大肠杆菌L—天门冬酰胺酶Ⅱ基因的高效表达

用一对与大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ基因两侧序列互补的寡核苷酸Ｅ１,Ｅ２６和引物,以大肠杆菌野生株ＣＰＵ２１０００９的染色体ＤＮＡ为模板,通过ＰＣＲ扩增得到约１．２ｋｂ的ＣＤＮＡ片段,将此片段插入ＰＫＫ２３３－２的ｔａｃ启动子下游,转化不同的大肠杆菌宿主菌株,结果表明以ＣＰＵ２１０００９为宿主菌时,转化子的酶表达量最高,重组Ｌ－天门冬酶胺酶占菌体总蛋白４８．３％,发酵液酶活力达４００ＩＵ／ｍｌ,比活为４     

EB病毒特异性DNA酶基因在大肠杆菌中的高效表达

含ＥＢ病毒特异性ＤＮＡ酶基因片段的大肠杆蓖受变温诱导后，其上清液在十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳时出现一条浓集带，分子质量大约为５２ｋｕ，符合ＥＢ病毒ＤＮＡ酶全基因编码蛋白质大小。     

壳聚糖修饰L-天门冬酰胺酶对酶活及抗原的影响

采用水溶性壳聚糖对L－天门冬酶胺酶进行化学修饰，修饰后的酶活回收率高达705，修饰酶的比活为每毫克蛋白质121.79U，pH值为7.4，更接近于人体血浆pH值(7.2-7.4），对底物的亲和力有所提高，稳定性增加，抗原性仅为自然酶的1／3，增加了临床使用的安全性。     

乙二胺羟丙基壳聚糖固定化天门冬酰胺酶的反应性质

研究了乙二胺羟丙基壳聚糖固定化L-天门冬酰胺酰反应动力学性能，分别考察了固定化酶耐胃蛋白酶性能，保存条件对固定化酶活力的影响，固定化酶的米氏常数Km以及固定化酶在缓冲液中间歇催化底物和连续催化底物的反应动力学性能，结果表明，在适当的间歇和连续反应条件下，固定化酶均具有良好的水解天门冬酰胺性能和效率。     

大肠杆菌L－天门冬酰胺酶的提取和纯化

大肠杆菌Ｌ－天门冬酰胺酶的提取和纯化刘景晶,金健勤,戴海滨,吴梧桐．药物生物技术,１９９５,２（１）：１６～１９大肠杆菌能产生两种Ｌ－天门冬酰胺酶,其中Ｌ－天门冬酰胺酶Ⅱ具有抗癌活性,以往对该酶的提取纯化常采用丙酮破碎细胞、有机溶剂反复分级沉淀的方法...     

大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ的基因克隆与表达

国产海龙科药用鱼类研究进展张朝晖，徐国钧，徐珞珊等．中国海洋药物，１９９５，１４（４）：２６对国产海龙科药用鱼类从分类学研究、药材资源研究、组织学研究、化学成分研究、药理作用研究等７个方面的进展进行综述，全文综述文献３１篇。国产海龙科药用鱼类研究进展...     

大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ的基因克隆与表达

大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ的基因克隆与表达李晶，刘景晶，吴梧桐等．药物生物技术，１９９５，２（４）：８用一对与大肠杆菌编码Ｌ－天门冬酰胺酶Ⅱ（Ｌ－ＡＳＰｓⅡ）的基因ａｎｓＢ两侧序列互补的寡核苷酸Ｌ１、Ｌ２作引物，以Ｌ－ＡＳＰｓⅡ的野生型生产菌ＣＰＵ２１０...     

壳聚糖固定L-天门冬酰胺酶的研究

研究了以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，固定化Ｌ－天门冬酰胺酶的最适条件，并对固定化天门冬酰胺酶的理化性质进行了初步探讨。分别从不同固定化程序、缓冲液及保护剂等方面进行了固定化天门冬酰胺酶的条件优化；固定化酶的活力回收可达２０％左右。固定化酶的最适范围变宽，由游离酶的最适ｐＨ＝４～６变为ｐＨ＝６～１０。连续使用６次后仍可基本维持固定化酶的活力。固定化酶对胃蛋白酶的水解性也较游离酶大大提高。     

Wnt信号通路抑制对急性白血病天门冬酰胺酶耐药性的影响

目的:探讨Wnt信号通路抑制对急性淋巴细胞白血病(ALL)天门冬酰胺酶(Asp)耐药性的影响。方法:人ALL细胞株THP-1分为对照组、Asp组与si-Wnt组,Asp组与si-Wnt组分别转染siRNA阴性对照与Wnt siRNA,转染后48 h,两组均加入Asp(终浓度为0.25μM),对照组只加生理盐水。MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期,Western-blot法检测蛋白表达水平。结果:Asp加药后24 h、48 h、72 h,si-Wnt组细胞增殖抑制率和细胞凋亡率均高于对照组和Asp组,且Asp组高于对照组(P<0.05)。Asp加药后72 h,si-Wnt组的G0/G1期细胞比例、Wnt及AKT蛋白表达均低于对照组与Asp组,Asp组低于对照组(P<0.05)。而si-Wnt组G2/M期细胞比例高于对照组与Asp组,且Asp组高于对照组(P<0.05)。结论:Wnt信号通路抑制可降低ALL细胞对Asp的耐药性,抑制AKT蛋白的表达,阻滞细胞周期,促进ALL细胞的凋亡,抑制其增殖。     

