深入研究.     

不同转移潜能小鼠肝癌细胞系趋化因子与受体基因表达谱的分析

目的:寻找与小鼠肝癌淋巴道器官特异性转移相关的趋化因子及其受体.方法:应用趋化因子及其受体分类基因芯片技术,分析高、低淋巴道转移潜能小鼠肝癌细胞株HCa-F、HCa-P不同的趋化因子及其受体的表达差异.结果:HCa-F和HCa-P细胞有不同的趋化因子及受体的表达谱.在基因芯片的128个候选基因中,HCa-F与HCa-P相比有19个基因上调、下调>2倍.上调的19个基因中包括G蛋白偶联受体2和CXCL1/2、HIF1和NF-kB等;下调的有19个,包括CC和CCR家族成员和CXC家族成员.结论:不同的趋化因子及其受体表达谱可能与肿瘤的淋巴管转移潜能相关.应用分类基因芯片筛选出的基因为肿瘤转移预测及干预措施可能有重要的意义.     

肝移植治疗乙型肝炎、肝硬化并发肝癌的分析

 目的　研究乙型肝炎、肝硬化并发肝癌行肝移植手术时机的选择及术后免疫抑制剂的应用。方法　对9例患者施行肝移植,其中4例为经典式原位肝移植,5例为背驮式原位肝移植,术后应用免疫抑制剂甲基泼尼松龙、他克莫司及吗替麦考酚酯（商品名：骁悉）,同时采用抗乙型肝炎免疫球蛋白及拉米夫定预防乙肝病毒复发。结果　9例肝癌肝移植手术均获成功,2例术前情况差的患者术后死于多器官衰竭,1例死于急性排斥反应,余6例全部生存至今。结论　乙型肝炎、肝硬化并发肝癌最有效的治疗方法之一是肝移植,手术在肝癌转移前进行疗效较好,术后应用免疫抑制剂甲基泼尼松龙、他克莫司及吗替麦考酚酯可以有效控制免疫排斥的发生。     

肝移植治疗乙型肝炎、肝硬化并发肝癌的分析

目的 研究乙型肝炎、肝硬化并发肝癌行肝移植手术时机的选择及术后免疫抑制剂的应用.方法 对9例患者施行肝移植,其中4例为经典式原位肝移植,5例为背驮式原位肝移植,术后应用免疫抑制剂甲基泼尼松龙、他克莫司及吗替麦考酚酯(商品名:骁悉),同时采用抗乙型肝炎免疫球蛋白及拉米夫定预防乙肝病毒复发.结果 9例肝癌肝移植手术均获成功,2例术前情况差的患者术后死于多器官衰竭,1例死于急性排斥反应,余6例全部生存至今.结论 乙型肝炎、肝硬化并发肝癌最有效的治疗方法之一是肝移植,手术在肝癌转移前进行疗效较好,术后应用免疫抑制剂甲基泼尼松龙、他克莫司及吗替麦考酚酯可以有效控制免疫排斥的发生.     

肝移植治疗乙型肝炎、肝硬化并发肝癌的分析

目的 研究乙型肝炎、肝硬化并发肝癌行肝移植手术时机的选择及术后免疫抑制剂的应用.方法 对9例患者施行肝移植,其中4例为经典式原位肝移植,5例为背驮式原位肝移植,术后应用免疫抑制剂甲基泼尼松龙、他克莫司及吗替麦考酚酯(商品名:骁悉),同时采用抗乙型肝炎免疫球蛋白及拉米夫定预防乙肝病毒复发.结果 9例肝癌肝移植手术均获成功,2例术前情况差的患者术后死于多器官衰竭,1例死于急性排斥反应,余6例全部生存至今.结论 乙型肝炎、肝硬化并发肝癌最有效的治疗方法之一是肝移植,手术在肝癌转移前进行疗效较好,术后应用免疫抑制剂甲基泼尼松龙、他克莫司及吗替麦考酚酯可以有效控制免疫排斥的发生.     

肝移植在结直肠癌肝转移中的价值

结直肠癌是全球范围内发病率和死亡率均高的恶性肿瘤之一,早期容易发生转移,而肝脏恰是结直肠癌远处转移的最常见器官.随着肝移植技术的发展与进步,不可切除性结直肠癌肝转移患者获得了长期生存的新机遇.近年来,挪威奥斯陆大学医院在肝移植治疗不可切除性结直肠癌肝转移的领域中取得了一系列巨大突破,引起了世界各地学者的广泛关注.随后,...     

Heme synthesis in normal mouse liver and mouse liver tumors

Hepatic cancers from mice and rats demonstrate decreased levels of delta-aminolevulinic acid synthase, the rate-limiting enzyme in the heme synthetic pathway, and increased heme oxygenase, the heme-catabolizing enzyme. These findings suggest that diminution of P-450, b5, and catalase in these lesions may result from a heme supply that is limited by decreased heme synthesis and increased heme catabolism. Heme synthesis was measured in mouse liver tumors (MLT) and adjacent tumor-free lobes (BKG) by administering the radiolabeled heme precursors 55FeCl3 and [2-14C]glycine and subsequently extracting the heme for determination of specific activity. Despite reduced delta-aminolevulinic acid synthase activity in MLT, both tissues incorporated [2-14C]glycine into heme at similar rates. At early time points, heme extracted from MLT contained less 55Fe than that from BKG. This was attributed to the findings that MLT took up 55Fe at a slower rate than BKG and had larger iron stores than BKG. The amount of heme per milligram of protein was also similar in both tissues. These findings militate against the hypothesis that diminished hemoprotein levels in MLT result from limited availability of heme. It is probable, therefore, that decreased hemoprotein levels in hepatic tumors are linked to a general program of dedifferentiation associated with the cancer phenotype. Diminution of hemoprotein in MLT may result in a relatively increased intracellular heme pool. delta-Aminolevulinic acid synthase and heme oxygenase are, respectively, negatively and positively regulated by heme. Thus, their alteration in MLT may be due to the regulatory influences of the heme pool.     

原位肝移植治疗原发性肝癌６８例报告

目的：探讨原位肝移植在原发性肝癌治疗中的价值。方法：对６８例接受肝移植原发性肝癌病例进行回顾性分析,随访６个月以上,对术后患者存活情况进行分析。结果：６８例肝移植手术均获成功,无围手术期死亡,５４例存活至今,最长无瘤存活已达６５个月。小肝癌复发率为２.２％（１／４６）,大肝癌复发率为５４.５％（１２／２２）,其中肝内门脉分支有癌栓者复发率为６６.６％（４／６）,门脉主干有癌栓者为１００％（３/３）;小肝癌患者的存活时间显著长于大肝癌（Ｐ＝０.０００）。此外,肝癌肝移植术后及早停用类固醇激素,并维持抗排斥药物在较低的药物浓度也可能有助于减少肿瘤术后复发。结论：原位肝移植是治疗肝癌特别是小肝癌的有效手段,对于门静脉主干无癌栓的中晚期肝癌也能起到积极治疗作用。