大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。     

大肠杆菌色氨酸酶基因的克隆与表达

应用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５中扩增出长约１．４Ｋｂ的色氨酸酶基因,将其插入高表达载体ｐＥＴ３ａ的ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ位点,转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）,构建高产色氨酸酶基因工程菌。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和薄层扫描表明,工程菌色氨酸酶的表达量占细胞总可溶性蛋白的６９．８％。酶活测定结果表明,７株工程菌色氨酸酶的活力比宿主菌均有不同程度的提高,其中ＷＷ－１１号比宿主菌高１６倍。     

L—门冬酰胺酶前体脂质体对小鼠毒性及对实验性肿瘤作用

目的：研究L－门冬酰胺酶（L－Asparaginase,L-A)前体脂质体（Proliposome,PL)[L-APL]iv对小鼠的毒性及对荷瘤小鼠的抗肿瘤活性。方法：以小鼠的急性毒性和外周血中白细胞数及血小板数为指标观察药物对小鼠的毒性及以荷瘤小鼠的瘤重和生命延和工率观察药物的抗肿瘤活性;结果：L－APL iV对小鼠的急性毒性与L－A相比明显降低,L－APL对正常小鼠外周血中白细胞数,血小板数无明显影响,而相同剂量L－A对小鼠外周血中白细胞数,血小板数明显降低。与对照组相比,L－APL和L－Aip可明显延长腹水型小鼠移瘤L1210,P388的存活天数,与同剂量L－A相比,L－APL高剂量有明显延长腹水型小鼠移植瘤的存活天数作用。L－APL及L－A ip对小鼠移植瘤Heps,EC实体型的肿瘤生长具有明显的抑制作用,两者抑瘤作用相近。结论：L－APL对小鼠的毒性明显小于相同剂量的L－A,L－APL不仅保持了L－A的抗肿瘤活性,而且有明显的增效作用。     

人钙调素基因Ⅲ表达载体的构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人ＣａＭ蛋白。方法：用ＰＣＲ方法获得人钙调素基因Ⅲ（ｈＣａＭⅢｃＤＮＡ），将其插入表达载体ｐＢＶ２００，构建重组表达质粒ｈＣａＭⅢ／ｐＢＶ２００，用酶切、ＤＮＡ测序、ＰＣＲ扩增鉴定阳性克隆。用ＣａＣｌ２法转化大肠杆菌ＤＨ５α使其表达ＣａＭ蛋白。结果：阳性重组子在大肠杆菌ＤＨ５α中经温度诱导可高效表达ＣａＭ蛋白，经１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可观察到一分子量与理论值相符（约１７０００）的诱导表达条带，其表达量占菌体蛋白总量的２０％。进一步分析表达产物的性质表明，ＣａＭ主要以可溶性形式表达。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果证实，１７０００的表达条带可与标准鼠抗ＣａＭＭｃＡｂ起特异反应。结论：重组人ＣａＭ在大肠杆菌中的成功表达，为进一步研究ＣａＭ的生物学功能及研制抗ＣａＭ单克隆抗体奠定了基础     

假单胞菌海因酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：构建海因酶基因工程菌,以便实现对羟在苯甘氨酸的工业化生产。方法：利用PCR技术从恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)9801中扩增得到海因酶基因,将该基因插入pMD18-T质粒,转化大肠杆菌（Bscherichia coli)通过地高辛标记原位杂交和海因酶活力测定两种方法,筛选出具有海因酶活力的阳性转化子。结果：工程菌E.coliBL21/pMD-dht的海因酶活力达到1700U/L,比野生菌恶臭假单胞9801菌的酶活力提高8倍。SDS-PAGE显示海因酶的单体分子量纸醉金迷为53KDa,海因酶的表达量约占菌体总可溶性蛋白的20%。结论：构建的海因酶基因工程菌已初步具有工业化应用价值。     

HIV—2env（gp120）基因在大肠杆菌中的表达

ＨＩＶ－２Ｅｎｖ蛋白（ｇｐ１２０）是病毒粒子吸附靶细胞膜上ＣＤ４受体的关键蛋白，ｇｐ１２０与ＣＤ４受体结合过程是ＨＩＶ感染机体的第一步。本文应用ＤＮＡ重组技术将ＨＩＶ－２ｅｎｖ（ｇｐ１２０）基因克隆到ｐＥＴ１７ｂ的Ｔ７启动子下游ＣｃｏＲＶ位点，构建成ｐＥＴ１７ｂ－ｇｐ１２０重组质粒，在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示在３５００（Ｍｒ）处有一特异蛋白带，表达量占菌体总蛋白的     

氨气敏电极终点速率法测定天门冬酰胺酶活

作者建立了测定天门冬酰胺酶活性的氨气敏电极终点速率法。探讨了温度、pH、时间对测定结果的影响,以及不同pH的洗涤液对氨气敏电极洗涤复位的速度差异。本法的测定下限为0.0167U/L天门冬酰胺酶,与Berthelot氨显色法的相关系数为0.995,回归系数为0.948,平均回收率为98.8％,批内误差为2.7％,批间误差3.2％。用酸性洗涤液洗涤氨气敏电极可将处理时间缩短到原来的的四分之一。     

人酸性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的高效表达及 …

用ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏＲ１双酶酶切经改造的ＰＵＣ－ａＦＧＦ质粒,获得了人酸性成纤维细胞生长因子（ｈａＦＧＦ）基因,将该基因片段插入表达载体ｐｄｄ２２３－３,筛选得到了重组质料,ｐｋｋ－ｈａＦＧＦ,加ＩＰＴＧ诱导该粒质转化的大肠杆菌ＪＭ１０９表达,ｈａＦＧＦ在发酵液中的表达水平约８９ｍｇ／Ｌ。用肝素亲和层析的方法,获得了电沪纯ｈａＦＧＦ样品。纯化过程中ｈａＦＧＦＧ活力回收率６５％。纯化ｈａＦＧＦ样品的     

酿酒酵母无机焦磷酸酶基因在大肠杆菌中的表达及其意义

目的：利用大肠杆菌表达酿酒酵母无机焦磷酸酶(Y-IPPA),获得具有活性的酿酒Y-IPPA。方法:以酿酒酵母基因组为模版,通过查询NCBI获得酿酒酵母无机焦磷酸酶序列,设计引物,用PCR方法获得酿酒Y-IPPA基因序列,插入克隆性载体pMD19-T Simple Vector中,并转化至大肠杆菌DH5α扩增,获得重组质粒,经酶切及测序验证正确后,将酶切的目的片段插入到原核表达载体p ET28(a)中,再转化大肠杆菌DH5α扩增,经酶切及测序验证正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达蛋白,通过IPTG诱导表达出Y-IPPA,以金属离子亲和层析蛋白纯化系统纯化蛋白,并测定其比活和酶学性质。结果：获得与pMD19-T Simple Vector一致的Y-IPPA碱基序列,构建了重组表达质粒pET28(a)-Y-IPPA,并转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导并进行SDS-PAGE电泳,在相对分子质量为32 000处可见Y-IPPA蛋白条带;镍柱亲和层析纯化目的蛋白,其中一组的蛋白浓度、活性和比活分别为0.312 g.L^-1、31.13 units.mL^-1和99.73 uints.mg^-1。结论:成功制备Y-IPPA蛋白,为进一步研究其酶学性质奠定了基础。     

人β2微球蛋白基因在大肠杆菌中的稳定、高效表达

目的应用基因工程技术表达人β2微球蛋白基因(β2m)。方法采用逆转录PCR技术,从Raji细胞株获得β2m的基因序列;将其与改建后的质粒pBV220连接,转染大肠杆菌BL21,经42℃诱导后,以SDS-PAGE鉴定阳性表达克隆,产物经过柱纯化。结果获得了编码成熟β2m的全长cDNA和高效、稳定表达人β2m的大肠杆菌克隆。结论成功地在大肠杆菌中获得了β2m基因的高效表达,为制备主要组织相容性复合体(MHC)-四聚复合物系统奠定了基础。     

Rv1196基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的 用PCR方法从结核菌基因组中扩增Rv1196基因,将之重组到pET24b载体,在大肠杆菌中进行融合表达,重组蛋白纯化后通过免疫印迹反应初步鉴定其抗原性和特异性.方法 提取H37Rv标准株的基因组DNA;设计Rv1196基因两端的引物,通过PCR方法从基因组DNA中扩增出Rv1196抗原的基因,直接连接到pGEMT载体上,经过筛选鉴定后,将重组子测序;将测序的质粒用NdeI和XhoI双酶切后连接到pET24b载体上,筛选得到重组载体pET24b-39;转化BL21并优化表达条件,采用金属鏊合层析纯化重组蛋白;选取7例结核病阳性临床血清标本和7例健康人血清标本进行Western blot分析.结果 获得了氨基酸编码序列正确的基因,与数据库中报道一致;Rv1196基因能够在大肠杆菌中高效表达,其表达量约占细菌总蛋白的30%以上;重组抗原不与健康人血清反应,但与结核标本血清呈强烈反应.结论 重组Rv1196抗原具有较好的特异性和抗原性,有较好的血清学分析价值.